コンセンサス脳由来のタンパク質、2D-DIGEとミニ2DEイムノ両方を使用して、ヒトおよびマウスの脳プロテオーム研究のための抽出プロトコール

Neuroscience

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Summary

人間とマウスの脳組織のために尿素/チオ尿素/ SDS緩衝液を使用した一般的なタンパク質抽出プロトコルを可能にする2D-DIGEとミニ2DEのイムノブロット法によるそれに続くキャラクタライゼーションによるタンパク質のINDENTIFICATION。この方法は、人間の生検および実験モデルから、より再現性と信頼性の高い結果を得るために1を可能にします。

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Fernandez-Gomez, F. J., Jumeau, F., Derisbourg, M., Burnouf, S., Tran, H., Eddarkaoui, S., Obriot, H., Dutoit-Lefevre, V., Deramecourt, V., Mitchell, V., Lefranc, D., Hamdane, M., Blum, D., Buée, L., Buée-Scherrer, V., Sergeant, N. Consensus Brain-derived Protein, Extraction Protocol for the Study of Human and Murine Brain Proteome Using Both 2D-DIGE and Mini 2DE Immunoblotting. J. Vis. Exp. (86), e51339, doi:10.3791/51339 (2014).

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Abstract

二次元ゲル電気泳動(2DE)は潜在的に異なる生理学的または病理学的状態に関連するプロテオームの変更を明らかに強力なツールです。基本的に、この技術は、第一工程におけるそれらの等電点に係るタンパク質の分離に基づいており、そして第二SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によってそれらの分子量に記載の方法。本報告書では、ヒトの死後、マウス脳組織の少量のための最適化されたサンプル調製プロトコルが記述されている。この方法は、両方の二次元蛍光差ゲル電気泳動(2D-DIGE)とミニ2DEイムノブロッティングを行うことが可能となる。これらのアプローチの組み合わせは、一質量分析検出との相溶性にそれらの発現のおかげで、新しいタンパク質および/またはタンパク質修飾を見つけることができるだけでなく、またマーカーの検証への新しい洞察。このように、ミニ2DEポストを特定し、検証するために、ウェスタンブロッティングを許可に結合された翻訳の修正、蛋白異化と異なる条件および/または処理間の定性的な比較を提供します。ここで、我々は、ADなど、アミロイドβペプチドとα-シヌクレインなどのレビー小体型認知症に見られるタンパク質凝集体の成分を研究するための方法を提供する。我々の方法は、このようプロテオームの解析のために適合させることができ、不溶性タンパク質もヒト脳組織およびマウスモデルから抽出する。並行して、それは、神経変性疾患、ならびに潜在的な新規バイオマーカーおよび治療標的に関与する分子および細胞経路の研究に有用な情報を提供することができる。

Introduction

精神的、神経学的障害は、病気の世界的な負担の13パーセントを表し、病態生理学的メカニズム、リスク要因と前駆症状のバイオマーカーのような新たな課題は、1を模索しなければならない。この目的に沿ったもので、人間の脳のプロテオミクス研究は、生理学的のためだけでなく、病理学的状態のためだけでなく、メモリ、行動、感情やインスタンスの神経可塑性のようなプロセスに関与する分子経路を明らかにすることが不可欠になる。従って、動物モデルの使用、より具体的にはトランスジェニックマウスは、ヒト神経変性障害の病因2を模倣する可能性の広い範囲をもたらす。

プロテオミクスアプローチは神経科学分野では、これらの新しい視点を達成するために、現在では利用可能です。二次元ゲル電気泳動(2DE)は、広範囲の試料のプロテオームを比較することができ、強力かつ簡単な方法である可能性が高い。また、も識別し、さらに質量分析によって分析するために複雑な混合物からタンパク質を単離するための強力な方法。 (IEF)を等電点電気泳動による等電点(pI)に係る1)タンパク質分離:この技術は、本質的に2つの連続するステップからなる。より正確には、電位がpH勾配の中でイモビアクリルアミドストリップに印加され、次いでタンパク質は、それらのグローバルネット電荷の関数に移動し、決定されたpIに焦点を当てる。 2)等電集束タンパク質が変性しており、それによって負にその第1の構造体中のタンパク質をSDS-PAGE 3によってそれらの見かけの分子量(MW)に応じて分離され、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)の添加によってチャージされる。これら二つの異なる性質は、私たちはプロテオームの研究では、さらに行くためにdoub​​le値に対処することができます。一方で、このアプローチは、最小限の染料2D-DIGE法を用いて定量分析を実行するために可能性を提供し、一方qualitativウェスタンブロッティングに結合されたミニ2DEによるE分析。

