Un flux Essai d'adhésion à étudier Leucocyte recrutement pour hépatiques humaines sinusoïdales endothélium dans des conditions de contrainte de cisaillement

Immunology and Infection
 

Summary

le recrutement de leucocytes dans le foie se produit dans les canaux spécialisés des sinusoïdes hépatiques qui sont bordées par des cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques uniques. Phase microscopie en contraste de recrutement de leucocytes à travers l'endothélium sinusoïdal hépatique humaine dans des conditions de stress de cisaillement physiologique peut faciliter l'élucidation des mécanismes moléculaires qui sous-tendent ce processus.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress. J. Vis. Exp. (85), e51330, doi:10.3791/51330 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Infiltration leucocytaire dans les tissus du foie humain est un processus commun à toutes les maladies inflammatoires du foie adultes. Infiltration chronique peut entraîner le développement de la fibrose et de la progression vers la cirrhose. La compréhension des mécanismes moléculaires qui interviennent dans le recrutement de leucocytes au niveau du foie pourrait identifier des cibles thérapeutiques importantes pour les maladies du foie. L'interaction clé lors du recrutement de leucocytes est celle des cellules inflammatoires avec endothélium dans des conditions de contrainte de cisaillement. Recrutement pour le foie survient dans les canaux à faible cisaillement des sinusoïdes hépatiques qui sont bordées par des cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques (SSEC). Les conditions dans les sinusoïdes hépatiques peuvent être récapitulées par perfusion leucocytes à travers des canaux bordés de monocouches SSEC humains à des débits spécifiques. Dans ces conditions, les leucocytes sont soumis à une étape d'attache bref suivi d'une activation et une adhésion ferme, suivie d'une étape ultérieure rampants et la transmigration à travers l'endothéliumcouche. En utilisant la microscopie à contraste de phase, chaque étape de ce 'adhérence cascade »peut être visualisé et enregistré suivie d'une analyse hors ligne. Des cellules endothéliales ou des leucocytes peuvent être prétraitées avec des inhibiteurs de déterminer le rôle de molécules spécifiques au cours de ce processus.

Introduction

Il est maintenant bien établi que le recrutement des leucocytes en général suit le paradigme de l'adhérence à plusieurs étages en cascade 1. Cela implique la capture des leucocytes à partir du sang circulant par les cellules endothéliales qui tapissent la paroi du vaisseau. Initialement, les leucocytes sont soumis à une étape de roulage qui est médiée par les récepteurs sélectine ou des membres de la superfamille des immunoglobulines. Cela permet à des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) exprimés à la surface des leucocytes pour être activé par les chimiokines présentées sur le glycocalyx endothéliale. Cela conduit à la modification de la confirmation de l'intégrine à un état «à forte affinité» sur la surface de leucocytes et l'adhérence ferme et l'arrêter à l'endothélium. Adhésion ferme est alors suivie par le changement de forme et exploration de l'leucocytes sur le navire. L'étape finale est la transmigration à travers la monocouche endothéliale, ce qui peut se produire par des voies d'paracellulaire ou transcellulaire.

Bien que l'adhérence cascade à plusieurs étapes décrivents le mécanisme général de recrutement de leucocytes dans le corps il ya des différences spécifiques d'organe. Dans le foie, la majorité du recrutement des leucocytes se produit dans les sinusoïdes hépatiques contrairement à d'autres organes où le recrutement se produit généralement dans les veinules post-capillaires 2. Les sinusoïdes hépatiques sont un environnement de faible cisaillement et leucocytes subissent une brève étape d'attache avant de raffermir l'adhésion qui est sélectine indépendant 2. Ces canaux sont bordés par l'endothélium sinusoïdal hépatique qui est discontinu et contient fenestrae, des pores ouverts de 100 à 200 nm de diamètre, et manquent d'une membrane basale 3. Élucider les mécanismes moléculaires qui interviennent dans le recrutement des leucocytes à travers l'endothélium sinusoïdal hépatique humain pourrait identifier organe cibles thérapeutiques spécifiques pour les maladies inflammatoires du foie.

tests d'adhésion de débit sont des outils essentiels dans l'étude du recrutement des leucocytes. Ils permettent la reconstruction de leucocytes recruitment en présence d'une contrainte de cisaillement pour analyser l'adhérence sous des forces bien définies. L'utilisation la plus fréquente pour l'analyse est l'étude adhésion des leucocytes à des monocouches endothéliales en culture ou des substrats purifiés. Disponibles dans le commerce chambres d'écoulement sont utilisés pour perfuser les cellules dans des conditions d'écoulement laminaire entre deux surfaces planes, et ensuite de visualiser le processus dynamique d'adhérence sur un microscope 4. Groupes précédents ont démontré que certaines interactions adhésives n'ont lieu que sous flux et ne peuvent pas être étudiés dans des essais statiques 5,6.

