Isolering af kræft stamceller fra humane Prostata Cancer Prøver

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Isoleringen af ​​kræft stamceller (CSCS) direkte fra humane væv er nødvendige for deres biologiske karakterisering. Dette håndskrift beskriver en metode til isolering af prostata CSCs fra humane væv, og samtidig give tips om fejlfinding vanskelige skridt.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Vidal, S. J., Quinn, S. A., de la Iglesia-Vicente, J., Bonal, D. M., Rodriguez-Bravo, V., Firpo-Betancourt, A., Cordon-Cardo, C., Domingo-Domenech, J. Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples. J. Vis. Exp. (85), e51332, doi:10.3791/51332 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Den kræft stamceller (CSC) model er blevet betydeligt revisited løbet af de sidste to årtier. I løbet af denne tid er blevet identificeret CSCs og direkte isoleret fra humane væv og serielt opformeret i immunsvækkede mus, typisk gennem antistof mærkning af subpopulationer af celler og fraktionering ved flowcytometri. Imidlertid har de unikke kliniske træk ved prostatakræft betydeligt begrænset undersøgelse af prostata CSCs fra friske humane tumorprøver. Vi har for nylig rapporteret isolering af prostata CSCs direkte fra humane væv i kraft af deres HLA klasse I (HLAI)-negative fænotype. Prostata cancer celler høstes fra kirurgiske prøver og mekanisk dissocieret. En celle suspension genereres og mærket med fluorescens konjugerede HLAI og stromale antistoffer. Subpopulationer af HLAI-negative celler er endelig isoleres under anvendelse af et flowcytometer. Den grundlæggende begrænsning af denne protokol er den ofte mikroskopiske og multifokal karakterprimær kræft i prostatektomi prøver. Ikke desto mindre, isolerede levende prostata CSCs er velegnede til molekylær karakterisering og funktionel validering af transplantation i immunsvækkede mus.

Introduction

Intratumoral heterogenitet anses for at være kendetegnende for kræft 1. Faktisk har flere mekanismer intratumoral heterogenitet er blevet beskrevet, herunder genetisk mutation og interaktioner med mikromiljø. Desuden kan nogle kræftformer indeholde et cellulært hierarki med en delpopulation af cancer stamceller (CSCS), der udviser egenskaberne for tumor-initierende kapacitet og selv-fornyelse i serietransplantation assays 2-5. I første omgang er beskrevet i hæmatologiske 6, bryst 7 og hjerne 8 maligne lidelser, er CSCs også blevet undersøgt i prostatakræft 9-12 samt andre tumortyper 2-5.

CSCs er generelt betragtes som en cellulær fraktion i en heterogen population 2-5. Derfor er det funktionelle og molekylær karakterisering af CSCs er betinget af deres berigelse fra bulk befolkninger. Følgelig løbet af de sidste to årtier adskillige opfyldthodologies CSC berigelse er blevet udtænkt som typisk indebærer adskillelse af mærkede befolkninger ved flowcytometri. Derudover er en væsentlig overvejelse i studiet af CSCs er, at den hierarkiske organisering af humane væv kan forstyrres af eksperimentelle manipulationer såsom seriepassage i kultur eller immunsvækkede mus. Som følge heraf er den direkte isolering af CSCs fra humane væv opstået som en vigtig metode i CSC feltet.

Prostatakræft er en førende årsag til kræft sygelighed og dødelighed i USA og rundt om i verden 13.. Derfor er isolationen og biologisk karakterisering af prostata CSCs er af væsentlig interesse. Prostata CSCs er tidligere blevet beriget fra cellelinjer, patient afledte xenotransplantater og lavpassage patient afledt suspensionskulturer 9,10,12,14.

Vi har for nylig rapporteret isolering af prostata CSCs direkte fra humane kirurgiske ssempler i kraft af deres HLAI-negative celle overflade fænotype 10. Her har vi detaljeret de procedurer, til isolering af disse celler. Prostatatumorer høstes fra kirurgiske prøver og gjort til cellesuspensioner. Cellerne farves derefter ved hjælp af antistoffer mod HLAI samt stromale og levedygtighed markører, og CSCs isoleres ved fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS). Isolerede CSCs kan derefter anvendes til assays, der kræver levende celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Høst og behandling af menneskelige prostatakræft Tissue fra kirurgisk prøvemateriale

  1. Forbered to 50 ml polystyren koniske rør indeholdende 15 ml af Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 dyrkningsmedium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin.
  2. Patologi servicepersonale høste primære og metastatisk prostatacancer prøver fra prostatektomi og palliativ kirurgi prøver, henholdsvis under en Institutional Review Board godkendte protokol. Kan fås metastatiske prøver fra lymfeknuder dissektioner i primær kirurgi, ryghvirvler i palliative kirurgiske procedurer, såsom rygmarven dekompression og lungerne under diagnostisk fjernelse af enlige metastaser, blandt andre.
    1. Harvest overskydende løs væv ikke nødvendig for klinisk diagnostik i de første 50 ml polystyren konisk rør fra trin 1.1 og opbevares straks ved 4 ° C. Den harvested væv skal måle mindst 4-5 cm 2 i areal og 1-2 cm i tykkelse.
  3. Laboratoriepersonalet behandle hovedparten væv opnået fra patologi tjeneste som forberedelse til histologisk undersøgelse og generering af cellesuspensioner.
    1. Behandling af bulk væv bør ikke overstige 24 timer fra kirurgisk resektion for at sikre maksimal cellelevedygtighed.
    2. Arbejde i et biosikkerhed kabinet med en steril skalpel og pincet, tage 2-4 mm tykke vandrette vævssnit fra makroskopiske tumor knuder. Umiddelbart gemme sektionerne i den anden 50 ml polystyren konisk rør fra trin 1.1.
    3. Når makroskopiske knuder er ikke visualiseret fra prostatektomi prøver, indsamle tilfældige 2-4 mm tykke vandrette vævssnit fra den bageste lapper og overgangszonen.
  4. Adskille en del af den kirurgiske væv ved hjælp af en steril skalpel og pincet og ordne det i 10% formalin før slægtertion af cellesuspensioner. Arkiv og analysere dette materiale histologisk at bekræfte tilstedeværelsen af ​​prostatakræft væv.

2. Generering af cellesuspensioner fra vævssnit

  1. Arbejde i en steril biosikkerhed kabinet, overføre et vævssnit til en 60 x 15 mm dyrkningsskål indeholdende 1 ml steril 1X phosphatpufret saltopløsning (PBS).
    1. Mekanisk tritureres prøve ved anvendelse af en steril skalpel og pincet.
    2. Ingen enzymatiske spaltninger er i denne protokol.
  2. Overfør 1 ml suspension i en steril 50 ml konisk rør.
    1. Tilsæt 1 ml til dyrkningsskålen og gentag triturering trin, indtil vævssnittet er helt adskilt, sædvanligvis 3-4x.
    2. Gentag denne procedure serielt, indtil alle vævssnit er dissocieret.
  3. Resuspender indholdet af 50 ml polystyren konisk rør med en 5 ml serologisk piPette og vortex ved maksimal hastighed (ca. 3.200 rpm) i 1 min.
  4. Filtrer den resulterende suspension gennem et 35 um cellefilter og anbring i en anden steril 50 ml polystyren konisk rør.
  5. Generere en pellet ved centrifugering ved 450 xg i 10 min.
  6. Supernatanten fjernes, pellet resuspenderes med 5 ml røde blodlegemer lysepuffer og inkuberes opløsningen i 5 minutter ved stuetemperatur. Fjern de røde blodlegemer lysepuffer ved centrifugering i 5 minutter ved 450 xg ved stuetemperatur.
  7. Supernatanten fjernes, pellet resuspenderes i 1x PBS suppleret med 5% FBS, og kvantificere antallet af levedygtige (trypan blå-negative) celler under anvendelse af et hæmocytometer eller automatisk celletæller. Generer en 1x10 6 celler / ml suspension og gemme den på is i længere end 1 time.
    1. Levedygtighed og udbytte af celler kan variere betragteligt mellem tumor prøver. I prostatektomi indstillingen kan levedygtighed på mellem 45-70%, og five 2-4 mm tykke vandrette vævssnit fra en makroskopisk tumor nodule kan forventes at give ca 3x10 6 levedygtige celler.

3. Antistoffarvning af Celler til FACS

  1. Mærk fem 15 ml polystyren koniske rør som vist nedenfor. Brug CD45 og CD31 antigenet mærkning for at udelukke hæmatopoietisk og endotel elementer, hhv.
    1. Uplettet
    2. IgG2a κ-PE + IgG1 κ-FITC
    3. HLAI-PE + IgG1 κ-FITC
    4. IgG2a κ-PE + CD31-FITC + CD45-FITC
    5. HLAI-PE + CD45-FITC + CD31-FITC
  2. Fordel kvantificeret cellesuspensionen fra det foregående afsnit (trin 2.7) i de fem rør i trin 3.1. Tilsæt antistoffer ved en fortynding på 1:250, og inkuber cellesuspensionerne på is i 30 minutter.
  3. Centrifuger cellerne ved 450 x g i 3 minutter ved 4 ° C og kasseres supernatanter. Vask cellerne ved at resuspendere hver pellet med sterilt 1x PBS suppleret med 10% FBS efterfulgt af centrifugering ved 450 x g i 3 minutter ved 4 ° C.
  4. Resuspender cellerne i en 1 ml opløsning af 1x PBS indeholdende 4 ',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) i en koncentration på 10 ug / ml.
  5. Filtreres den endelige løsning gennem 35 um si hætter i 12 mm x 75 mm polystyrenrør.

4.. Isolering af prostata CSCs ved FACS

  1. Anvende et flowcytometer til cellesortering.
  2. Indstil kontrol Erstatning Brug celler fra rør nr. 1, nr. 2, nr. 3, og nr. 4.
  3. Opret porte, der udelukker snavs og klynger af celler ved hjælp af frem-og side-scatter parametre.
  4. Etablere FITC og PE porte ved hjælp af suspensioner fra rør # 3 og rør nr. 4, hhv.
  5. Gate levedygtige (DAPI-negative) celler ved hjælp af Pacific Blue-En kanal.
  6. Brug rør # 5 udsmid CD31-positive og CD45-positive celler ogindsamle både HLAI-negative og HLAI-positive befolkninger i sterile 15 ml polystyren koniske rør indeholdende 2 ml RPMI suppleret med 10% FBS.
  7. Centrifuger sorteret cellesuspensioner ved 450 x g i 5 minutter, og derefter resuspenderes pellets i 200-500 ul RPMI suppleret med 10% FBS.
  8. Kvantificere levedygtige (trypan blå-negative) celler under anvendelse af et hæmocytometer eller automatisk celletæller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1
Figur 1. Human prostatakræft tumor høst og flowcytometri plot illustrerer specifikke populationer fra en human prostatacancer. (A) Tumor knuder høstes for at generere en cellesuspension. Tumor indhold af den forarbejdede prøve bekræftes ved hjælp af konventionelle hematoxylin og eosin-farvning. (B) Celler farves positivt for DAPI er udelukket at isolere kun levedygtige celler. (C) HLAI-negative gate er skabt baseret på celler farvet med kontrol isotypiske IgG 1 κ-FITC og IgG 2a κ-PE-antistoffer. Procentdelen af HLAI-negative og HLAI-positive celler er vist i porten. Klik herfor at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol beskriver isoleringen af ​​CSCs fra friske humane prostata cancer væv. Flere vigtige overvejelser påvirke det vellykkede resultat af denne protokol.

Genopretningen af ​​høje antal af levedygtige prostatacancerceller er afhængig af omhyggelig brutto vurdering af kirurgiske prøver. Det er vores erfaring, er den vellykkede isolering af tumorigene prostata celler bedst sikret, når makroskopiske tumorknuder observeres og behandles 10.

Men i dag primære sygdom stammer fra prostatektomi prøver er ofte multifokale og mikroskopisk. I disse tilfælde når det er muligt prøve behandling bør informeres ved tidligere kliniske biopsi resultater med henblik på at øge chancen for at høste prostatacancerceller. Det er vores erfaring, er det nødvendigt for veluddannede laboratorie personale til at udføre protokollen ofte for at sikre en vellykket isolering af prostata CSCs fra multiple kliniske prostatektomi prøver.

Derudover, da vi beskriver her en negativ udvælgelse protokol involverer celleoverfladen HLAI udtryk, er det vigtigt at fjerne potentielt forurenende HLAI-negative elementer fra prostatacancercellelinjerne suspensioner forarbejdet ved FACS. Især anvendelsen af ​​røde blodlegemer lysisbuffer og udeladelsen af ​​levedygtige celler ved DAPI-farvning er væsentlige overvejelser. Selv om disse foranstaltninger ikke kan garantere for, at nonprostate kræftceller ikke forurener HLAI-negative befolkning, vores tidligere begrænsende udvanding undersøgelser tyder på, at prostata CSCs alligevel effektivt beriget i dette rum 10..

Endelig isolering af levende celler muliggør deres funktionelle karakterisering, fx deres evne til effektivt at igangsætte xenografter i immunkompromitterede mus, blandt andre. Molekylære undersøgelser, herunder udtryk profilering, er også opnåelige.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Hariri Family Foundation og TJ Martell Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI Gibco Life Technologies 11875-093
Fetal bovine serum Gibco Life Technologies 10437-028
Penicillin Streptomycin Gibco Life Technologies 15140-122
PBS Corning Cell Gro 21-031-CM
60 mm, 15 mm Cell culture dish Corning 3295
35 µm Cell Strainer BD Falcon 352340
50 ml conical tube Crystalgen 23-2263
15 ml conical tube Crystalgen 23-2265
Red blood cell lysing buffer Sigma R7757
HLA class I (W6/32) PE antibody Abcam ab43545
CD31 FITC antibody eBioscience 11-0319-42
CD45 FITC antibody Abcam ab27287
IgG2aκ PE antibody BD Pharminogen 555574
IgG1κ FITC antibody BD Pharminogen 551954
DAPI Invitrogen d3571
12 mm x 75 mm Polystyrene tubes with cell strainer cap BD Falcon 352235
Vortex Mixer Crystalgen CG-BV1000
10% Neutral Buffer Formalin Fisher RBBP-0480

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  2. Magee, J. A., Piskounova, E., Morrison, S. J. Cancer stem cells: impact, heterogeneity, and uncertainty. Cancer Cell. 21, 283-296 (2012).
  3. Nguyen, L. V., Vanner, R., Dirks, P., Eaves, C. J. Cancer stem cells: an evolving concept. Nat. Rev. Cancer. 12, 133-143 (2012).
  4. Valent, P., et al. Cancer stem cell definitions and terminology: the devil is in the details. Nat. Rev. Cancer. 12, 767-775 (2012).
  5. Visvader, J. E., Lindeman, G. J. Cancer stem cells: current status and evolving complexities. Cell Stem Cell. 10, 717-728 (2012).
  6. Lapidot, T., et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367, 645-648 (1994).
  7. Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 3983-3988 (2003).
  8. Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
  9. Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells. Cancer Res. 65, 10946-10951 (2005).
  10. Domingo-Domenech, J., et al. Suppression of acquired docetaxel resistance in prostate cancer through depletion of notch- and hedgehog-dependent tumor-initiating cells. Cancer Cell. 22, 373-388 (2012).
  11. Patrawala, L., Calhoun-Davis, T., Schneider-Broussard, R., Tang, D. G. Hierarchical organization of prostate cancer cells in xenograft tumors: the CD44+alpha2beta1+ cell population is enriched in tumor-initiating cells. Cancer Res. 67, 6796-6805 (2007).
  12. Qin, J., et al. The PSA(-/lo) prostate cancer cell population harbors self-renewing long-term tumor-propagating cells that resist castration. Cell Stem Cell. 10, 556-569 (2012).
  13. Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. Cancer statistics, 2013. CA Cancer J. Clin. 63, 11-30 (2013).
  14. Patrawala, L., et al. Highly purified CD44+ prostate cancer cells from xenograft human tumors are enriched in tumorigenic and metastatic progenitor cells. Oncogene. 25, 1696-1708 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics