La lignina Down-regulación de
1The School of Plant Sciences, University of Arizona, 2Department of Chemical Engineering and Materials Science, DOE Great Lakes Bioenergy Research Center, Michigan State University, 3The Institute for Sustainable and Renewable Resources, The Institute for Advanced Learning and Research, 4Department of Plant, Soil and Microbial Sciences, Michigan State University

Bioengineering

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Summary

Una interferencia de ARN de doble cadena (dsRNAi) técnica se emplea para regular a la baja la coenzima A reductasa cinamoilo maíz gen (ZmCCR1) a un menor contenido de lignina de la planta. La lignina regulación a la baja de la pared celular se visualiza mediante análisis microscópicos y se cuantifica por el método de Klason. Se analizan los cambios de composición de la hemicelulosa y la celulosa cristalina.

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Park, S. H., Ong, R. G., Mei, C., Sticklen, M. Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis. J. Vis. Exp. (89), e51340, doi:10.3791/51340 (2014).

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Abstract

Para facilitar el uso de la biomasa lignocelulósica como un recurso bioenergía alternativa, durante los procesos de conversión biológica, se necesita una etapa de pretratamiento para abrir la estructura de la pared celular de la planta, el aumento de la accesibilidad de los hidratos de carbono de la pared celular. La lignina, un material polifenólico presente en muchos tipos de pared celular, se sabe que es un obstáculo significativo a la enzima de acceso. Reducción en el contenido de lignina a un nivel que no interfiere con la integridad y la defensa del sistema estructural de la planta puede ser un paso importante para reducir los costes de la producción de bioetanol. En este estudio, hemos genéticamente las reguladas uno de los genes relacionados con la biosíntesis de lignina, cinamoil-CoA reductasa (ZmCCR1) a través de una técnica de interferencia de ARN de doble cadena. El constructo ZmCCR1_RNAi se integró en el genoma del maíz utilizando el método de bombardeo de partículas. Plantas de maíz transgénicas crecieron normalmente en comparación con las plantas de control de tipo salvaje y sin enterfering con el crecimiento de la biomasa o los mecanismos de defensa, con la excepción de la visualización de color marrón-coloración en plantas transgénicas hoja mediados de los nervios, las cáscaras y tallos. Los análisis microscópicos, en conjunción con el ensayo histológico, revelaron que las fibras de esclerénquima de hojas se apretó pero la estructura y el tamaño de otros componentes principales del sistema vascular no fue alterada. El contenido de lignina en el maíz transgénico se redujo en un 7-8,7%, se aumentó el contenido de celulosa cristalina en respuesta a la reducción de la lignina, hemicelulosas y se mantuvo sin cambios. Los análisis pueden indicar que el flujo de carbono podría haber sido desplazado de la biosíntesis de la lignina para la biosíntesis de la celulosa. Este artículo delinea los procedimientos utilizados para regular a la baja el contenido de lignina en el maíz a través de la tecnología del RNAi, y los análisis de la composición de la pared celular utilizado para verificar el efecto de las modificaciones en la estructura de la pared celular.

Introduction

La producción de biocombustibles a partir de biomasa lignocelulósica es altamente deseable debido a su abundancia actual en los EE.UU. 1, y en el caso de la cosecha sostenible de los residuos agrícolas y forestales, la capacidad de no competir directamente por las tierras de cultivo utilizado para la alimentación animal y la producción de piensos. Sin embargo, a diferencia de grano de maíz, que es la principal fuente de biocombustible se está generando en los EE.UU., los materiales lignocelulósicos son significativamente más complejo y difícil de romper. Además de la hidratos de carbono de cadena larga, celulosa y hemicelulosa, que son las principales fuentes de azúcares durante la fermentación de materiales lignocelulósicos, muchos tipos de paredes de células vegetales también contienen lignina, un polímero de fenilpropanoides que proporciona fuerza, la defensa contra el ataque de patógenos, y la hidrofobicidad a las paredes celulares. Mientras que es necesario para el crecimiento vegetal y la supervivencia, la lignina también presenta una barrera significativa para la conversión enzimática con éxito de la celulosa y hemicelluperder a los azúcares solubles. Los materiales con alto contenido de lignina son generalmente materiales menos deseables, tanto para el biocombustible (a través de las vías de conversión biológica) y las industrias de pulpa y papel, debido a los impactos negativos sobre las características de procesamiento y la calidad del producto. Por lo tanto, la manipulación genética de los materiales vegetales para la reducción de la lignina en un nivel que no interfiera con la resistencia estructural de los cultivos y los sistemas de defensa podría ser importante para la reducción de los costos de producción, tanto para el biocombustible lignocelulósico y las industrias de pulpa y papel.

En el maíz (Zea mays), la lignina es covalentemente reticulado para la hemicelulosa en la pared celular primaria a través de ferulato y puentes diferulato 2. El complejo lignina-hemicelulosa se une a las microfibrillas de celulosa a través de enlaces de hidrógeno, formando una matriz compleja que confiere la integridad y la fuerza a la pared celular secundaria. La resistencia mecánica de las paredes celulares de la planta está determinada en gran medida por el tipo de Lignin subunidades 3-5. En estudios anteriores, la alteración de las proporciones de las subunidades de lignina ha mostrado ninguna tendencia clara en la digestibilidad enzimática 6-11. Sin embargo, las reducciones en el contenido de lignina en general, muestran una mejora en las conversiones de 12,13 y pueden ser una clave para el aumento de la digestibilidad de la materia vegetal por las enzimas hidrolíticas incluyendo endocellulases, celobiohidrolasas, y β-glucosidasas 14.

La ingeniería genética de regular el nivel de expresión de las transcripciones ha sido ampliamente practicada para mejorar características de los cultivos. Las técnicas avanzadas, incluyendo anti-sentido 15 y cosupresión 16 tecnologías, permiten efectiva la baja regulación de los genes diana. Completar gen knock-out también se ha conseguido utilizando construcciones de genes que codifican ARN intrón-empalmado con una estructura de horquilla 17. Además, una interferencia de ARN de doble cadena técnica (dsRNAi), es decir, un medio de expresión génica potente y eficazTor que funciona por cualquiera de focalización degradación de transcripción o traducción represión, proporciona un potente medio para inducir una amplia gama de efectos de supresión en el ARNm diana 18. Técnicas de silenciamiento génico muestran varias limitaciones. Estas técnicas no regulan con precisión el nivel de la transcripción y que podría causar efectos de silenciamiento inesperadas en otros genes homólogos.

En este método, hemos empleado el bombardeo de partículas para llevar a la dsRNAi construye en el genoma de maíz. Hasta la fecha, una gran variedad de especies de plantas se han transformado con éxito utilizando bombardeo de partículas, transformación mediada por Agrobacterium, electroporación, y los métodos de microinyección. En la transformación genética del maíz, el método de bombardeo de partículas es ventajoso con respecto a todos los otros métodos, ya que es el más eficiente. El bombardeo de partículas no depende de las bacterias, por lo que el método es libre de limitaciones biológicas, tales como el tamaño de los genes, especies de gen oigin, o el genotipo de la planta. El sistema de suministro de transgén física permite ADN de alto peso molecular y múltiples genes a ser introducidos en los genomas de plantas y en ciertos casos en los cloroplastos en alta eficiencia de transformación 19. La reducción de la lignina en el sistema vascular de la hoja de nervadura puede ser visualizado a través de microscopía electrónica de barrido (SEM) que es beneficioso para el examen de la topografía y la composición de las muestras.

En las plantas de maíz, dos de la reductasa de cinamoílo-CoA reductasa (ZmCCR1: X98083 y ZmCCR2: Y15069) se encontraron genes en el genoma del maíz 20. Cinamoil-CoA reductasa cataliza la conversión de los ésteres hidroxicinamoil-CoA reductasa en aldehídos de cinamilo. Elegimos el gen ZmCCR1 para regular a la baja esta enzima debido a que el gen se expresa en todos los tejidos lignifying. Los 523 nucleótidos en el extremo 3 'del gen ZmCCR1 se eligieron para un dsRNAi construir porque las secuencias parecían sermás diversa en comparación con los de ZmCCR2. Por lo tanto, la construcción dsRNAi ataría precisamente sólo para ZmCCR1, evitando fuera del objetivo silenciar a 21. Una construcción ZmCCR1_RNAi fue diseñado en el sistema de expresión citoplásmica ImpactVector1.1-tag (IV 1,1) que contiene el promotor específico de tejido verde, ribulosa-1, carboxilasa oxigenasa 5-bifosfato-carboxilasa/oxigenasa (RuBisCO).

Para estudiar los efectos de la dsRNAi construir en plantas transgénicas, se cuantificó el contenido de lignina. La medición de lignina Klason (insoluble en ácido) es conocido por ser más precisa en comparación con los métodos de cuantificación de lignina detergente ácido que solubilizan algunos de la lignina 22. Por lo tanto, la lignina Klason se midió en tallos de maíz transgénicas. Este procedimiento consiste en una hidrólisis ácida de dos pasos que convierte los carbohidratos poliméricos solubles en monosacáridos 23. A continuación, la biomasa hidrolizada se fraccionó en ácido Materi soluble e insolubleALS y la lignina insoluble en ácido se midió de acuerdo con estudios anteriores 23,24. Idealmente, el análisis de lignina debe incluir extracciones con agua y etanol antes de la etapa de hidrólisis, con el fin de eliminar los materiales solubles que pueden interferir con los resultados, y una combustión después de la hidrólisis del residuo de lignina para dar cuenta de cualquier ceniza presente en el residuo. Sin estos pasos, el contenido de lignina de la muestra podría ser inflado artificialmente. El método de integración global se presenta aquí, sin embargo, para nuestros experimentos hemos podido llevar a cabo estos dos pasos debido al pequeño volumen de material disponible para la prueba

También se analizaron otros dos componentes de la pared celular, la celulosa y la hemicelulosa en la lignina líneas de maíz transgénico-hacia abajo regulado. Se ha informado de que las plantas transgénicas que han sido regulados hacia abajo, ya sea en su fenilalanina amoníaco-liasa (PAL) 25, 4-cumarato: CoA ligasa (4CL) 26, o una de cinamilodeshidrogenasa l alcohol (CAD) 27 muestran un aumento de otros componentes estructurales de la pared celular. Como un primer paso en nuestros estudios, celulosa cristalina se midió utilizando el método Updegraff 28. Este método fue ideado originalmente para la determinación de la celulosa en un gran número de bacterias celulolíticas y hongos. Brevemente, las existencias de maíz molidos fueron tratados con Updegraff reactivo (ácido acético: ácido nítrico: agua) para eliminar la hemicelulosa, lignina, y xylosans. La celulosa cristalina fue completamente hidrolizada en glucosa a través de Saeman hidrólisis mediante la adición de H 2 SO 4. A continuación, la celulosa cristalina se ensayó usando el método colorimétrico de antrona 29. Para verificar si se cambiaron el contenido de hemicelulosa, los extractos de monosacáridos de tallos molidos se hidroliza usando ácido trifluoroacético, derivatizados utilizando el método del acetato de alditol y se analizaron por cromatografía de gases (GC) 30. Los procedimientos detallados para cel cristalinaanálisis de composición de contenido lulosa y de la matriz de polisacáridos se describen en Foster et al. (2010) 31.

A continuación, describimos los procedimientos utilizados para la lignina baja regulación en el maíz a través de una tecnología de RNAi, la transformación por bombardeo de partículas, y el análisis de la lignina para la deconstrucción acelerada de maíz de biomasa lignocelulósica en azúcares fermentables para los biocombustibles.

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Protocol

1. Preparación de dsRNAi construcciones utilizadas para el descenso de regulación de ZmCCR1

  1. Primers específicos de genes de diseño que incluyen sitios de enzimas de restricción necesarios para hacer una dsRNAi construir a ronda el gen ZmCCR1. Dos conjuntos de cebadores fueron diseñados para amplificar dos segmentos de fragmentos de ADNc ZmCCR1:. Un fragmento de 523 pb desde el nucleótido 748 hasta 1271, y un fragmento de 285 pb desde el nucleótido 986 hasta 1271 El ADNc ZmCCR1 fue proporcionada por el Instituto del Genoma de Arizona (AGI). Más detalles se describen en la Figura 1.
  2. Amplificar el fragmento grande por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de la plantilla de cDNA ZmCCR1 utilizando los ZmCCR1_748F_BglII cebadores (5'-AGATCTACATCCTCAAGTACCTGGAC-3 ') y ZmCCR1_1271R_NcoI (5'-CCATGGTTTACACAGCAGGGGAAGGT-3'). Amplificar el fragmento más pequeño (285 pb) utilizando los cebadores ZmCCR1_986F_BglII (5'-AGATCTGGAAGCAGCCGTACAAGTTC-3 ') y un ZmCCR1_1271R_SacI (5R17;-GAGCTCTTTACACAGCAGGGGAAGGT-3 ').
  3. Individualmente ligar los fragmentos en pGEM-T Easy siguiendo las instrucciones del fabricante.
  4. Realizar Mini-Prep de aislamiento de ADN plásmido de los transformantes individuales, cada uno que contiene el pGEM-T construye usando un kit de plásmido mini-preparación comercial.
  5. Digerir tanto el pGEM-T :: ZmCCR1 (523 pb) y ImpactVector (IV) -1,1 (vector de expresión citoplasma) con tanto BglII y NcoI.
  6. Se liga el fragmento grande se purificó en gel ZmCCR1 digeridos (523 pb) en el gel digerido IV-1.1 purificada.
  7. Se digiere el pGEM-T :: ZmCCR1 (285 pb) y IV-1.1 :: ZmCCR1 (523 pb) tanto con BglII y SacI para insertar el pequeño fragmento en el IV-1.1 :: ZmCCR1 (523 pb).
  8. Se liga el fragmento pequeño de gel digerido ZmCCR1 purificado (285 pb) en el gel digerido IV-1.1 purificado :: ZmCCR1 (523 pb).
  9. Clonar tanto 523 pb y 285 pb fragmentaciónTS a IV-1.1 para hacer que el ZmCCR1 ARNi construir, que tiene una secuencia de repetición invertida 285 pb con un espaciador 238 pb en el medio de los fragmentos de repetición invertida (véase la Figura 1).
  10. Transferencia de esta construcción en Escherichia coli (E. coli), crecer y realizar un aislamiento de ADN plásmido tamaño-midi de preparación para obtener el plásmido de ADN suficiente para la transformación genética del maíz.

2. Maíz Transformación Genética

  1. Preparación de partículas de tungsteno
    1. Coloque 60 mg de perlas de tungsteno (M10) en un tubo de 1,5 ml y se lava con 1 ml de etanol al 70% por agitación rotatoria durante 2 min. Incubar durante 10 minutos a 23 ° C y centrifugar a 18.894 xg durante 2 min y descartar el sobrenadante.
    2. Lavar 3 veces con 1 ml de etanol 100%, centrifugando durante 2 min y descartar el sobrenadante. Añadir 1 ml de 50% de glicerol estéril para llevar la concentración de micropartículas de 60 mg / ml.
  2. Preparación de ADN para el bombardeo
    1. Plel as de los 50 l (3 mg) de perlas de tungsteno preparadas en glicerol al 50% en un tubo de 1,5 ml. Añadir 5 l (1 mg) de IV-1.1 :: plásmido de ADN ARNi ZmCCR1, 50 l de CaCl2 2,5 M, y 20 l de 0,1 M espermidina. Vórtice brevemente entre cada adición de los reactivos anteriores.
    2. Vortex el tungsteno-ADN del grano brevemente la mezcla y se centrifuga a 18.894 xg durante 30 segundos. Retirar el sobrenadante y resuspender los gránulos en 140 l de etanol al 70%. Retirar el líquido y desecharlo. Añadir 140 l de etanol al 100%. Retirar el líquido y desecharlo.
    3. Añadir 48 l de etanol al 100%. Utilizar inmediatamente o almacenar en hielo durante un máximo de 4 horas antes del bombardeo.
  3. Bombardeo
    1. Coloque una callos de maíz embriogénico 3-5 cm de diámetro Hi-II (proporcionado desde el Centro de transformación de maíz, de la Universidad del Estado de Iowa) en el medio de 100 mm placas de Petri que contienen medio N6OSM 32 (como osmotium) al menos 4 horas antes de la bombardeo.
    2. Prepare la PSD-1000/He dispositivo de partícula de suministro de acuerdo con las instrucciones del fabricante 33.
    3. Esterilizar pared de la cámara con etanol al 70%. Cargue el disco de ruptura de 650 psi estéril en tapa de retención estéril. Spread 5-6 l de la solución de M10-ADN sobre la superficie de un macroportador, brevemente seco. Macroportador carga y detener pantalla en microsoporte ensamblaje de lanzamiento.
    4. Coloque microsoporte ensamblaje de lanzamiento y los callos de maíz en la cámara a una distancia seleccionada de la pantalla de detención (L2 = 6 cm) y cierre la puerta. Acelerar en un vacío de 27 psi en contra de una pantalla de malla de alambre.
    5. Pulse el botón de disparo hasta ráfagas de disco de ruptura y de la presión de helio medidor llega a cero. Suelte el botón de disparo.
    6. Incubar los callos bombardeados en una placa de Petri que contiene N6OSM (medio osmótico) 32 durante 16 horas en la oscuridad a 27 ° C. Romper los callos en unos diez piezas y la transferencia a N6E (medio de inducción de callo) 32 en placas de Petri y se incuba durante 5 días in la oscuridad a 27 ° C.
  4. Selección
    1. Después de 5 días en N6E, transferir los callos en un medio N6S (medio de selección) 32. Subcultura todo callos en un medio de selección, cada 30 días durante 8-12 semanas sin alterar la estructura de los callos.
    2. Después de aproximadamente 8-10 semanas, los sectores de rápido crecimiento blancos crecerán fuera de la no proliferación y calli madre parcialmente necrótica. Impuestos especiales de los tejidos de rápido crecimiento blancas y la subcultura a medio de selección fresco (N6S) 32 y continuar incubar que el anterior.
  5. Regeneración
    1. Transferir la callos embrionarios blanco y de crecimiento rápido en medio de regeneración 32 y se incuba como anteriormente durante 1 semana. Cambie los callos embriogénicos regenerar a un período de 16 horas luz del día y 8 horas de oscuridad a 25-27 ° C
    2. Transferir la regeneración dispara en el medio de enraizamiento 32 en un tubo de ensayo de vidrio después de 3-4 semanas, continúe incubar que el anterior. Después r sustancialAparece el desarrollo OOT, lávese cuidadosamente las raíces bajo el agua del grifo, y luego trasplantar las plántulas de 4 "macetas con tierra. Cubra las ollas con bolsas de plástico para mantener la humedad. Después de 2 días hacen agujeros pequeños de las bolsas de plástico. Después de 5-6 días retirar las bolsas de plástico. Continuar incubar como anteriormente para otros 5-6 días.
  6. Invernadero
    1. Transfiera las plantas de semillero en macetas de 18 "con el suelo y mantener en sol de verano completo o la luz de efecto invernadero. Las plantas regeneradas iniciales se llaman T 0, mientras que las primeras semillas pertenecen a la generación T 1.

3. Ensayo histológico

    1. Fijar las de maíz hoja mediados de los nervios en 5 ml de formalina al 10% tamponada neutra.
    2. Proceso de vacío y se infiltran con parafina en un procesador de tejidos usando un procesador de tejidos.
    3. Incrustar los tejidos en parafina utilizando una estación de incrustación Histocentre III.
    4. Retire el exceso de parafina de los bordes de una vez bloqueks se enfrían.
    5. Muestra en la Sección 4-5 micras con un micrótomo usando un microtomo.
    6. Coloque las secciones en portaobjetos de microscopio y seca en una incubadora de 56 ° C durante 2-24 horas. Haga secciones estén totalmente adheridos a la diapositiva.
    7. Desparafinar secciones en dos cambios de xileno durante 5 min a 23 ° C.
    8. Hidrato se desliza a través de dos cambios de etanol al 100% durante 2 min y dos cambios de etanol 95% durante 2 min a 23 ° C.
    9. Enjuague las secciones en agua corriente durante 2 min.
    10. Teñir con un 0,05% de toluidina O azul durante 1-2 minutos y enjuagar brevemente con ddH 2 O.
    11. Coloque un cubreobjetos sobre las muestras con aceite de inmersión y visualización con microscopia de luz.
  1. Microscopía Electrónica de Barrido (SEM)
    1. Fijar los de maíz hoja mediados de los nervios-seccionadas transversal en 4% de glutaraldehído y 0,1 M de tampón de fosfato de sodio (pH 7,4) a 4 ° C durante 1-2 horas.
    2. Brevemente enjuague las muestras en la memoria intermedia, ellos se deshidrataron en unaserie de etanol (25%, 50%, 75%, y 95%) durante 10-15 min en cada gradación y etanol al 100% durante 10 min, 3x.
    3. Secar los deshidratados maíz hoja mediados de nervios transversales de sección en una secadora de punto crítico que utiliza dióxido de carbono líquido como fluido de transición.
    4. Montar las muestras secas en los talones de aluminio mediante fichas de carbono de alto vacío
    5. Cubra las hoja de maíz a mediados de los nervios montados en los talones de aluminio de oro (de aproximadamente 20 nm de espesor) en un dispositivo de recubrimiento por pulverización catódica purgado con gas argón.
    6. Examine las muestras recubiertas en un JEOL JSM-6400V (emisor de electrones hexaboruro lantano) microscopio electrónico de barrido.
    7. Las imágenes digitales fueron fotografiados utilizando un software Pro Analysis (versión 3.2).

4. Lignina Klason Medición

  1. Molino de las muestras a través de un tamiz de 2 mm.
  2. Utilizar un analizador de humedad para determinar el contenido de humedad de cada muestra y registrar el valor.
  3. Pesar aproximadamente 1,5 g de cada muestra y se registra la masa. EXtract las muestras usando agua para la primera extracción, seguido de etanol para la segunda extracción usando un extractor automatizado disolvente (3 ciclos por extracción, ~ 14 min por ciclo) o aparato de Soxhlet (8 horas por extracción). (Nota: Este paso elimina extractivos que pueden condensarse durante la hidrólisis ácida e interferir con la medición exacta de la lignina, lo que aumenta la aparente contenido de lignina Klason.)
  4. Secar las muestras extraídas a 45 º C durante la noche, y luego deje que se enfríen en el desecador y pesar de nuevo.
  5. Establecer una incubadora a 30 ° C. Mide 0,3 g de cada uno, muestra extraída seco en tubos con tapa de rosca de alta presión (por triplicado por muestra se recomienda) y registrar los pesos a 0,1 mg. Añadir 3 ml de 72% de H 2 SO 4 a cada tubo de presión.
  6. Mezclar la muestra utilizando una varilla de agitación de vidrio o teflón. Deje la varilla de agitación en el tubo hasta que el agua se añade después de la incubación.
  7. Colocar los viales en una incubadora en síT a 30 ° C y 150 rpm durante 60 min. Después de 1 hora añadir 84 ml de agua desionizada para diluir la concentración de ácido al 4% y mezclar con la varilla de agitación. Tenga cuidado de no dejar grandes cantidades de muestra en los lados del vial por encima de la línea de agua.
  8. Sellar herméticamente las trabas de todos los viales y colóquelos en un bastidor de metal o de grandes vasos. Autoclave a 121 ° C utilizando un ciclo de esterilización líquido durante 1 hora. Deje que se enfríen a temperatura ambiente antes de abrir.
  9. Pre-ash los crisoles filtrantes en un horno a 575 ° C durante al menos 4 horas. Permita que se enfríen los crisoles en un desecador durante al menos una hora.
  10. Vacío filtrar la solución de cada tubo a través de un crisol separado, utilizando un adaptador de caucho para asegurar el crisol. Utilice agua desionizada para enjuagar las partículas restantes del tubo.
  11. Secar el residuo de lignina a 105 ° C durante un mínimo de 4 horas. Anotar el peso del crisol seco y residuos.
  12. Si se utiliza un 575 ° C, preEl fuego de las muestras sobre un mechero de Bunsen hasta que no haya humo o ceniza y luego colocar en el horno durante 24 horas, o si se utiliza un horno programable, no pre-ash y utilizar el siguiente programa:
  13. Rampa de temperatura ambiente a 105 ° C y mantener durante 12 min.
  14. Rampa a 250 º C a 10 º C / min y mantener durante 30 min.
  15. Rampa a 575 ° C a 20 ° C / min y mantener durante al menos 180 minutos.
  16. Retire los crisoles del horno y enfriar en un desecador. Pesar el crisol y ceniza.
  17. Calcular el residuo insoluble en ácido mediante la siguiente ecuación:

Ecuación 1

M PRE = Masa de la biomasa antes de extraer
M POSTE = Masa de la biomasa post-extraída
M VIAL = masa de la biomasa extraída añadió al vial
M RESIDUOS = Masa de resid crisol y ligninaue
M ASH = Masa del crisol y cenizas
MC = Contenido de humedad de la biomasa pre-extraído, respecto al peso total

5. Análisis de carbohidratos

  1. Realice la pared celular de carbohidratos análisis basado en el Foster et al. (2010) Protocolo de 31. En resumen, Preparar alcohol residuo insoluble de liofilizado material vegetal. A continuación, hidrolizar el material con ácido trifluoroacético y combinar los derivados de monosacáridos solubilizadas a sus acetatos de alditol correspondientes. Analizar estos derivados volátiles por cromatografía de gases (GC) conectado a un espectrómetro de masas cuádruple.

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Representative Results

Hemos demostrado una reducción en el contenido de lignina en las plantas de maíz a través de ARNi. El método de transformación por bombardeo de partículas produjo alrededor del 30% de eficiencia trnasformation. El silenciamiento de los genes de ZmCCR1 se observó consistentemente en generaciones T0-T2. Los transgénicos lignina reducida crecieron de manera similar a las plantas de maíz de tipo salvaje, excepto para la visualización de la coloración marrón en el medio de la hoja de la costilla, la cáscara y tallo. El ensayo histológico ha demostrado que las líneas mutantes muestran una reducción significativa en el espesor de la pared celular de las fibras de esclerénquima en la hoja de maíz mediados de la costilla 18. A pesar de la reducción del espesor de la pared celular, la estructura de otros sistemas vasculares más importantes, incluyendo el vaso del xilema, floema, y células de la vaina no reveló diferencias en comparación con el control de tipo salvaje (Figura 2A) 18. Esto implica que no hay efectos perjudiciales, ya sea para el transporte de agua, la transferencia de nutrientes, o la resistencia mecánica a la i tallosn las líneas mutantes ZmCCR1_RNAi.

El contenido de lignina se cuantificó usando una medición lingin Klason. La Figura 3 muestra la cantidad de ácido insoluble en lignina Klason (g / kg Con Stover) en tipo salvaje de maíz y ZmCCR1_RNAi líneas transgénicas (T1). Tres líneas transgénicas (1C-4, -5, y -6) mostraron una reducción estadísticamente significativa de lignina (8,1%, 7,0%, y 8,7% respectivamente) en comparación con la de las plantas de maíz de tipo salvaje 18. Para determinar si el flujo de carbono se desplaza de la ruta de biosíntesis de la lignina a teléfonos rutas de biosíntesis de la pared de hidratos de carbono, celulosa se ​​analizó mediante el método Updegraff. Figura 3A muestra que dos rectas ZmCCR1_RNAi mutantes (1b y 1c-6-6) contenían un aumento significativo de los niveles de cristalino celulosa (1,5 y 1,8 veces, respectivamente) 18. También se analizó el contenido de hemicelulosa. Figura 4B muestra la cantidad de cuatro componentes principales (hemicelulosaarabionose, xilosa, galactosa y glucosa). Ninguno de los cuatro grupos de hidratos de carbono reveló ningún cambio en las líneas mutantes 18.

Figura 1
Figura 1 Estrategia de clonación de plásmido construye dsRNAi para la baja regulación de la ZmCCR1 PRbcS1:.. Ribulosa promotor bisfosfato carboxilasa de Chrysanthemum morifolium Ramat. T-RBCS1: ribulosa bisfosfato carboxilasa pequeña unidad terminadora del crisantemo Asteraceous. Esta cifra ha sido modificado de Park et al (2012) 18.

Figura 2
Figura 2. Fenotípica análisis de tipo silvestre del maíz (Hi-II) y ZmCCR1_RNAinervadura de la hoja mutante. A) la coloración Brown fue visto en ZmCCR1 hojas de maíz-regulado por, tallos y hojas de maíz. B) Las nervaduras centrales maíz seccionados transversal de tipo salvaje HI-II (izquierda) y la línea mutante ZmCCR1_RNAi (derecha) fueron teñidas con 0.05% toluidina O azul por 1 min para visualizar los tejidos del xilema secundario. La punta de flecha roja indica las paredes celulares de las fibras de esclerénquima de la nervadura central de la hoja. (C) Microscopía electrónica de barrido (SEM) de ZmCCR1 hacia abajo-regulada transgénico nervadura de la hoja de maíz (derecha) en comparación con la de la planta de control no transgénico de tipo salvaje (izquierda). La flecha roja indica fibras de esclerénquima. Esta cifra ha sido modificado de Park et al. (2012) 18.

Figura 3
Figura 3. Mediciones de lignina Klason (ACI-d insoluble contenido de lignina) de tipo salvaje HI-II y ZmCCR1_RNAi mutante. Las tres líneas mutantes 1c, 1c-5, y 6-1c tenido estadísticamente menor contenido de lignina, 8,5%, 7,5%, y 9,2%, respectivamente, como porcentaje de materia seca en comparación con las plantas de control de tipo salvaje. Media ± desviación estándar (P <0.05, n = 3). Esta cifra ha sido modificado de Park et al. (2012) 18.

Figura 4
Figura 4. Análisis de la pared celular de composición. Análisis A) Celulosa cristalina de líneas ZmCCR1_RNAi (comparaciones pareadas de Tukey, * p <0.05, n = 3). B) La hemicelulosa análisis de la composición de tipo silvestre del maíz y líneas de maíz transgénico ZmCCR_RNAi (T1) a través de cromatografía de gases (GC). Los principales picos de los cromatogramas were integrado, identificado en base a los tiempos de retención y las firmas de iones de fragmentos, y se expresó como porcentaje mol (P> 0.05, n = 3) (las comparaciones por pares de Tukey, P> 0.05, n = 3). Esta cifra se ha reutilizado de Park et al. (2012) 18.

La figura 5
Figura 5 Porcentaje de azúcar conversiones (glucano y xilano) para tratar (UT) y AFEX pretratados-TM (90 ° C, 5 min) rastrojo de maíz a diferentes concentraciones de amoniaco (1,0:. 1,0 g de NH 3: g de biomasa seca: 1,5 1,5 g de NH 3:. g de biomasa seca) Las barras de error representan la desviación estándar de la media y se basan en dos réplicas para las muestras no tratadas y cuatro repeticiones (dos de tratamiento previo se replica con dos hidrólisis repeticiones cada uno) para las muestras pretratadas. Conversiones de azúcar pretratados(24 horas o 72 horas) marcado con letras diferentes son estadísticamente diferentes sobre la base de comparaciones por pares de Tukey (P <0,05). Esta cifra se ha reutilizado de Park et al. (2012) 18.

<td> 0,69 g / L prolina
Medios de comunicación Composiciones químicas
N6OSM Sales de 4 g / L de N6
(Medio osmótico) 1 ml / L N6 madre de vitaminas
2 mg / L de 2,4-D
100 mg / l de myo-inositol
0,69 g / L prolina
30 g / L de sacarosa
100 mg / L de hidrolizado de caseína
36,4 g / l de sorbitol
36,4 g / l de manitol
2,5 g / L de Gelrite, pH 5,8
Añadir filtro esterilizado de nitrato de plata (25 M) después de la esterilización en autoclave
N6E Sales de 4 g / L de N6
(Inducción de callos) 1 ml / L (1000 x) madre de vitaminas N6
2 mg / L de 2,4-D
100 mg / l de myo-inositol
2,76 g / L prolina
30 g / L de sacarosa
100 mg / L de hidrolizado de caseína
2,5 g / L de Gelrite, pH 5,8
Añadir filtro esterilizado de nitrato de plata (25 M) después de la esterilización en autoclave
Medios N6S Sales de 4 g / L de N6
(Medios de selección) 1 ml / L N6 madre de vitaminas
2 mg / L de 2,4-D
100 mg / l de myo-inositol
30 g / L de sacarosa
100 mg / L de hidrolizado de caseína
36,4 g / l de sorbitol
36,4 g / l de manitol
2,5 g / L de Gelrite, pH 5,8
Añadir filtro esterilizado de nitrato de plata (25 M) después de la esterilización en autoclave
Medio de regeneración Sales de 4,3 g / L de EM
1 ml / L (1000x) MS madre de vitaminas
100 mg / l de myo-inositol
60 g / L de sacarosa
3 g / L de Gelrite, pH 5,8 (100 x 25 mm placas de Petri)
Añadir filtro esterilizado bialaphos (3 mg / L) añadido tras autoclave
Medio de enraizamiento Sales de 4,3 g / L de EM
100 mg / l de myo-inositol
30 g / L de sacarosa
3 g / L de Gelrite, pH 5,8 (100 x 25 mm placas de Petri)
10% de formalina tamponada neutra 100 ml de formalina
(1 litro) 900 ml de ddH2O
4,0 g de fosfato de sodio dihidrógeno, monohidrato (NaH 2 PO 4 · H 2 O)

Tabla 1. Tabla de reactivos específicos.

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Discussion

La accesibilidad de las celulasas microbianas para plantar polisacáridos de la pared celular depende en gran medida del grado en el que se asocian con polímeros fenólicos 23. La tasa de conversión de biomasa lignocelulósica en azúcar fermentable se correlaciona negativamente con el contenido de lignina depositado en las paredes celulares de las plantas secondadry. Esta correlación se atribuye a las propiedades físicas de la lignina como hidrofobicidad 24, la heterogeneidad química, y la ausencia de intermonomeric hidrolizable regulares vínculos 25.

En este estudio, una técnica dsRNAi indujo diversos niveles del gen baja regulación en objetivos genéticos. La lignina baja regulación, mediada por un ZmCCR1_RNAi construir, ha dado lugar a la coloración marrón-en líneas transgneic T1. Brown-nervadura central (BM) coloración es un fenómeno natural que es causada por un contenido reducido de lignina y la composición de lignina alterado. A diferencia de otros de forma natural occurrmutantes bm ed, que muestran la coloración marrón sólo en la hoja de mediados de los nervios, las líneas mutantes ZmCCR1_RNAi revelaron el fenotipo en otras partes de la planta, incluyendo los tallos y cáscaras. El ensayo histológico indicó también que el espesor de pared de células de esclerénquima ZmCCR1 hojas regulados hacia abajo-fue mucho menor que los de las plantas de control de tipo salvaje (Figura 2A). Sin embargo, no se ha cambiado el espesor sturucture y la pared celular de los principales sistemas vasculares inclduing vasos del xilema, floema, o células de la vaina. Esto podría explicar el crecimiento normal de las líneas transgénicas ZmCCR1_RNAi que crecieron normalmente en términos de altura de planta y diámetro del tallo.

Una reducción de más del 20% en el contenido de lignina en general ha causado una pérdida de biomasa y hecho las plantas más vulnerables frente a los patógenos microbianos y plagas 27,28. Sin embargo, las líneas mutantes producidos en esta investigación, que expresan menos de un 10% de lignina reductisobre, no comprometer la biomasa de las plantas y el mecanismo de defensa contra el estrés abiótico y biótico.

Estudios anteriores han demostrado que las líneas de tabaco transgénicas con reducido significativamente la expresión de CCR también mostraron un aumento de otros constituyentes de la pared celular, tales como glucosa, xilosa, y compuestos fenólicos de pared determinada (por ejemplo, ácidos sinápico y ferúlico). En este estudio, la reducción de la lignina leve aumentó el nivel de celulosa cristalina en algunas de las plantas de maíz regulados hacia abajo-ZmCCR1. Por el contrario, un mecanismo de compensación de celulosa también se observó en mutantes de Arabidopsis que mostraban lignificación ectópico cuando los genes de síntesis de celulosa eran defectuosas 35. Los cambios cuantitativos o cualitativos de un componente de carbohidratos de la pared celular, induce la alternancia de otros componentes 36. Tales mechansims compensación son importantes favorece el mantenimiento de la homeostasis de los sistemas vasculares de la planta. Sin embargo, en este estudio, hemicelluloses no mostraron cambios estadísticamente significativos en ZmCCR1 líneas mutantes-regulado por. Este resultado puede ser debido a la reducción de la lignina observado no era suficiente para activar la síntesis de hemicelulosa adicional.

La disminución del nivel de la lignina y la celulosa cristalina nivel aumentado sería doblemente beneficioso para la producción de biocombustibles. El contenido de lignina más bajos requerirían menos insumos (por ejemplo, H 2 SO 4, celulasas, etc) durante el proceso y facilitar el proceso de conversión de biomasa. La celulosa adicional puede aumentar el rendimiento de azúcares fermentables. La manipulación genética de ZmCCR1 se detalla en este estudio se puede implementar para ayudar a que bimoass lignocelluosic bioetanol derivado más competitivos en el mercado.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgements

La imagen microscópica se realizó a través de los servicios del Centro de la Universidad Estatal de Michigan de Microscopía Avanzada. Callos de maíz fue adquirido desde el Centro de Transformación de maíz de Iowa State University. Los autores desean agradecer a Jeffrey R. Weatherhead del Laboratorio de Investigación de Plantas MSU por su asistencia técnica en el análisis de carbohidratos. Esta investigación fue generosamente financiado por el Programa de Maíz de Marketing de Michigan (CMPM) y el Consorcio para la Investigación de Biotecnología Vegetal (CPBR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
N6OSM (Osmotic medium) Made in-house
N6E (Callus induction) Made in-house
N6S media (Selection media) Made in-house
Regeneration medium Made in-house
Rooting medium Made in-house
10% Neutral buffered formalin (1 L) Made in-house
Bio-Rad PSD-1000/He Particle Delivery device Hercules, CA, United States
Zeiss PASCAL confocal laser scanning microscope Carl Zeiss, Jena, Germany For brightfield microscopy, the images were recorded using a Zeiss (Jena, Germany) PASCAL confocal laser scanning microscope with a 488 nm excitation mirror, a 560 nm emission filter, and a 505-530 nm emission filter. Image analysis was performed using Laser scanning microscope PASCAL LSM version 3.0 SP3 software.
Excelsior ES Tissue Processor Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States
HistoCentre III Embedding Station Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States
Microtome Model Reichert 2030 Reichert, Depew, NY, United States
Emscope Sputter Coater model SC 500 Ashford, Kent, England
JEOL JSM-6400V Scanning Electron Microscope JEOL Ltd., Tokyo, Japan
Fitzpatrick JT-6 Homoloid mill Continental Process Systems, Inc., Westmont, IL
MA35 Moisture Analyzer Sartorius
Critical point dryer, Balzers CPD Leica Microsysstems Inc, Buffalo Grove, IL, United States
Screw-top high pressure tubes Ace Glass, Vineland, NJ #8648-27
Screw-top high pressure tube plugs Ace Glass, Vineland, NJ #5845-47

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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