Nous avons utilisé cette technique pour récapituler les sinusoïdes hépatiques et étudier le recrutement des leucocytes dans des conditions de faible contrainte de cisaillement. SSEC humaine sont mises en culture primaire en microplaques et des leucocytes peut alors être perfusé sur cette monocouche à un débit d'écoulement calculé à reproduire la contrainte de cisaillement au sein de sinusoïdes hépatiques. La contrainte de cisaillement est une contrainte qui est appliquée en parallèle ou tangentielle à une surface comme oppOSED à contrainte normale qui est perpendiculaire. Tout liquide qui se déplace le long d'une frontière va exercer une contrainte de cisaillement sur cette frontière. La contrainte de cisaillement a été montré pour être une composante essentielle de lymphocytes transmigration 7. Dans ces conditions, chaque étape de la cascade d'adhérence peut être visualisée par microscopie à contraste de phase. Cette méthode a permis à des informations importantes sur le recrutement des leucocytes dans le foie, y compris l'étude des molécules d'adhérence classiques 8, le rôle des chimiokines et des récepteurs de chimiokines 9-11, et les molécules d'adhésion atypiques tels que l'adhérence vasculaire protein-1 (VAP-1 ) 8,12 et lymphatique commun et de l'endothélium vasculaire récepteur-1 (CLEVER-1) 13. Bien que cet essai a été mentionné dans plusieurs publications de notre groupe, sa description a été brève et nous avons profité de cette occasion pour fournir une étape détaillé par étape pour faciliter le dépannage et éviter les erreurs techniques lors de la tentativement le dosage. En outre, nous avons récemment changé l'approvisionnement en chambres de Microslide qui permet des modifications précises à la contrainte de cisaillement. Nous croyons que cette élargit l'applicabilité de l'analyse à d'autres cellules endothéliales et immunitaires. Le procédé suivant décrit la préparation et de la technique pour la réalisation d'une analyse de l'adhérence à base de flux avec des cellules endotheliales sinusoïdales hépatiques humains et des lymphocytes de sang périphérique.

Protocol

Une. Microslide Préparation

  1. Pré-revêtement d'une microplaque à six canaux avec la queue de rat de collagène de type I (RTC, dilué au 1:100 dans du PBS donnant une dilution de travail de 220 pg / ml). Ceci est réalisé en injectant 30 ul d'une solution diluée RTC directement dans les canaux et en incubant pendant 2 heures à 37 ° C, suivie de trois lavages avec du PBS.

2. Les cellules d'ensemencement en microplaques

  1. Dissocier un flacon T75 confluente de cellules hépatiques humaines cultivées sinusoïdales endothéliales (SSEC) (isolé à partir de tissu de foie comme décrit précédemment 13) dans de la trypsine-EDTA, les laver dans du PBS, et remettre en suspension à 3 x 10 6 cellules / ml dans du milieu complet (endothéliales humaines support de base supplémenté avec 2 mM de L-glutamine, 100 U / ml de pénicilline et de la streptomycine 100μg/ml, 10% de sérum AB humain inactivé à la chaleur, 10 ng / ml de facteur de croissance vasculaire endothéliale et de 10 ng / ml d'hépatocytes facteur de croissance). Injecter 30 ul de suspension cellulaire désastreusescte dans chaque canal.
  2. Laisser cellules d'adhérer pendant 1 h dans un incubateur humidifié à 37 ° C avec une atmosphère de CO 2 de 5% sur une grille coulissante. Après avoir laissé les cellules adhérer à remplir les orifices de chaque côté de chaque canal avec le milieu complet (figure 1).

3. Stimulation des cellules cytokine

  1. Laisser les cellules dans l'incubateur pendant 24 heures. Évaluer la croissance des cellules en utilisant un microscope à contraste de phase inversé. 24 heures avant l'essai d'adhérence, de stimuler les monocouches endotheliales avec des cytokines en remplaçant le milieu de croissance avec du milieu complet supplémenté en facteur de nécrose tumorale alpha et de l'interféron gamma, les deux à 10 ng / ml.

4. Isolement des lymphocytes du sang périphérique

  1. Isoler des lymphocytes du sang périphérique à partir de sang total en purifiant d'abord la fraction mononucléaire par centrifugation en gradient de densité sur un milieu de centrifugation de séparation de cellules approprié pendant 25 min à 800x g. Incuber les cellules de plastique pendant 1 heure pour permettre l'adhérence des monocytes.
  2. Après l'adhésion à aspirer plastique lymphocyte enrichi surnageant. Laver les lymphocytes et les remettre en suspension (typiquement de 1 x 10 6 cellules / ml dans un milieu d'écoulement (milieux de base endotheliales contenant 0,1% (v / v) d'albumine de sérum bovin (BSA)).

5. Prétraitement de l'endothélium ou leucocytes avec inhibiteurs

  1. Préparer des dilutions recommandées de la fonction de blocage des anticorps ou des inhibiteurs de petites molécules de l'endothélium media/0.1% (v / v) de BSA. Remplacer le milieu complet avec la solution de blocage anticorps / inhibiteur dans le canal de microplaque choisi 30 min avant de s'écouler dosage.
  2. Lorsque le prétraitement des récepteurs de chimiokines sur les lymphocytes sont prévues, remettre en suspension les leucocytes isolés dans une solution de RPMI contenant 0,1% (v / v) de BSA et incuber avec 200 ng / ml de la toxine coquelucheuse pour bloquer la protéine G activité de récepteur couplé à des récepteurs de chimiokines, en alternative diluer spécifique fonctiondes anticorps de blocage ou des inhibiteurs à petites molécules de récepteurs de chimiokine à la dilution recommandée. Incuber leucocytes à 37 ° C pendant 30 min, puis laver et remettre en suspension dans un milieu d'écoulement.

6. Configuration des flux de système de dosage

  1. Préchauffer une chambre transparente à commande thermostatique de 37 ° C. La chambre doit avoir des orifices pour l'insertion d'un tube de silicone et la fourniture électronique d'une électrovanne qui permet à commutation électronique entre les cellules et le milieu pratiquement sans volume mort. L'enceinte est montée sur un microscope inversé pour permettre la microscopie à contraste de phase. Figure 2 montre la chambre de dosage d'écoulement et le microscope et microlame placé sur la platine du microscope.
  2. Pré-remplir une seringue en verre de 50 ml avec un luer lock avec 10 ml d'eau distillée stérile et attacher une longueur de tube en silicone de 25 cm de l'orifice de la seringue. Insérer dans une pompe à seringue. Altérer le débit de la pompe de seringue de prélèvement selon lales instructions du fabricant de la microplaque pour maintenir une contrainte de cisaillement de 0,05 Pa (0,5 dyne / cm 2, figure 3).
  3. Prenez deux seringues de 5 ml, jeter les plongeurs et fixer les barils pour les deux ports de flux d'une électrovanne électronique en utilisant un tube de silicone.
    1. Attacher de 12 cm de tube de silicone à la soupape de sortie de flux. La valve permet l'alternance entre une connexion d'un tampon de lavage de cellules (endothéliales de media/0.1% (v / v) de BSA) et la suspension de lymphocytes.
    2. Rincer l'électrovanne électronique par l'insertion du tampon de lavage dans les deux corps de seringue et assurant tampon s'écoule d'un canon à travers la soupape et dans le tube de silicone de sortie de flux.
    3. Utiliser le commutateur de vanne à alternance à l'autre cylindre et d'assurer le tampon est fluide et que toutes les bulles sont éliminées du système. Retirez le tampon de lavage de l'un des barils et la remplacer par une suspension de lymphocytes figure 4a.
  4. Connectez le tubin de siliconeg à partir de la pompe à seringue à un orifice d'un canal de microplaque choisi par l'intermédiaire d'un adaptateur de microplaque. Ensuite, connecter le tube de silicone à partir de la soupape d'échappement opposée à l'orifice par l'intermédiaire d'un adaptateur de microplaque. Assurez-vous que le tube de silicone et les adaptateurs sont remplis avec du tampon de lavage avant la connexion pour empêcher les bulles d'air entrant dans le système (figure 4b).
  5. Une fois connecté au système d'écoulement, placer la microplaque sur la platine du microscope et fixer avec des agrafes ou de ruban adhésif pour empêcher le mouvement. Régler le microscope à l'objectif 10X avec le réglage de phase approprié. S'assurer que la monocouche endothéliale est visualisée et la mise au point en utilisant la lentille oculaire. S'assurer que les images peuvent être capturées par l'intermédiaire d'un appareil photo qui est fixé sur le microscope grâce à quoi les images peuvent être transmises à un écran et enregistrées.

7. Débit de dosage Technique et enregistrement de l'adhérence pour l'analyse

  1. Perfuser la couche endothéliale avec du tampon de lavage pendant 2 minutes en commençant withdrawal de la pompe de la seringue pour enlever les débris ou anticorps bloquant non lié, puis passer la vanne pour permettre à 5 min bolus de solution de leucocytes à une contrainte de cisaillement de paroi constante de 0,05 Pa.
  2. Pendant les 2 dernières minutes du bol de leucocytes, enregistrer 10 champs aléatoires le long de la longueur de la microplaque. Cela permet une analyse hors ligne des lymphocytes roulement / modem sur la monocouche endothéliale. Enregistrer chaque domaine pour environ 10 secondes avant de passer à la prochaine et veiller à ce que les enregistrements sont effectués sur le sens de l'écoulement pour éviter l'enregistrement deux fois de suite la même cellule de roulement.
  3. Suivre le bolus de leucocytes avec un bolus de 5 min de tampon de lavage par retour de la soupape à sa position de départ. Au cours de la 2 min finale de ce bolus effectuer une deuxième phase d'enregistrement en choisissant au moins 10 champs choisis au hasard le long de la longueur de la microplaque. Enregistrer chaque champ pendant environ 5 secondes avant de passer à la prochaine et veiller à ce que la monocouche endothéliale et leucoc adhérentytes sont en orientation claire. Ceci permet une analyse hors ligne du motif d'adhérence.

Representative Results

Ce dosage possède la capacité de visualiser l'adhérence de l'écoulement à plusieurs étages en cascade et d'élucider les mécanismes moléculaires sous-jacents en comparant les résultats des expériences de contrôle pour ceux avec des inhibiteurs moléculaires. Différents lits vasculaires peuvent être récapitulés en incorporant les cellules endothéliales spécifiques et modifiant les conditions de contrainte de cisaillement.

Chaque étape de la cascade d'adhérence peut être analysé en mode hors connexion en suivant le procédé d'enregistrement décrit dans le protocole. La première étape de la cascade d'adhérence est le roulement des leucocytes qui peuvent être exprimés en pourcentage du total des cellules adhérentes. Analyse hors ligne permet le nombre de cellules adhérentes à être énumérée dans chaque domaine enregistré au cours du bolus de leucocytes. La lecture de l'image permet la comparaison des cellules qui sont fermement adhérentes et celles qui sont en cours de un mouvement de roulement à travers l'endothélium. Mouvement de roulement peut être visualisée à l'aide de cette technique, chaque domaine est enregistré pendant au moins 10 secondes. Cellules de roulement sont identifiés par leur vitesse réduite sur la surface endothéliale par rapport aux cellules qui coule. Ce comportement doit être démontrée pendant au moins 5 secondes sans détachement. La cascade d'adhérence dans les sinusoïdes hépatiques a lieu dans un environnement à faible cisaillement et des études in vivo ont confirmé roulement minimal avec seulement une brève étape d'attache. Nous avons confirmé que l'essai d'écoulement reflète l'environnement des sinusoïdes hépatiques en démontrant que moins de 10% de leucocytes adhérents constamment stimulé rouler sur SSEC dans ces essais.

L'étape suivante de la cascade d'adhérence est adhésion ferme. Adhérence totale peut être calculée à partir de la deuxième étape de l'enregistrement pendant le bolus de tampon de lavage (étape 7.3). Analyse hors ligne permet le nombre total de cellules adhérentes fermement à être compté dans chaque domaine (figure 5). Cellules fermement adhérentes sont définies comme des cellules qui sont à l'arrêt ou shapechanged avec le comportement de ramper lentement.Le nombre moyen de cellules par champ peut alors être calculée. Cette figure peut alors être utilisée, en conjonction avec la surface totale du champ de vision (déterminé à l'aide d'un réticule ou équivalent), de la concentration des lymphocytes (typiquement 1 x 10 6 cellules / ml) et de la vitesse d'écoulement à exprimer l'étendue de l'adhésion des lymphocytes comme les cellules adhérentes / mm 2/10 6 cellules perfusé.

