Isolamento de células-tronco cancerosas em amostras de câncer de próstata humano

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Summary

O isolamento de células-tronco cancerosas (CSCs) diretamente a partir de tecidos humanos é requisito para a sua caracterização biológica. Este manuscrito descreve uma metodologia para o isolamento de CSCs próstata de tecidos humanos, além de fornecer dicas sobre solução de problemas etapas difíceis.

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Vidal, S. J., Quinn, S. A., de la Iglesia-Vicente, J., Bonal, D. M., Rodriguez-Bravo, V., Firpo-Betancourt, A., Cordon-Cardo, C., Domingo-Domenech, J. Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples. J. Vis. Exp. (85), e51332, doi:10.3791/51332 (2014).

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Abstract

O modelo de células-tronco do câncer (CSC) tem sido revisitado consideravelmente ao longo das últimas duas décadas. Durante este tempo os CSCs foram identificados e isolado directamente a partir de tecidos humanos e em série propagados em ratinhos imunodeficientes, normalmente por meio de marcação de anticorpos de subpopulações de células e de fraccionamento, por citometria de fluxo. No entanto, as características únicas clínicos de cancro da próstata tem limitado consideravelmente o estudo das CSCs da próstata a partir de amostras de tumores humanos frescos. Recentemente, referiram o isolamento de CSCs próstata directamente a partir de tecidos humanos, em virtude da sua classe I HLA fenótipo (HLAI)-negativo. Células de câncer de próstata são colhidas a partir de espécimes cirúrgicos e dissociados mecanicamente. A suspensão de células é gerada e marcada com anticorpos HLAI e estromais conjugados fluorescentes. As subpopulações de células HLAI-negativos são finalmente isolados utilizando um citómetro de fluxo. A principal limitação deste protocolo é a natureza muitas vezes microscópica e multifocal decâncer primário em espécimes de prostatectomia. No entanto, isolados CSCs próstata ao vivo são adequados para a caracterização molecular e validação funcional por transplante em ratos imunodeficientes.

Introduction

Heterogeneidade intratumoral é considerado uma indicação do cancro 1. De facto, vários mecanismos de heterogeneidade intratumoral foram descritas, incluindo a mutação genética e interacções com o microambiente. Além disso, alguns tipos de cancro podem conter uma hierarquia celular com uma sub-população de células estaminais de cancro (CSCs) que exibe as propriedades de capacidade de iniciação do tumor e de auto-renovação em ensaios de transplante em série 2-5. Inicialmente descrito em hematológica 6, 7 de mama, cérebro e 8 malignidades, CSCs também têm sido estudadas em cancro da próstata 9-12, bem como outros tipos de tumor de 2-5.

CSCs são geralmente considerados uma fracção celular dentro de uma população heterogénea de 2-5. Portanto, a caracterização funcional e molecular de CSCs depende seu enriquecimento de populações em massa. Assim, durante as últimas duas décadas vários conheceuhodologies de CSC enriquecimento foram concebidas que normalmente envolvem a separação de populações marcados por citometria de fluxo. Além disso, uma consideração importante no estudo da CSCs é que a organização hierárquica de tecidos humanos pode ser interrompido por meio de manipulações experimentais, tais como passagens em série em cultura ou imunodeficientes ratinhos. Como resultado, o isolamento directo de CSCs de tecidos humanos tem emergido como uma importante metodologia no campo CSC.

O câncer de próstata é uma das principais causas de morbidade e mortalidade nos Estados Unidos e ao redor do mundo 13 de câncer. Assim, o isolamento e caracterização biológica da CSCs próstata é de interesse significativo. CSCs próstata tenham sido previamente enriquecido a partir de linhagens de células derivadas de pacientes, xenotransplantes e baixa passagem pacientes provenientes de culturas em suspensão 9,10,12,14.

Recentemente, relatou o isolamento de CSCs próstata diretamente de s cirúrgicos humanosplos em virtude de sua HLAI negativo da superfície celular fenótipo 10. Aqui detalhamos os procedimentos implementados para o isolamento dessas células. Tumores da próstata são colhidas a partir de amostras cirúrgicas e feito em suspensões de células. As células são depois coradas utilizando anticorpos contra HLAI assim como marcadores estromais e de viabilidade, e CSCs são isoladas por separação de células activadas por fluorescência (FACS). Isolado CSCs podem então ser utilizadas para ensaios que exigem células viáveis.

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Protocol

1. Colheita e Processamento de tecido de câncer de próstata humano de espécimes cirúrgicos

  1. Preparar dois tubos cónicos de 50 ml de poliestireno que contêm 15 ml de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina.
  2. Pessoal de serviço de Patologia colher amostras primários e metastáticos de câncer de próstata de prostatectomia e cirurgia paliativa espécimes, respectivamente, no âmbito de um Conselho de Revisão Institucional protocolo aprovado. Amostras metastáticos podem ser obtidos a partir de dissecações nódulos linfáticos durante a cirurgia primária, as vértebras durante procedimentos cirúrgicos paliativas, tais como descompressão medular, e os pulmões durante a remoção de diagnóstico de lesões metastáticas individuais, entre outros.
    1. Colher grandes quantidades de tecido em excesso não é necessário para diagnósticos clínicos para o primeiro tubo de 50 ml de poliestireno cónica a partir do passo 1.1 e imediatamente armazenar a 4 ° C. O colhidatecido d deve medir pelo menos um 4-5 cm 2 de área e 1-2 cm de espessura.
  3. O pessoal do laboratório processar grandes quantidades de tecido obtido a partir do serviço de patologia em preparação para exame histológico e a geração de células em suspensão.
    1. Processamento de tecidos em massa não deve exceder 24 horas de ressecção cirúrgica, a fim de garantir a viabilidade celular máxima.
    2. Trabalhando em uma cabine de segurança biológica com um bisturi e pinças estéreis, tome 2-4 mm cortes de tecido horizontais grossas de nódulos tumorais macroscópicos. Imediatamente armazenar as seções no segundo 50 ml tubo cônico de poliestireno do passo 1.1.
    3. Quando nódulos macroscópicos não são visualizados a partir de amostras de prostatectomia, recolher aleatórios 2-4 mm cortes de tecido horizontais grossas dos lobos posteriores e zona de transição.
  4. Separe uma parte do tecido cirúrgico utilizando um bisturi e pinças estéreis e fixá-lo em formol a 10% antes de gênerosção de suspensões de células. Arquivo e analisar esta histologicamente o material para confirmar a presença de tecido de câncer de próstata.

2. Geração de suspensões de células a partir de tecido secções

  1. Trabalhando numa câmara de biossegurança estéril, transferir uma parte do tecido para um prato de 60 mm x 15 cultura contendo 1 mL de 1x tampão fosfato salino estéril (PBS).
    1. Mecanicamente triturar a amostra usando um bisturi e pinças estéreis.
    2. Não digestões enzimáticas são neste protocolo.
  2. Transferir a suspensão de 1 ml em uma estéril tubo de 50 ml.
    1. Adicionar 1 ml para o prato de cultura e repetir a etapa de trituração, até a secção de tecido é completamente dissociada, geralmente de 3 a 4 vezes.
    2. Repita este procedimento até que todos os serialmente cortes de tecidos foram dissociados.
  3. Ressuspender o conteúdo do tubo de 50 ml de poliestireno cónica com 5 ml de pi serológicoPette e vortex a velocidade máxima (aproximadamente 3200 rpm) durante 1 min.
  4. Filtrar a suspensão resultante através de um filtro de células de 35 mícrons e recolher num segundo tubo de 50 ml estéril cónico poliestireno.
  5. Gerar uma pelete por centrifugação a 450 xg durante 10 min.
  6. Rejeitar o sobrenadante, ressuspender o sedimento com 5 ml de tampão de lise de glóbulos vermelhos, e incubar a solução durante 5 min à TA. Remover o tampão de lise de glóbulos vermelhos por centrifugação durante 5 min a 450 xg à temperatura ambiente.
  7. Rejeitar o sobrenadante, ressuspender o sedimento em 1x PBS suplementado com 5% de FBS, e quantificar o número de células viáveis ​​(azul de tripano-negativo), utilizando um hemocitómetro ou contador de células automatizado. Gerar um 1x10 6 células / ml suspensão e armazená-lo no gelo para não mais do que 1 hora.
    1. A viabilidade ea produção de células pode variar consideravelmente entre as amostras tumorais. No cenário prostatectomia, a viabilidade pode variar entre 45-70%, e five 2-4 mm de secções de tecido horizontais grossas de um nódulo de tumor macroscópico pode ser esperado para produzir cerca de 3x10 6 células viáveis.

3. Anticorpo de coloração de células de FACS

  1. Identifique cinco 15 ml de poliestireno tubos cônicos como mostrado abaixo. Use CD45 e CD31 de marcação pelo antígeno para excluir hematopoiéticas e elementos endoteliais, respectivamente.
    1. Imaculado
    2. IgG 2a κ-PE + IgG 1 κ-FITC
    3. HLAI-PE + IgG 1 κ-FITC
    4. IgG 2a κ-PE + CD31 + CD45-FITC-FITC
    5. HLAI-PE + CD45 + CD31-FITC-FITC
  2. Distribuir a suspensão celular quantificada a partir da secção anterior (passo 2.7) em cinco tubos na etapa 3.1. Adicionar os anticorpos, a uma diluição de 1:250, e incuba-se as suspensões de células sobre gelo durante 30 min.
  3. Centrifugar as células a 450 xg durante 3 minutos a 4 ° C, e descartar os sobrenadantes. Lave as células por ressuspensão cada pellet com 1x PBS estéril suplementado com 10% de FBS, seguido por centrifugação a 450 xg durante 3 minutos a 4 ° C.
  4. Ressuspender as células em uma solução de 1 ml de 1x PBS contendo 4 ',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI), a uma concentração de 10 ug / ml.
  5. Filtrar a solução final através de 35 tampas de coador ^ M em 12 milímetros x 75 mm tubos de poliestireno.

4. Isolamento da próstata CSCs por FACS

  1. Utilize um citômetro de fluxo para separação de células.
  2. Definir os controles de compensação usando células de tubos # 1, # 2, # 3 e # 4.
  3. Criar portões que excluem detritos e aglomerados de células usando parâmetros para a frente e de lado de dispersão.
  4. Estabelecer os FITC e PE portas usando as suspensões de tubo n º 3 e n º 4 do tubo, respectivamente.
  5. Células (DAPI-negativo) Portão viáveis ​​utilizando o Pacific Blue-A do canal.
  6. Usando tubo n º 5 de descarte de células CD31-positivas e CD45-positivas erecolher ambas as populações HLAI-negativas e HLAI-positivos em tubos de poliestireno de 15 ml cónicos estéreis contendo 2 ml de meio RPMI suplementado com 10% de FBS.
  7. Centrifugar a suspensões de células classificadas em 450 xg durante 5 min, e depois voltar a suspender as pelotas em 200-500 mL de meio RPMI suplementado com 10% de FBS.
  8. Quantificar as células viáveis ​​(Trypan Blue-negativo) utilizando um hemocitômetro ou contador de células automatizado.

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Representative Results

Figura 1
Figura 1. Próstata humana colheita tumor de câncer e citometria de fluxo enredo ilustrando populações específicas de um câncer de próstata humano. (A) nódulos tumorais são colhidas para gerar uma suspensão celular. Teor de tumor da amostra processada é confirmada usando hematoxilina e eosina convencional. (B) Células coradas positivamente para DAPI são excluídas para isolar apenas as células viáveis. (C) portão HLAI negativo é criado com base em células marcadas com anticorpos IgG controlo isotópico 1 κ-FITC e IgG 2a κ-PE. A porcentagem de células HLAI negativos e HLAI positivos são mostrados no portão. Clique aquipara ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Este protocolo descreve o isolamento das CSCs de fresco tecidos de cancro da próstata humano. Várias considerações importantes influenciam o sucesso deste protocolo.

A recuperação de um elevado número de células cancerosas da próstata viáveis ​​depende de avaliação cuidadosa bruta de amostras cirúrgicas. Em nossa experiência, o isolamento de células prostáticas tumorais é melhor assegurada quando nódulos tumorais macroscópicas são observados e tratados 10.

No entanto, hoje em dia a doença primária derivada de espécimes de prostatectomia é freqüentemente multifocal e microscópica. Nestes casos, quando possível o processamento da amostra devem ser informados pelo resultado da biópsia clínicos anteriores, a fim de aumentar a possibilidade de células de câncer de próstata de colheita. Na nossa experiência, é necessário que o pessoal de laboratório bem treinado para executar o protocolo de frequência, a fim de garantir o isolamento bem sucedido de CSCs próstata de multamostras de prostatectomia clínicos iple.

Além disso, uma vez que aqui descrevemos um protocolo que envolve a expressão de selecção negativa HLAI superfície celular, é importante para remover contaminantes potencialmente elementos HLAI-negativas a partir das suspensões de células de cancro da próstata tratados por FACS. Em particular, a utilização de tampão de lise de glóbulos vermelhos do sangue e a omissão de células não viáveis ​​por coloração com DAPI são considerações importantes. Embora estas medidas não podem garantir que as células cancerosas nonprostate não contaminar a população HLAI negativo, nossos estudos diluição limitante anteriores sugerem que CSCs próstata são, no entanto, de forma eficiente enriquecido neste compartimento 10.

Por fim, o isolamento de células vivas permite a caracterização funcional, por exemplo a sua capacidade de iniciar eficientemente xenoenxertos em ratinhos imunocomprometidos, entre outros. Estudos moleculares, incluindo perfis de expressão, também são realizáveis.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pela Fundação Hariri Família e da Fundação TJ Martell.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI Gibco Life Technologies 11875-093
Fetal bovine serum Gibco Life Technologies 10437-028
Penicillin Streptomycin Gibco Life Technologies 15140-122
PBS Corning Cell Gro 21-031-CM
60 mm, 15 mm Cell culture dish Corning 3295
35 µm Cell Strainer BD Falcon 352340
50 ml conical tube Crystalgen 23-2263
15 ml conical tube Crystalgen 23-2265
Red blood cell lysing buffer Sigma R7757
HLA class I (W6/32) PE antibody Abcam ab43545
CD31 FITC antibody eBioscience 11-0319-42
CD45 FITC antibody Abcam ab27287
IgG2aκ PE antibody BD Pharminogen 555574
IgG1κ FITC antibody BD Pharminogen 551954
DAPI Invitrogen d3571
12 mm x 75 mm Polystyrene tubes with cell strainer cap BD Falcon 352235
Vortex Mixer Crystalgen CG-BV1000
10% Neutral Buffer Formalin Fisher RBBP-0480

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References

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