2D-DIGEによる定量分析は、タンパク質の発現は、すべてのサンプルプロテオーム的に変化授ける。簡潔には、サンプルは三つの異なる波長(青、緑、赤)で発光する3シアニン(Cy 2を表し、Cy3およびCy5)で標識される。 N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル基を含有するこれらのフッ素最小限の染料は、共有結合、アミド結合4で得られたタンパク質のリジン残基のε-アミノ基と反応する。リジン残基は、タンパク質および主要なネットチャージ修正5,6ごとに複数のラベルの追加を防ぐ唯一の1〜3%、したがって、ラベルが付いています。 Cy3およびCy5は、多くの場合、Cy2は、比較したサンプルの同じ割合の組み合わせをタグしながら、2の独立したサンプルを標識するために使用される。 2つの主な利点は、全ての標識されたサンプルが混合され、IEFおよびSDS-PAGEの比較をゲル化するため、実験間のばらつきを回避する間、ステップごとに一度に1つのゲル中で行われていることである。また、タンパク質7の約1フェムトモルの高い検出閾値を示す。ゲルを走査し、2次元ソフトウェアがCy2と質量分析によるそれらの後方同定のためのスポットのうち統計的差異の同定を可能にする内部標準としての2Dゲルの蛍光画像を比較している。内部標準を用いて二次元解析ソフトウェアは、統計的信頼8の95%以上を有するサンプル間の差の10%未満の迅速な検出を達成する。

ミニ2DEによる定性分析は、タンパク質の特性評価のための重要なステップである。原理は、以前のpI及びMW分離のために記載したのと同じであるが、この場合、タンパク質は、膜およびイムノブロッティングに小さなポリアクリルアミドゲルから転送され、その後実行される。一次元ゲル電気泳動は、抗体の機能における1つまたはいくつかのタンパク質のエピトープのためのタンパク質発現の変化、情報技術を提供するがミニ2DEのNは、2つの追加パラメータを指定して賦与。まず、タンパク質isovariantsは、翻訳後修飾が起こる可能性があることを示す、pIはの関数として変化する。第二に、質量分析同定は、もっともらしいチモーゲン及びタンパク質の異化生成物を示すことができる。従って、2D-DIGEによって観察修飾は、グローバルプロテオームプロフィールの変化のメカニズムを示す可能性がある。同じタンパク質のエピトープのためのいくつかのサンプル間のイムノブロットのアライメント/ミニ2DEによるSはやや一次元免疫ブロッティング9、10で観測されたりしない翻訳後の変化に光を流して酸味の変更を反映することができる。さらに、この分析は、代謝残基11,12のPIとMWの知識に起因する潜在的な切断部位について通知します。

これら2つの技術の組み合わせは、相補的なプロテオミクス分析を提供する。一方では、2D-DIGEは、標準をもたらす表情は異なりますポリペプチドの正確な分離を可能差異のE。これらの違いは、スポットや蛍光ゲルのソフトウェア解析によって指定された1の強度の増加/減少の表示または非表示に本質的になる。しかし、それ自体でこれらの観​​察は、観察修飾の性質を説明する可能性は低い。の等変/アイソフォームレベルの変化:ポリペプチドを単離し、質量分析により同定されると、これらの理由から、ミニ2DEの使用は)正確に1を確認するために、単離されたタンパク質のアイデンティティと差の2)自然を可能にします例えば、発現、翻訳後修飾および切断プロセス。しかし、それは非常に似ていない抽出プロトコールの使用から生じる潜在的な分散体を制限するために2D-DIGEと、ミニ2DEと互換性両方の出発溶解緩衝液を開発する必要がある。

本稿では、デヒトおよびマウスの組織から来る脳タンパク質の2D-DIGEとミニ2DE技術の準備、抽出、性能に適合したプロトコルをスクライビング。

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Protocol

1。均質化およびヒトおよびマウス脳組織からの全タンパク質の抽出

  1. 脳組織の均質化。 (ヒトサンプルについて)、ポッターガラスまたはマウス(サンプルの)テフロンホモジナイザーを用いて脳組織を10%(w / v)の8 M尿素、2 Mチオ尿素およびw / vのSDS緩衝液(UTS)を1%均質化する。全組織の崩壊13、14のための0.5秒を適用する超音波発生器と60 Hzの30パルスで超音波処理。
    1. 標準としてBSAを使用して、Bradfordアッセイでタンパク質濃度を決定します。これは、バッファ抽出限り溶解物が過熱カルバミル15を避けてはならないように1次元のSDS-PAGEと完全に互換性がありますUTS。
    2. アンバーの(w / v)の1%を加え、室温で10分の間に穏やかに混合しながらインキュベートする。その後、0.22μmのシリンジフィルターにフィルター処理し、最終的に尿素/チオ尿素溶液にSDSを加える。このステップは、equilibrである尿酸およびイソシアン酸の量を低減溶液中の尿素でIUMとその分解を促進する。
  2. クロロホルム/メタノールタンパク質沈殿。 11センチメートルIPGストリップのための蛋白質の100〜150μgの18センチのもの(独立IEFを実行するために選択されたpH範囲での)のために1〜1.5ミリグラムの間で沈殿させる。
    1. 氷上または4℃で、すべての手順を実行します。沈殿手順を開始する前に30分間、4℃でクール、クロロホルムとメタノール。
    2. UTS溶解物の1の体積にメタノールとクロロホルムの1の体積の3ボリュームを追加します。手動での混合物を振ると冷水の3ボリュームを追加します。 1分間の4℃で30分間、12,000×gでの遠心分離によってタンパク質をペレット渦
    3. パスツールピペットを用いて上清を捨て、冷MeOHの3ボリュームを追加します。再びボルテックスし、4℃で30分間12,000 xgで遠心最終的に上澄み液を廃棄し、N 2下でペレットを乾燥させます。
  3. 二次元分析のためのタンパク質の調製。2D-バッファー(8 M尿素、4%CHAPSを補充した2 Mチオ尿素)中のタンパク質 - 乾燥ペレットを再懸濁する。上に示したようにアンバーライトで溶液を洗浄し、2D-DIGE用2Dバッファー200μl当たりタンパク質500μgの割合を維持しようとします。注:2Dバッファは-80℃で保存するか、または(尿素分解を防ぐために)一週間の間4℃に保つことができる。
    1. 超音波処理とは、次の工程を実施するまで-80℃でサンプルを格納します。注目すべきは、このプロトコルは、タンパク質凝集体10のギ酸可溶化して使用することができる。簡単に言うと、N 2下でギ酸を蒸発させて説明したようにペレットを再懸濁。

(2)2D-DIGE

  1. サンプルテスト品質。投与量は、試料を再びブラッドフォード法を用いて。 、LDSサンプル緩衝液中のタンパク質15μgのを希釈し、37℃で加熱し、15〜12%ポリアクリルアミドゲル上にロードする。
  2. クマシー染色。 0.1%ポリアクリルアミドゲルを染色(w / v)のクーマブルーG-250は、少なくとも1時間、50%エタノール及び10%(v / v)の酢酸溶液。背景が7%酢酸および10%(v / v)エタノール溶液中で一晩脱色しましょう​​。
  3. サンプルの前の電気泳動ラベル。シアニン色素標識を実行する前に、N-ヒドロキシスクシン置換が塩基性pHでより効率的であり、pH 8.6において最適であることが指定されて以来、基本的な、あるいは中性であるべき試料のpHを確認する。
    1. 50μgのprotein/400 pmolの色素の比率を最小限にCy3またはCy5蛍光色素を用いた研究の2サンプルにラベルを付け、非プロトン化アミンとシアニンのNHSエステルの反応基を容易にするために、暗闇の中で、4℃で1時間保つリジンのグループ。
    2. 特にシアニンに1サンプルの優先的な結合を回避し、Cy3およびCy5色素でクロスラベルを作るサンプル変動を低減。シアニン色素標識は、最小限の広報は1μgの比率を維持しながら、タンパク質の少量に適合させることができることに留意されたい8 pmolのシアニン色素につきotein。その場合、ミニ2DEシステムが代わりに大きな2Dゲルシステムを用いることもできる。これは脳組織の少量のための2D-DIGE解析が可能になります。
    3. Cy2は蛍光色素で同量のタンパク質(計50μg)を用いて、両方のサンプルのプールを標識し、内部標準として用いられる。先に示したのと同じ条件を使用してください。
    4. 1.1%のDestreak試薬、IPGバッファーの1.2%とフェノールブルー標識されたタンパク質の合計150μgの(Cy2と50μgの、Cy2との50のCy3のおよび50μg)の痕跡を含む2次元のバッファーで、総容量350μLへの完全な。 4の独立したストリップを使用して四重に、この手順を実行します。また、分取ゲル用タンパク質の350〜450μgの2の追加の非標識ストリップ(各サンプルの1)を準備します。
    5. 受動的な再水和のための鉱物油を一晩で覆わ6ロードされたストリップを残す。
  4. 等電点電気泳動法。 20でIEFを実施6。C. pHは3-11NLの場合は、18センチメートルは、プロトコルを削除されています:最大電流設定は8段階で50μA/ストリップである:1)、150Vで1時間ステップ、2)200 Vの5時間、3)500 Vのグラデーションのステップのために2時間後、24,000 Vの計2時間、2時間、5)2000 Vの勾配、2時間6)4000 Vの勾配、2時間および8用7)8,000 Vの勾配)のため4)千Vの勾配·時間ステップ。 IEF後、クロマトグラフィーペーパーを用いて鉱物油を過剰に派遣し、二次元目まで-20℃でストリップを格納する。
  5. IPGは平衡を取り除きます。同じ緩衝液中の4.7%ヨードアセトアミドではなくDTTなしに6 M尿素、2%SDS、30%グリセロール、50mMのトリス-HCl、15分間のDTT、1%の緩衝液中で8.6とした後、ストリップを平衡化する。
  6. 二次元またはSDS-PAGE電気泳動。 6〜12%SDS-PAGEゲル(1.5 Mトリス-HCl、8.6、12%アクリルアミド/ビスアクリルアミド、0.1%(w / v)のSDS 0.072%(w / v)のAPSおよび0.1%(v / v)を作るTEMED )STRIための4つの低蛍光ガラス板と、大きな2Dシステムを使用して同時にタンパク質スポットを切除するために、分取ゲルについての厚さの1.5ミリメートルの蛍光サンプルと他の二つのガラス板とPS。
    1. (w / v)アガロース0.5%でゲルの上に層状の上に6 IPGストリップをロードします。ランニング緩衝液は25mMトリス、192mMグリシンおよび0.1%(w / v)のSDSで構成されている。 4℃で16,17に設定された冷凍システムを用いて一晩2.5 W /ゲルで泳動を行う。
  7. 蛍光画像の取得と分析。蛍光ゲル画像(一つの実験のための12のイメージ)を得るために台風9400スキャナーを使用してください。スキャンCy2は、520分の488ナノメートル、580分の532 nmおよび670分の630 nmの励起/発光波長は、それぞれの各ゲルのためのCy3およびCy5のイメージ。画像を分析するインフォマティクスソフトウェアを使用してください。データは、研究2試料間の4のゲル間での信号の分配に関連するスポット量の変化を表している。
  8. 大きなゲルについてクマシー染色。 5で分取ゲルを修正0%(v / v)のエタノールおよび3%、少なくとも24時間(v / v)のオルトリン酸溶液。次いで後、20分間超純水で2回洗浄する。クマシーブルーG-250(w / v)の0.1%を添加する前に34%で着色1時間(v / v)のメタノール、17%(w / v)の硫酸アンモニウムおよび2%オルトリン酸を実行する。少なくとも48時間、着色がゲルを維持し、超純水で脱色。
    1. MS同定のためのスポット。蛍光画像を解析されると、ソフトウェアが表現統計的に差があるスポットのリストを提供します。手動で取ゲルからこれらのスポットを切り出す。この手順では、ケラチン汚染を回避するために実際に、いくつかの手先の器用さを必要とする。次いで、サンプルを、MSに送信するまで-20℃で水中に保つことができる。スポットの同定は、タンデム質量分析(MS / MS)と完全に互換性があり、タンパク質アイデンティティの関連性は、0.05に(p <0.05)18のp値が計算された確率もとのMowseスコアに従って判定される。
    2. </ OL>

    3。定性的ミニ2DEアッセイ

    1. 11センチメートルIPGストリップのための最終容量200μlまでの2Dバッファにタンパク質試料の最大1​​00μgの再懸濁する。過剰発現系または精製されたタンパク質の場合、開始量は20μgのに下げることができる。
    2. 200μlの最終容量まで(v / v)のDestreak試薬、0.55%(v / v)のIPG緩衝液およびブロモフェノールブルー、微量の1.1%を加える。その後、渦は、高速スピンをして、一晩鉱物油で覆われた(元の厚さにストリップをもたらすために)パッシブ再水和のためにIPGストリップにロードします。注:IPG緩衝液の割合は、(pHが3-11、4-7、7-11、等)の所望のpHのすべての区間について同じであるが、その組成物は、選択されたpH範囲の関数として変化する。
    3. Isoelectrofocalisation。 20℃でIEFを実行プログラムの期間は、選択されたpH間隔に依存します。注目すべきは、このような電気浸透は、IEFプロファイルを乱す可能性があるこれらの場合のパラメータ、electrofocalisation時間の最適化が19必要です。注:それは必ずしも良い結果を提供しますが、IEFの時間を短縮することも解像度を向上させることができ、より長いIEFではありません。 IEFの後、IPGストリップをヶ月間-20℃で保存することができる。
    4. IPGは平衡を取り除きます。 25mMのトリス-HCl、pH6.8、20mMのDTT、10%グリセロール、5%SDS、0.05%ブロモフェノールブルーを含有する緩衝液中でストリップを平衡化する。 3平衡は、各浴との間の緩衝液を変えて15分間浸す作る。
    5. SDS-PAGE。目的のタンパク質の分子量に応じて選択アクリルアミドの割合がプレキャストゲル(IPG 1だけでなく、11センチメートルIPGストリップ)にIPGストリップレイヤ。その後、33分の間に100 mVでニトロセルロース/ PVDF膜上にゲルをブロット。
    6. 必要な抗体を用いて一晩インキュベートし、ペルオキシダーゼ活性により可視化する。二次抗体によって明らかに無関係なポリペプチドを用いてイムノブロットのアライメントを行う。半quantitリーチImageJのソフトウェアを使用してトレース/スポットのボリュームと強度のデンシトメトリー分析をative。

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Representative Results

理想的な緩衝液は、タンパク質の100%、特に膜結合又は細胞骨格タンパク質を回収するために存在しないので、脳組織に対するプロテオミクスは依然として厳しい。実験の最初のセットは、タンパク質の大きなパネルを回復することができますつのアプローチと互換性の適切な溶解バッファーの検索に焦点を当てた。したがって、3つの溶解緩衝液は、最も適切なものを決定するためにアッセイした。第一に、それは1%の10mM(w / v)のSDS(図1A)に共通の生化学および分子生物学のトリス-HCl緩衝液20を用いた。さらに、トリス-HClポリアクリルアミドおよびアガロースゲル電気泳動のためのバッファとして堅牢なアプリケーションを有している。他の2の溶解バッファは、UTS(図1B)と2DE 1だった。トリス-SDS高いスポット分離、無distorsionとFA UTSで観察したプロファイルと比較した(図1B)悪い解像度が得られるし、スポットの数が大幅に低下したrは良好タンパク質の回収(図1B)が観察された。この点は、トリス塩酸がベンチ遠心分離後の厚い1をUTSの抽出収率はほとんど残存ペレットを負っているのに対し、という事実によってサポートされています。パターンは明確なトリス塩酸などの他のバッファについてのUTSでの高いタンパク質の溶解性の証拠を提供します。図1(b)に示した。それさえ2DEバッファもテストしたNotheworthy、その使用は、ペレットにもかかわらず、以来、除外されたがいずれも、観測されなかった脂質を溶解させていなかったし、彼らは、操作をdifficulting上層に残った。これらのデータと一致して、それは、アミノ酸残基間nonconvalentとイオン結合を破壊し、21 2)また細胞タンパク質を分解するプロテアーゼの活性を回避することによってタンパク質を変性1)その中立カオトロープいくつかの理由でUTSバッファの使用を推奨している尿素溶液にチオ尿素を大幅に疎水性の膜タンパク質の溶解度を高めるおよび22,23およびSDSは、脂質が疎水性相互作用を介してタンパク質に結合壊し、ならびにプロテアーゼおよびホスファターゼ活性の阻害24,25を増加させる陰イオン界面活性剤の3)の付加を凝集しやすいタンパク質である。さらにそれは、IEFを混乱させる可能性impuretiesを除去するために沈殿工程を追加することにした。このように、として沈殿法26とメタノールを既に脳組織に豊富に存在する脂質を取り除くために最も好適な溶媒として説明したタンパク質の溶解度を決定するには、クロロホルム/メタノール沈殿27を選択するために私達をもたらした。両性イオン洗剤CHAPS(3 - [(3 -コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ] -1 -プロパンスルホン酸)を利用するタンパク質を再懸濁するための2次元バッファにペレット化する一次元のステップ28におけるタンパク質進入を容易にするためのその適合性に起因する。

人間とマウスの脳PRのプロフィール2D-DIGEによってoteomeは、それぞれ図2Aおよび2Bに示されている。 図2Aにヒト対照からの蛍光画像を合併し、AD皮質試料はAD-様タウ病理29のモデルからのマウスの海馬サンプルについて図2B同上に、観察することができる。 Cy2は、Cy3およびCy5は、それぞれ、 図2C〜2Eにおけるヒトサンプルについて示されている。両方は、高品質のIEFおよび図1Bにおいて観察プロファイルと一致する第二次元分離を反映した高解像度スポットを提示した( 図2Aおよび2B)のパターンをマージ。一緒に架橋がソフトウェア分析を通して整列させるこれらの蛍光画像( 図2C〜2E)は非常に容易に、特定のシアニンへのタンパク質の可能な嗜好を排除するために行われるという事実と、このスポット定義の品質。さらに、分取ゲルはブルー共同で染色omassie証拠一つは、ソフトウェアの分析後及びMS / MSによるその後方同定のためのスポットを切除することができ、すべての利用pH範囲にわたって豊富なスポットで濃縮されたタンパク質のマップ。

タンパク質を免疫ブロット法により定性ミニ2DE分析では、翻訳後のもののためだけでなく、オリゴマーおよび切断のために( 図3Aと図3B)だけではなく、その特定と修正のために価値の高い情報を提供します。ミニ2DEでこの手法を実行するための実行可能性は、目的のタンパク質についての迅速かつ正確なデータを提供します。レビー小体型認知症(LBD)の影響を受けた患者由来の組織については、α-シヌクレインの特徴付けは、それにもかかわらずに、天然のタンパク質は、4.67のpIにあり、18kDaのMWが明確に定義された4-7 pHプロファイルを視覚化することができますそれは、さらに天然型よりも、同じpIはなく、UBIQの存在で二量体( 図3A、アスタリスク )の存在を見ることができますミニ2DEより基本的でより多くのユビキチン化され、彼らが( 図3A、矢印 )である、より高い分子量を有するいるuitinatedフォーム。 AD密接にリンクされた別のタンパク質は、アミロイド前駆体タンパク質(APP)の複素異化により生成されたアミロイドβペプチドである。 図3Bには、家族性孤発性AD一つとケースのプロットを比較する。おなじみのADの場合​​には、散発性ADに対して減少しており、また、isovariantsアミロイドβのX 42(4 kDaの)はまた、すべてのギャップの上にダウンレギュレートされるかアミロイドβ1-42を観察することができる一方8 kDaの発見オリゴマーは、スポット強度はおなじみのAD( 図3B)において、より適切であるので、この事実は、タンパク質のより低い量によるものではないことを反映しています。

図1
図1:2DE PROFILE 10mMトリス、1%SDS重量/体積の緩衝液抽出(A)及びUTS利用率(B)の後に得られたパターンを後パネルBにおいては、スポット強度と分解能の数が1よりはるかに高い方法を見ることができるパネル(A)。 UTSの使用は、それが2DEクマシー染色に反映されているほぼ全タンパク質を抽出することができます。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

図2
図2:ヒト(A)およびマウス(B)のための2D-DIGEプロファイルが示されているイメージ(A)及び(B)は 18センチメートルストリップの3-11 pH範囲三シアニンのマージされた画像を表す写真(C)、(D)および(<強い> E)のシアニンは赤で(青Cy2は、緑の中のCy3およびCy5)は独立して公開されます。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

図3
図3:上のパネルでは、それがLBD患者におけるタンパク質αシヌクレインのミニ2DEプロファイルを観察することができるネイティブPI(4.4)と二量体化の機能のMW(18 kDa)の変化(アスタリスク)MW。より基本的な1(矢印)、(A)までのpIをシフトし、ダブル、およびユビキチン化がある。ダウン写真はADの散発的遺伝場合のアミロイドβペプチド抗体のプロファイルを明らかにする。 2DEパターンは、オリゴマー化および劣化がDISEの病因に応じて異なる方法で行われる方法を示していますASE。このイムノブロットは明らかに2条件間のAPPの異化の違いを指摘している。オリゴマーが少ない(B)をマークしているように見えるしながら、一方では、家族1( 矢印 )についての散発性AD内での異化製品の増加がある。これらの実験は、12%のBis-Trisゲルでの4-7のpHのギャップに、それぞれ16.5%トリス-トリシン1(A、B)を 11センチメートルのストリップに行われている。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

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Discussion

タンパク質の病理学的な発現変化を発見、バイオマーカー探索および薬理学的標的の可能性経路の調節がneuroproteomicsの目的の一つであるが30近づく 。新興のツールの中で、2DEフィールドが有望予想されているものが追加されます。それにもかかわらず、コンセンサスがばらつきを最小限にし、実験で再現性を高めるために、到達されるべきである。このアイデアの行に2D-DIGEを実行するための標準化されたプロトコルのモノ次元イムノブロット法と完全に互換性が、ヒトとマウスの脳組織のために( 図2)とその後の2DEのイムノブロット( 図3)は 、本明細書に詳細に記述されている。

プロテオミクスにおける最大のジレンマの一つは、可溶化バッファーの選択である。それはIEFと完全に互換性があるので、異なるアプローチの間での再現性を高めるためには、UTSを選択した。また、UTS抽出緩衝液はPELLEを生じなかっTまたは12,​​000×gで遠心分離した後、実際にわずか1(4℃で、SDS沈降と混同しないでください)​​。これは、ADを含む多くの神経変性疾患に存在するタンパク質の凝集が、あることを考慮して重要なポイントです。独立した研究は、可溶性と不溶性画分について行われるべきではないので、何ペレットが存在しないという事実は、パフォーマンスとデータの解釈を簡素化します。

2D-DIGEまたはミニ2Dアプローチが行われようとしているものは何でも、示されるべきであるいくつかの制限があります。まずUTSバッファの化学的性質は、この溶液が過熱してはならない、またはカルバミル化は、第一級アミンで発生し、したがって、IEF 15を損なうことにより、スポットの解像度を悪化、シアニン色素結合および2Dプロファイルの両方を妨害し得る。第二に、利用可能なpH範囲は、現在では、最も広いpHの間隔は3から11の間で、この因子は、IPGストリップの上にすべてのタンパク質のエントリが正しくありません可能性はないという確率に参加して染色後のゲルの両側に積層されたタンパク質バンドをアイン。全プロテオームは、2Dで研究することができるではない、なぜこの制限は、詳​​しく説明することがあります。もう一つの重要な制限は、降水量の論争を使用することである。一方で、効率的に脂質含量27を低減することができるクロロホルム/メタノールを用いて沈殿工程を行うために非常に推奨される、塩、核酸およびIEFパラメータを妨害し、解像度及び/又は再現性に影響を与える可能性のある帯電した界面活性剤2D。また、他方では強く、膜に結合し、いくつかのタンパク質が失われ得ることは排除できない。それにもかかわらず、他の抽出バッファが代わりにUTSの、いずれかで、またはプロテアーゼまたはホスファターゼ阻害剤を添加せずに使用する場合には、沈殿工程の使用は、高度にIEFの間に任意の落とし穴にもお勧めです。最後に、2D-DIGEのイメージ分析は蛍光を重ね不都合を提示することは注目に値するソフトウェア解析に大きな変化のように、これを考慮していないので、スポットは、情報の損失につながる可能性があります。

この結合方法の新規性は、その再現性、汎用性とタンパク質の特徴付けにある。一つだけ抽出バッファーは、1が2の相補的技術を実行することができます。 2D-DIGEは、MS / MSによるタンパク質発現の変化とそれに続く識別に関する定量的な情報を提供しています。しかしながら、アイソフォーム、isovariants、チモーゲン、翻訳後修飾および異化生成物は、他のタンパク質とオーバーラップするので、蛍光識別できなかった可能性がある。この制限を克服するためには、ミニ2DEの並列使用が提案されている。実際には、我々の知識にコミットすることができる最も重要な落とし穴の一つは、2D-DIGE結果の完全な検証などの1次元イムノブロットを取るために、あるいは任意のプロテオミクス変更が検証する必要がないことを考慮することである。 Furthermore、ミニ2DEの技術的な利点は、1アール)の小、SDS-PAGEシステムを使用することの実現可能性、必要に応じて2)比較的低い材料、3)pH値の広い範囲が利用可能、4)イムノブロット感性との5)簡単に推定変化。ミニ2DE技術のfussiest態様は、定量化されたミニ2DEにもかかわらず、このようにして信頼性の高い家具、スポット又はプロットのアライメント後には、酸性および塩基性部分またはその逆の間の比を確立することが可能で、定量的な手法と考えることはできない変化の推定は9を観察した。

文献中のいくつかのデータに正確なレビー小体型認知症のために32,33とするため、図3Aに記載され31、オリゴマー化及び分解経路とし、翻訳後修飾のない過剰発現したタンパク質のためのタンパク質の特性を達成するために使用ミニ2DE、 AD患者。 mで提供される情報の他の例 iniファイル2DEは、ワクチン接種アプローチ34の潜在的な標的としての非認知症とADの症例で行われるβアミロイド種の切り捨てである。オリゴマーとその示差的分解の存在はまた、散発的または馴染みのAD患者に応じて、図3Bに示されている。異なる処理を実行することができるので、また、ミニ2DEアプローチは可能性の広いかつ実用的なウィンドウが開きます。 ADの分野では、例えば、ホスファターゼ阻害剤を添加することができ、タウのリン酸化に及ぼす影響を明らかにする。また、切断型のPIとMWの同定は、抗体のエピトープ34によると、切断部位を提供することができることを与えられたタンパク質分解経路に対する薬理薬の効果、。興味深いことに、最近のデータは、ミニ2DEのマウスモデルにおける認知障害とのライフスタイルや薬物治療との関連だけでなく、新しいタウ変異35〜37の生化学的プロファイルを使用して解明した。

ntent ">脳組織の2D-DIGEを有効にする方法の開発は、ヒトまたはマウスの起源から得られるだけでなく、背後にあるミニ2DEを使用して検証、神経疾患の研究のための新しい薬理学的標的とバイオマーカーを暴くに光を当てることがあります。これらの疾患は、脳におけるその起源を有し、理想的な情報源として、この器官を研究するために義務付けているという事実であるが、ヒトのサンプルが限られているので、動物モデルの使用は、この目標を達成するために必須となる。ここでのアプローチを使用することの重要性試料の両方のタイプの平行結果を検証する。これは、最終的には、近い将来に信頼性のある候補が発見されると、例えば血漿および脳脊髄液などの身体の体液で試験疾患進行の早期診断、評価を確立するためにおよびあることが望ましい利用可能なもっともらしい治療法の評価。

プロトコル内の重要なステップは、そのSUITABのために考慮されなければならないル·アプリケーション。 2D-DIGEの場合には、 サンプルテスト品質が重要なポイントである。このテストでは、許可のタンパク質は、タンパク質の実際の量は、沈殿させた後、2次元バッファ内の既存の抽出プロファイルおよび検証知る。ステンドプロファイルは、私たちにサンプル間の品質や均一性に関する情報を提供します。類似したパターンを持つ唯一のサンプルは、そうでない場合、2D-DIGEが悪い染色およびタンパク質プロフィールの貧弱な解決につながる可能性があり、2D-DIGEの研究のために使用されなければならない。これらのサンプルパターンの違いは、多くの不便38,39との研究契約のためのヒト脳試料ので、マウス脳組織よりも人間の方が一般的である。また、による死後間隔にタンパク質分解の同定は、すでに2D-DIGE 40,41により報告されている。シアニン色素標識の前にpHを確認、このステップは、すべての事後手順を損なわなければならない。 シアニン色素標識およびSDS-PAGE電気泳動のよう暗闇で行われるべき蛍光標識に影響を与えないようにするためにできるだけ。最終的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、移行時間変動性を排除するとパターンが重複し、事後分析42,43容易にするために、それらの間で可能な限り均一にする必要があります。

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Disclosures

著者らは、宣言する特別の利害関係はありません。

Acknowledgments

この作品は、向かわせる、リール2大学、MEDIALZ、LabEx(卓越した研究室、プログラムは将来のための投資)とDISTALZ(アルツハイマー病への横断型アプローチのための革新的な戦略の開発)によってサポートされていました。 FJ.FGは現在、ANR(フランス国立研究機関/ NeuroSpliceドタウ01プロジェットANR-2010-BLAN-1114)の受信者の交わりですが、この作品はJCCM(スペイン)からの助成金の支援の下にもありました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5 nmol 1 * 5 Nmo GE Healtcare 25-8010-65
Immobiline DryStrip GE Healtcare Reference in function of the pH interval/size
IPG Buffer, pH X-X GE Healtcare Reference in function of the pH interval desired
AMBERLITE IRN-150L MIXED BED RESIN 1  GE Healtcare 551797N
DRYSTRIP COVER FLUID IMMOBILINE 1 * 1 l GE Healtcare 17-1335-01
KIT BOX IPG 1 * 1 KIT GE Healtcare 28-9334-92 Plastic box to make the passive rehydration 
MILLEX GS Filter Millipore SLGS033SB
Criterion XT Precast Gels 13.3 x 8.7 cm (W x L) Bio-Rad Reference in function of the MW to separate
IPGphor III Isoelectric Focusing Unit GE Healtcare 11-0033-64
Ettan DALTsix Large Electrophoresis System GE Healtcare 80-6485-08
OneTouch 2D Gel SpotPicker 1.5 mm  Gel Company P2D1.5

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References

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