L'étude de la structure de l'adhésion implique l'analyse des deux dernières étapes de la cascade d'adhérence y compris le changement de forme, ramper et migration trans. Les leucocytes adhérents à la surface supérieure de la monocouche SSEC apparaissent phase lumineuse, tandis que ceux qui ont migré à travers la monocouche apparaissent phase d'obscurité (figure 6). Les cellules peuvent ensuite être classés comme présentant une adhérence «statique» (nonmigrated / tour), la morphologie «de forme changé» ou comme «migré» et les différentes catégories sont ensuite exprimés en pourcentage de lala population totale de l'adhésif.

Figure 1
Figure 1. Monocouche de cellules primaires humaines hépatiques sinusoïdales endothéliales dans la chambre d'écoulement. A) microplaques remplis de milieux contenant une monocouche de cellules endothéliales avant le début de l'écoulement adhérence dosage. B) de l'image à contraste de phase de confluence endothéliale monocouche, les cellules endotheliales doivent être ensemencées en microplaque qui ont été pré-revêtu (pour les cellules endotheliales hépatiques humaines cela devrait être avec Type de queue de rat de collagène 1) et il est essentiel que les cellules endothéliales sont en bonne santé dans la culture et confluentes. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 2 Figure 2. Couler chambre de dosage. Une chambre de dosage à écoulement set-up peut être vu ici, il est constitué d'une chambre transparente qui est montée sur un microscope inversé. Un dispositif de chauffage est placé dans la chambre et doit être contrôlé par thermostat pour maintenir une température de 37 ° C. Il devrait y avoir des ports disponibles pour connecter un tube de silicone à partir d'une microplaque à l'intérieur de la chambre à une pompe à seringue, qui est situé à l'extérieur. La microplaque est placé directement sur ​​la platine du microscope. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 3
Figure 3. Seringue pompe. Une pompe à seringue est connected silicone par l'intermédiaire d'un tube de la chambre d'écoulement. La pompe est réglée à un taux de retrait spécifique en fonction de la contrainte de cisaillement désiré requis pour le dosage. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 4
Figure 4. Raccordement de soupape à la chambre à circulation. A) Une électrovanne électronique permet la commutation entre les deux cylindres de seringue contenant soit des cellules ou des milieux avec pratiquement aucun espace mort. B) Une fois que la vanne est vidée et les deux barillets sont mis en place, le tube de silicone à partir de la soupape est reliée à la chambre d'écoulement. Il est essentiel que lors de la connexion de l'adaptateur sur le tube de silicone à l'orifice de la chambre de circulation, il ya une interface liquide / liquide. <a href = "http://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target = "_blank"> Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 5
Figure 5. Mesure de l'adhérence leucocytaire totale. Pendant les deux dernières minutes de l'étape de bolus de tampon de lavage (tel que décrit dans le protocole), un minimum de dix champs aléatoires doit être enregistré. Ceux-ci peuvent être analysées hors ligne et le nombre total de cellules fermement adhérentes peuvent être comptés dans chaque champ. Adhérence totale de leucocytes peut être comparé entre les chambres de contrôle et ceux prétraitée avec des anticorps bloquants, nous montrons ici un champ représentatif d'un tiroir de commande et un coulisseau prétraitée avec adhérence intracellulaire molécule-1 (ICAM-1) un anticorps bloquant. Les flèches ont été ajoutés pour mettre en évidence les leucocytes adhérents, dans la représentationTive domaine de la lame de contrôle, il ya un total de 25 leucocytes identifié et dans le bloc coulissant ICAM-1, il ya un total de 13 leucocytes identifié. Barres d'échelle = 100 um. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 6
Figure 6. L'analyse de la tendance de l'adhésion des leucocytes sur des monocouches endotheliales par microscopie à contraste de phase. Analyse hors ligne des champs enregistrés peut également être utilisé pour étudier la direction et la vitesse de l'adhésion des leucocytes. Les étapes spécifiques de la cascade d'adhérence peuvent être visualisées et quantifiées en utilisant l'imagerie par contraste de phase. Phase cellules lumineuses qui sont fermement adhérente mais pas activé peuvent être qualifiées adhésion «rondes», les cellules qui sont activated et la phase lumineuse peuvent être qualifiées de «forme changé» et les cellules qui sont phase sombre sont les cellules qui ont subi migration trans et peuvent être appelés «migré». L'image montre des exemples de chaque motif d'adhérence. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Discussion

L'étape la plus critique pour effectuer avec succès un essai de flux fait en sorte que d'une monocouche confluente en bonne santé et de cellules endothéliales est prêt avant l'essai d'adhérence de l'écoulement. Cellules endothéliales primaires peut être difficile à la culture et sensible aux modifications dans les méthodes de culture. Il est important que 1) chambres d'écoulement sont suffisamment et uniformément revêtues de cellules endothéliales en monocouche, par SSEC nous utilisons rat de type queue de collagène de type I, mais cela peut varier pour d'autres populations endothéliales, 2) milieu de culture est approprié pour le type de cellule, pour SSEC nous avons décrit notre milieu complet dans la section de protocole. Autres étapes essentielles comprennent réglage de la pompe de la seringue au taux approprié de tenir compte des niveaux physiologiques de la contrainte de cisaillement.

Au cours de l'essai d'écoulement, il est nécessaire d'empêcher les bulles d'air dans le circuit d'écoulement qui peut endommager la monocouche endothéliale ou bandes cellules immunitaires de la surface de l'endothélium. Ceci peut être évité par enRANTISSANT que tous les tubes de silicone et adaptateurs sont perfusées avec le tampon de lavage avant la connexion, que toutes les bulles d'air sont éliminées et que les médias sont préchauffé avant utilisation. Lors de la connexion des adaptateurs pour les ports de la microplaque, il est très important qu'il y ait une interface liquide / liquide lors de la connexion, s'il ya un air alors ce sera de former un espace d'air dans le système qui va perturber la monocouche endothéliale lors du retrait de la seringue étape. La solution de leucocytes dans le corps de la seringue doit agitation régulière pour s'assurer que les cellules ne se déposent pas, maintenant ainsi une densité de cellules constant tout au long de l'expérience.

Au cours des étapes d'enregistrement, il est important de veiller à l'image de la couche endothéliale est correctement centré et claire pour permettre une analyse hors ligne exacte, et que lors de la deuxième étape de l'essai de débit (poste leucocytes d'un bolus) que suffisamment de temps est laissé pendant le tampon de lavage la phase avant l'enregistrement est repris à veiller à ce quetous les leucocytes non adhérentes sont éliminées. De même, il est essentiel d'utiliser des cellules endothéliales dans une monocouche de densité appropriée pour éviter la perte de cellules qui peuvent interférer avec des motifs d'écoulement dans les capillaires étroits et peut également être difficile de discriminer à partir de leucocytes de moins grandes adhérentes microscopie à contraste de phase. Nous avons décrit la densité de semis optimale pour les cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques humains mais cela peut varier entre les différentes populations endothéliales et des espèces.

Des progrès significatifs ont été accomplis dans l'étude du recrutement des leucocytes dans des modèles animaux de la microscopie intravitale. L'avantage majeur de la méthode de l'essai d'adhérence de l'écoulement est que le recrutement de leucocytes peut être étudiée dans un système binaire avec des cellules endotheliales humaines primaires. En outre, ces interactions peuvent être étudiées sous les niveaux pertinents physiologiques du stress de cisaillement. Il est important de confirmer les résultats des études chez l'animal avec intravitale systèmes cellulaires humains comme il peut y avoir differences dans les propriétés endothéliales entre les espèces. L'une des limites de l'analyse d'écoulement, c'est que le recrutement de leucocytes est étudiée dans un environnement unicellulaire de la monocouche endothéliale. En outre, une fois les leucocytes ont adhéré et transmigré à travers l'endothélium ils ne peuvent pas être présents dans suffisamment de numéros à être isolées et soumises à des procédés en aval.

En dépit de ces limitations, une fois que le test d'adhésion d'écoulement a été maîtrisé il peut être mis au point pour effectuer une analyse plus approfondie de la cascade d'adhérence leucocytaire et adapté pour récapituler un environnement multicellulaire. Enregistrement prolongé de champs simples et l'utilisation de logiciels de suivi peut être utilisé pour analyser le comportement rampant des leucocytes. De plus lors de l'achèvement de l'essai d'écoulement des microplaques peuvent être interrogés à l'aide microscopie à balayage laser confocal et marquage immunofluorescent pour étudier l'adhérence et la transmigration de manière plus détaillée. De plus, nous avons précédemment élaborered un modèle in vitro, où les leucocytes circulant pourraient interagir avec l'endothélium hépatique conditionnée par la présence d'hépatocytes. Ce test peut également être développé pour étudier les sous-populations de leucocytes: notre groupe a effectué des études de sous-ensembles, tels que des cellules régulatrices T, cellules B, et le foie infiltration des leucocytes.

Ces études sont la preuve que le test d'adhésion de flux est un outil puissant pour étudier le recrutement de leucocytes spécifique générale et organes dans les systèmes humains.

Disclosures

Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents

Acknowledgments

SS est financé par une bourse de recherche clinique Wellcome Trust intermédiaire, CW par une affectation spéciale du Programme Wellcome.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Six channel microslide VI 0.4 flow chamber  Ibidi 80601 Other channel size and precoated slides are available depending on assay requirements.
Flow adaptors  microslide VI 0.4 Ibidi 80646
Flow assay chamber Solent Scientific 33-3322 These chambers are custom made by the company dpending on the model of microscope and accessories. 
Inverted Microscope IX2 Olympus, UK Model IX50
Harvard Syringe Pump Harvard Apparatus, UK 702101
Electronic solenoid valve Lee Products Limited, UK Part Number LFYA1226032H
Silicon Tubing large Fisher Scientific FB50855 2 mm inner diameter, 4 mm outer diameter
Silicone Tubing-small Fisher Scientific FB50853 1 mm inner diameter, 3 mm outer diameter
Harvard Glass Syringe Harvard Apparatus, UK 55-0962
Cell separation medium/Lympholyte VH Bio CL-5020
Rat Tail Collagen Sigma Aldrich C3867-1VL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
  2. Wong, J., et al. A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature. Clin. Invest. 2782-2790 (1997).
  3. Braet, F., Wisse, E. Structural and functional aspects of liver sinusoidal endothelial cell fenestrae: a review. Compar. Hepatol. 1, 1 (2002).
  4. Lawrence, M. B., Springer, T. A. Leukocytes roll on a selectin at physiologic flow rates: distinction from and prerequisite for adhesion through integrins. Cell. 65, 859-873 (1991).
  5. Finger, E. B., et al. Adhesion through L-selectin requires a threshold hydrodynamic shear. Nature. 379, 266-269 (1996).
  6. Lawrence, M. B., Kansas, G. S., Kunkel, E. J., Ley, K. Threshold levels of fluid shear promote leukocyte adhesion through selectins (CD62L,P,E). J. Cell biol. 136, 717-727 (1997).
  7. Cinamon, G., Shinder, V., Alon, R. Shear forces promote lymphocyte migration across vascular endothelium bearing apical chemokines. Nat. Immunol. 2, 515-522 (2001).
  8. Lalor, P. F., et al. Vascular adhesion protein-1 mediates adhesion and transmigration of lymphocytes on human hepatic endothelial cells. J. Immunol. 169, 983-992 (2002).
  9. Aspinall, A. I., et al. CX(3)CR1 and vascular adhesion protein-1-dependent recruitment of CD16(+) monocytes across human liver sinusoidal endothelium. Hepatology. 51, 2030-2039 (2010).
  10. Curbishley, S. M., Eksteen, B., Gladue, R. P., Lalor, P., Adams, D. H. CXCR 3 activation promotes lymphocyte transendothelial migration across human hepatic endothelium under fluid flow. Am. J. Pathol. 167, 887-899 (2005).
  11. Oo, Y. H., et al. Distinct roles for CCR4 and CXCR3 in the recruitment and positioning of regulatory T cells in the inflamed human liver. J. Immunol. 184, 2886-2898 (2010).
  12. Weston, C. J., Shepherd, E. L., Adams, D. H. Cellular localization and trafficking of vascular adhesion protein-1 as revealed by an N-terminal GFP fusion protein. J. Neural Transm. (2013).
  13. Shetty, S., et al. Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium. J. Immunol. 186, 4147-4155 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics