एक तीन आयामी (3 डी) मॉडल का उपयोग कर स्तन कैंसर कोशिका invasiveness की मात्रा

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Summary

यह लेख स्तन कैंसर सेल आक्रमण यों की तीन आयामी (3 डी) assays के उपयोग के लिए विस्तृत तरीके प्रदान करता है. विशेष रूप से, हम कोशिकाओं पर आक्रमण होता है कि जब झिल्ली अखंडता के नुकसान की जांच करने के लिए इस तरह के assays स्थापित करने के लिए आवश्यक प्रक्रियाओं, मात्रा का ठहराव, और डेटा विश्लेषण, साथ ही तरीकों पर चर्चा की.

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Cvetković, D., Goertzen, C. G., Bhattacharya, M. Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model. J. Vis. Exp. (88), e51341, doi:10.3791/51341 (2014).

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Abstract

अब यह अच्छी तरह सेलुलर और ऊतक microenvironment ट्यूमर दीक्षा और प्रगति को प्रभावित महत्वपूर्ण नियामकों हैं कि जाना जाता है. इसके अलावा, बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) विवो में संस्कृति और homeostasis में सेल व्यवहार का एक महत्वपूर्ण नियामक होना प्रदर्शित किया गया है. दो आयामी (2 डी) पर संवर्धन कोशिकाओं के वर्तमान दृष्टिकोण, कोशिकाओं और उनके microenvironment के बीच जटिल संबंधों की अशांति और नुकसान में प्लास्टिक की सतहों का परिणाम है. तीन आयामी (3 डी) संस्कृति assays के उपयोग के माध्यम से, सेल microenvironment बातचीत के लिए शर्तों में विवो microenvironment जैसी स्थापित कर रहे हैं. इस अनुच्छेद के आसपास के वातावरण में सेल आक्रमण के आकलन में 3 डी संस्कृति के संभावित exemplifying, एक 3 डी तहखाने झिल्ली प्रोटीन मैट्रिक्स में स्तन कैंसर की कोशिकाओं को विकसित करने के लिए एक विस्तृत कार्यप्रणाली प्रदान करता है. इसके अलावा, हम इन 3 डी assays molec संकेत के नुकसान की जांच करने की क्षमता है कैसे चर्चाप्रक्रियाओं immunostaining द्वारा उपकला आकारिकी कि विनियमित ules. इन अध्ययनों से स्तन कैंसर के प्रसार के लिए आवश्यक आक्रमण के विनियमन प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण यंत्रवत विवरण की पहचान करने के लिए सहायता.

Introduction

प्रवासन और व्यक्तिगत या सामूहिक कोशिकाओं के आक्रमण कैंसर के दो पहचान हैं, और कैंसर की कोशिकाओं को 1-4 से metastatic प्रसार के लिए आवश्यक. मेटास्टेसिस आरंभ करने के लिए कैंसर कोशिकाओं की क्षमता को विस्थापित करने और कोशिकाओं के तहखाने झिल्ली नीचा करने के लिए invadopodia का उपयोग पड़ोसी ऊतकों में आक्रमण करने की उनकी क्षमता पर निर्भर करता है. Invadopodia मैट्रिक्स अपमानजनक proteases 5 की रिहाई के माध्यम से बाह्य मैट्रिक्स की गिरावट सक्षम है कि गतिशील actin युक्त मैट्रिक्स गिरावट protrusions हैं. कैंसर सेल आक्रमण कैंसर कोशिकाओं के प्रवास द्वारा पीछा मैट्रिक्स की गिरावट शामिल है और यह तीन आयामी (3 डी) मैट्रिक्स पर्यावरण 2 के पुनर्गठन के साथ है. इस प्रकार, मैट्रिक्स के माध्यम से प्रवेश करने के लिए, एक सेल अपने आकार को बदलने और बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) 2 के साथ बातचीत करनी चाहिए.

स्तन के ऊतकों अखंडता के रखरखाव कसकर controlle पर निर्भर करता हैसेल ईसीएम और सेल सेल आसंजन जंक्शनों जीन अभिव्यक्ति और उपकला polarity के विघटन को प्रभावित के बाद से डी ऊतक वास्तुकला कैंसर 6-10 की शुरुआत हो सकती है. हालांकि, इस तरह transwell कक्ष assays या घाव खरोंच assays के रूप में सबसे अधिक इन विट्रो प्रवास और आक्रमण assays के दो आयामी (2 डी) कर रहे हैं और इसलिए इन कोशिकाओं और उनके आसन्न पर्यावरण 3,6,8,11-14 के बीच जटिल बातचीत उपेक्षा. सेलुलर आकारिकी में बदलाव, सेलुलर भेदभाव, सेल मैट्रिक्स adhesions और जीन अभिव्यक्ति पैटर्न सहित काफी रूपात्मक और कार्यात्मक विविधताओं सामान्यतः 2,6,8,11 assays 2 डी में कमी कर रहे हैं कि 3 डी संस्कृतियों में संवर्धन कोशिकाओं द्वारा खोजा गया है. इस प्रकार, क्लिनिक 6-10 के लिए बुनियादी अनुसंधान में जमीन तोड़ने के निष्कर्षों का एक बेहतर अनुवाद करने के लिए अग्रणी, 3 डी assays के विवो हालत में एक अधिक शारीरिक recapitulating में काफी फायदेमंद होते हैं का उपयोग करता है. हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए, 3 डी संस्कृतियों के उपयोग के साथ प्राप्त की कई फायदे के बावजूद, इस मॉडल विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं शामिल है कि vivo में ट्यूमर microenvironment की जटिलताओं के सभी पर कब्जा नहीं कर सकते हैं. हालांकि, यह 3 डी मॉडलों में stromal कोशिकाओं को शामिल करने के लिए संभव है (उदाहरण के लिए, fibroblasts, leukocytes, और मैक्रोफेज) कैंसर कोशिका आसंजन और आक्रमण 15-17 पर ट्यूमर stromal बातचीत के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए.

ऐसे laminin और कोलेजन के रूप में ईसीएम प्रोटीन मौजूद होते हैं जब संस्कृति में स्तन उपकला कोशिकाओं सबसे प्रभावी रूप से हो जाना. यह ज्ञात, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मैट्रिक्स मिश्रण Engelbreth-होल्म-झुंड (EHS) murine ट्यूमर से प्राप्त किया गया है और Matrigel तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स 2,8 के रूप में जाना जाता है. तकनीक की संख्या तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स 2,8 में 3 डी कालोनियों के रूप में उपकला कोशिकाओं को विकसित करने के लिए स्थापित किया गया है. 3 डी तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स मॉडल घातक और गैर घातक दोनों स्तन सेल की स्थापना के लिए प्रभावी हैविकास, vivo वातावरण 18,19 में क्या हो रहा है जैसी. MCF10A कोशिकाओं गैर घातक स्तन उपकला कोशिकाओं रहे हैं. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में हो, इन कोशिकाओं को सामान्य स्तन कोशिकाओं के vivo लक्षण में प्रदर्शनी और सेल प्रसार, सेल ध्रुवीकरण, और लुमेन अंतरिक्ष 8,12,20 स्थापित करने के लिए apoptosis नियंत्रित गुजरना. इसके अलावा, 3 डी संस्कृतियों में acini बनाने MCF10A कोशिकाओं की कोशिका के नाभिक की शक्ल में और अधिक बारीकी से ऊतक में स्तन उपकला कोशिकाओं के उन monolayer 21 में सभ्य लोगों की तुलना में समान है. बिसेल और उनके सहयोगियों द्वारा अध्ययन घातक कोशिकाओं एक बेहद अव्यवस्थित phenotype प्रदर्शित के बाद से, एक laminin युक्त वातावरण में उगाया प्रसार में वृद्धि हुई है, की कमी हुई जब घातक स्तन कोशिकाओं गैर घातक स्तन कोशिकाओं से भेदभाव किया जा सकता है प्रकट करने के लिए पहले किए गए सेल करने वाली सेल आसंजन, बढ़ mesenchymal मार्करों की अभिव्यक्ति और आक्रामक संरचना की संख्या में वृद्धि 3,6,2 का गठन2.

सेल पर्यावरण की असामान्यताएं ट्यूमर गठन 20 को प्रभावित कर सकते हैं. 3D संस्कृति पद्धति को प्रभावी ढंग से ट्यूमर कोशिकाओं और अपने आसपास के वातावरण के बीच होता है कि संचार का अध्ययन करने और कैसे प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रभावित करती है इस तरह के संचार 14,20,21,23 निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह लेख, invasiveness का विश्लेषण करने के लिए 3 डी संस्कृतियों में एमडीए MB-231 स्तन कैंसर की कोशिकाओं को विकसित करने के लिए, और एक उपकला मार्कर laminin, सेल तहखाने झिल्ली 18,19,24 के एक घटक का उपयोग उपकला आकृति विज्ञान के नुकसान का अध्ययन करने के लिए एक विस्तृत कार्यप्रणाली प्रदान करता है 25. विस्तृत प्रक्रियाओं सही और reproducibly किसी भी आक्रामक कैंसर सेल द्वारा तारामय (आक्रामक) संरचना गठन यों तो और ऐसे एमडीए MB-231, Hs578T, MCF 7, या T47D के रूप में आम स्तन कैंसर कोशिका लाइनों (के लिए सीमित नहीं है की क्षमता प्रदान करते हैं ). इस प्रकार, इस परख के साथ कैसे प्रोटीन कोशिकाओं में अभिव्यक्ति या उपचार के मूल्यांकन के लिए एक मंच के रूप में सेवा कर सकते हैं समर्थक या विरोधीआक्रामक यौगिकों एक या कई कोशिकाओं द्वारा, बाह्य मैट्रिक्स गिरावट को विनियमित.

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Protocol

तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में स्तन कैंसर की कोशिकाओं का 1. तीन आयामी संस्कृति (embedment तकनीक)

  1. हैंडलिंग Matrigel तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स: 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर बर्फ पर पिघलना तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स कम तापमान पर तरल है, लेकिन कमरे के तापमान पर solidifies. बर्फ (आंकड़े 1 ए बी) पर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स रखें.
  2. एक सर्पिल पैटर्न (चित्रा 1C) में एक पी 200 Pipetman की टिप का उपयोग मैट्रिक्स प्रसार के माध्यम से तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के 50 μl के साथ confocal नंबर 1 गिलास नीचे पकवान कवर. हवा के बुलबुले के गठन से बचने के तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स प्रसार समय सावधानी रखें. इसी तरह, meniscus बनने से रोकने के लिए गिलास नीचे पकवान की सीमाओं को बंद करने के लिए मैट्रिक्स को फैलने से रोकने. अनुभवहीन निपटने तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स, तो बर्फ पर हो सकता है पकवान, पी -200 Pipetman और pipettes precooled हैं (वैकल्पिक रूप से 4 डिग्री सेल्सियस पर एक फ्रिज में रात भर के लिए छोड़ दिया). यह कदम प्रस्तावsolidification से पहले तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स प्रसार करने के लिए अतिरिक्त समय. (चित्रा -1) जमना को तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स सक्षम करने के लिए कम से कम 30 मिनट के लिए (5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस) एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में (तों) रखें.
  3. मैट्रिक्स solidification के दौर से गुजर रहा है, कोशिकाओं की एक 70-80% मिला हुआ 100 मिमी थाली trypsinize. कोशिकाओं की थाली से दूर उठाने शुरू कर दिया है एक बार, trypsin (चित्रा 1E) को निष्क्रिय करने के लिए, 10% (v / v) भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) युक्त 1640 RPMI मध्यम के 10 एमएल में resuspend. फिर एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब (चित्रा 1F) में resuspended कोशिकाओं को हस्तांतरण.
  4. एक समर्पित सेल संस्कृति अपकेंद्रित्र (आंकड़े 1G-एच) में 3 मिनट के लिए 100 XG पर (शंक्वाकार ट्यूब में मौजूद) कोशिकाओं स्पिन.
  5. कोशिकाओं नीचे काता जा रहा है, एक 1 एमएल microcentrifuge ट्यूब (नोट में विभाज्य मैट्रिक्स के 50 μl: प्रत्येक गिलास तली पकवान एक microcentrifuge ट्यूब आवंटित किया जाता है, इसलिए, अगरप्रयोग, 3 व्यंजन की आवश्यकता है तो इसे) 3 microcentrifuge ट्यूबों के रूप में अच्छी तरह से जरूरी हैं कि इस प्रकार है, और फिर बर्फ (चित्रा 1 बी) पर ट्यूब जगह.
  6. (चित्रा 1 मैं) undisturbed गोली जा whilst, 1.4 कदम से शंक्वाकार ट्यूब से मध्यम Aspirate. Resuspend कोशिकाओं FBS के पूरक RPMI मध्यम (चित्रा 1J) के 1 मिलीलीटर में (नीचे काता गया है कि).
  7. कोशिकाओं microcentrifuge ट्यूब में एक hemocytometer (चित्रा 1K), या एक सेल काउंटर कण विभाज्य 2.5 x 10 4 कोशिकाओं का उपयोग कर गिना और 50 μl (चित्रा 1L) की कुल मात्रा प्राप्त करने के लिए इतनी के रूप में उपयुक्त मीडिया का उपयोग कर इसे ऊपर हो जाने के बाद.
  8. एक 1:1 के अनुपात में 1.5 कदम से मैट्रिक्स युक्त microcentrifuge ट्यूब के साथ कदम 1.7 (50 μl में 25,000 कोशिकाओं) से कोशिकाओं मिश्रण; अंतिम मात्रा 100 μl (चित्रा 1M) हो जाएगा.
  9. एस पर कदम 1.8 से सेल मिश्रण: धीरे मैट्रिक्स के 100 μl थाली1.2 चरण (चित्रा 1N) से olidified तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स लेपित पकवान. कोशिकाओं तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में एम्बेड करने के लिए अनुमति देता है.
  10. (5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस) सेल कल्चर इनक्यूबेटर में (तों) हस्तांतरण और मैट्रिक्स की अनुमति: सेल मिश्रण में कम से कम 30 मिनट के लिए जमना करने के लिए.
  11. मैट्रिक्स एक बार: सेल मिश्रण जम जाता है, पकवान (चित्रा 1O) के लिए एफबीएस पूरक RPMI मीडिया के 2 मिलीलीटर जोड़ने और यह प्रयोग (चित्रा 1P) के शेष के लिए संग्रहीत किया जाएगा जहां इनक्यूबेटर पकवान वापस ले.
  12. (एक परख के लिए आवश्यक प्रति के रूप में या, एमडीए MB-231 कोशिकाओं के लिए परख की अवधि की लंबाई में 5 दिन है) 5 दिनों की अवधि के लिए हर दिन मीडिया बदलें.
  13. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, अंतर हस्तक्षेप विपरीत तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (चित्रा 3) में निलंबित एमडीए MB-231 कालोनियों की (डीआईसी) चित्र ले. छवि 20 प्रतिनिधि क्षेत्रों 10X उद्देश्य एक ही बार में एक दिनपांच दिन कॉलोनी morphogenesis (चित्रा -3 सी) निर्धारित करने के लिए.
  14. सेल कॉलोनी तारामय गठन (3B चित्रा) निर्धारित करने के लिए आँख बंद करके छवियों का विश्लेषण. एक कॉलोनी कोशिकाओं की अंडाकार आकृति से एक या एक से अधिक अनुमानों में माना जाता है कि अगर तारामय नहीं समझा है. आक्रामक तारामय कालोनियों का प्रतिशत निर्धारित अधिग्रहीत छवि प्रति सेल कालोनियों की कुल संख्या से तारामय कालोनियों की संख्या में विभाजित है, और फिर एक दिन के लिए 20 छवियों के तारामय कालोनियों प्रतिशत औसत की.

चित्रा 1
चित्रा 1. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (embedment तकनीक) में एमडीए MB-231 स्तन कैंसर कोशिकाओं के तीन आयामी संस्कृति. एबी) धूआं हुड में प्रदर्शन प्रयोगात्मक सेटअप () लेपित गिलास तली पकवान की. सी) अच्छी तरह का एक योजनाबद्धतहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के 50 μl कम से कम 30 मिनट के लिए जमना को मैट्रिक्स की अनुमति के लिए 5% सीओ 2) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस (एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में रखा. डी) (तों) के साथ. ई) कोशिकाओं trypsinized थे. एफ ) कक्ष शंक्वाकार ट्यूब में मौजूद. जीएच) कक्ष () एक टिशू कल्चर अपकेंद्रित्र में 3 मिनट के लिए 100 XG पर नीचे काता गया एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में resuspended थे. मैं) सेल गोली नीचे काता गया है कि. जम्मू) कक्ष () FBS के पूरक RPMI माध्यम से 1 मिलीलीटर में resuspended थे. कश्मीर) कक्ष एक hemocytometer. एल गिनती का उपयोग कर रहे थे) microcentrifuge ट्यूब में aliquoted और 50 μl की कुल मात्रा प्राप्त करने के लिए इतनी के रूप में उपयुक्त मीडिया का उपयोग बंद topped 2.5 x 10 4 कोशिकाओं. एम ) एक 1:1 के अनुपात में 1.5 कदम से मैट्रिक्स युक्त microcentrifuge ट्यूब के साथ कदम 1.7 (50 μl में 25,000 कोशिकाओं) से कोशिकाओं मिश्रण; अंतिम मात्रा 100 μ होगा.. सेल मिश्रण जम जाता है, के लिए एफबीएस पूरक RPMI मीडिया के 2 मिलीलीटर जोड़ें: मैट्रिक्स एक बार) कदम 1.2 से जम मैट्रिक्स लेपित पकवान हे पर चरण 8 से सेल मिश्रण:, एल एन) धीरे मैट्रिक्स के 100 μl थाली पकवान. पी) यह प्रयोग के शेष के लिए संग्रहीत किया जाएगा जहां इनक्यूबेटर में पकवान.

Immunofluorescence के साथ 3 डी संस्कृतियों के morphogenic विशेषताएँ 2. परीक्षा

  1. (तों) बाहर लेने से पहले (2A चित्रा), 80% मेथनॉल (लगानेवाला समाधान), और 3% गोजातीय सीरम albumin (अवरुद्ध समाधान बीएसए): एक आइस ट्रे, ठंड फॉस्फेट बफर समाधान (पीबीएस), 20% एसीटोन सेट करें इनक्यूबेटर से.
  2. बर्फ ट्रे और महाप्राण मीडिया पर (तों) प्लेस, तो ठंड पीबीएस के 2 मिलीलीटर (चित्रा 2 बी) के साथ 3x धो लो.
  3. पिछले पीबीएस धोने aspirated है एक बार, 20% एसीटोन के 2 एमएल जोड़ने: (तों) (चित्रा -2 में 80% मेथनॉल समाधान (चित्रा 2 डी) पर 20 मिनट के लिए कोशिकाओं को ठीक करने के लिए.
  4. नियतन के 20 मिनट में समाप्त होता है एक बार, कमरे के तापमान पर बर्तन वापस लाने लगानेवाला aspirate, और बाद में पीबीएस के साथ 3x धो लो. अंतिम पीबीएस धोने aspirated है एक बार, कमरे के तापमान (चित्रा 2 ई) में कम से कम 30 मिनट के लिए ब्लॉक करने के लिए (तों) के लिए 3% बीएसए के 2 मिलीलीटर जोड़ें.
  5. अवरुद्ध अवधि के दौरान अवरुद्ध बफर 3% गोजातीय सीरम albumin (BSA) में भंग (उपयुक्त कमजोर पड़ने पर) प्राथमिक (laminin वी 1:100) और माध्यमिक एंटीबॉडी की dilutions तैयार करते हैं. सेल मिश्रण: 'बीएसए + प्राथमिक एंटीबॉडी' समाधान μl 400-500 मैट्रिक्स पर सीधे जोड़ा जाना चाहिए कृपया ध्यान दें.
  6. अवरुद्ध की 30 मिनट की अवधि समाप्त हो जाने के बाद, प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ने के लिए और कमरे के तापमान (चित्रा 2 एफ) में कम से कम 1 घंटे के लिए सेते हैं. कोई पीबीएस washes 30 मिनट blockin के बाद किया जाना चाहिए कृपया ध्यान दें किजी अवधि.
  7. कदम 2.6 के पूरा होने पर, 'बीएसए + प्राथमिक एंटीबॉडी' समाधान निकालने के लिए, और पीबीएस के साथ 3x धो लो.
  8. सीधे मैट्रिक्स पर (उचित कमजोर पड़ने पर) 3% BSA में भंग माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें: सेल मिश्रण, बर्तन कवर और कमरे के तापमान (चित्रा 2 जी) पर 1 घंटे के लिए सेते हैं.
  9. 'बीएसए + माध्यमिक एंटीबॉडी' समाधान निकालें, और पीबीएस के साथ 3x धो लो.
  10. नाभिक धुंधला के लिए पीबीएस में भंग Hoechst 33258 (1:10,000) के 2 मिलीलीटर जोड़ें, और एल्यूमीनियम पन्नी के तहत 5 मिनट के लिए सेते हैं (या photobleaching सीमित करने के लिए एक अपारदर्शी कंटेनर के साथ कवर) (चित्रा 2H).
  11. Hoechst 33258t साथ ऊष्मायन के 5 मिनट की अवधि समाप्त हो जाने के बाद, पीबीएस के साथ (ते) 5x पकवान धोने.
  12. सीधे मैट्रिक्स पर बढ़ते मध्यम करें: confocal डिश में सेल मिश्रण और तहखाने झिल्ली मातृ में कालोनियों की अखंडता के लिए किसी भी अवरोधों उत्प्रेरण को रोकने के लिए सावधानी से गिलास coverslip के साथ कवरएक्स: सेल मिश्रण (चित्रा 2I).
  13. (तों) कमरे के तापमान (चित्रा 2I) में रात भर (या 24 घंटे) सूखे की अनुमति दें. एक बार सूखा, (तों) -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, लेकिन यह अत्यधिक वे जितनी जल्दी संभव हो imaged किया जाना चाहिए की सिफारिश की है.
  14. (आंकड़े 3 डी ई) का इस्तेमाल किया एंटीबॉडी की उचित लेजर तरंग दैर्ध्य के साथ एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवियों मोल.

चित्रा 2
Immunofluorescence द्वारा 3 डी संस्कृतियों के चित्रा 2. परीक्षा. . ए) प्रयोगात्मक स्थापना का एक योजनाबद्ध बी) (तों) बर्फ ट्रे पर रखा जाता है और मीडिया aspirated; . बाद में कोशिकाओं ठंड पीबीएस के 2 मिलीग्राम सी) 2 मिलीलीटर 20% एसीटोन के साथ तीन बार धोया गया:. 80% मेथनॉल समाधान डी) के लिए कोशिकाओं को ठीक करें (तों) में जोड़ा4 डिग्री सेल्सियस (या तो बर्फ पर, या एक रेफ्रिजरेटर में) 20 मिनट. ई) 3% बीएसए के 2 मिलीलीटर कमरे के तापमान पर कम से कम 30 मिनट के लिए ब्लॉक करने के लिए (तों) में जोड़ा. एफ) 30 मिनट के बाद अवरुद्ध समाप्त हो गई है, प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ने के लिए और कमरे के तापमान पर कम से कम 1 घंटे के लिए सेते जी) () उपयुक्त कमजोर पड़ने पर 3% BSA में भंग माध्यमिक एंटीबॉडी तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स पर सीधे जोड़ा गया:. सेल मिश्रण; . बाद में बर्तन कवर और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए incubated एच) Hoechst के 2 मिलीलीटर (1:10,000, पीबीएस में भंग) एल्यूमीनियम पन्नी के तहत 5 मिनट के लिए incubated dishe (ते) और कोशिकाओं को जोड़ा आई) बढ़ते मध्यम सीधे गयी. मैट्रिक्स पर: confocal पकवान और डिश में सेल मिश्रण गिलास coverslip के साथ कवर किया जाता है. (तों) कमरे के तापमान पर रातोंरात (या 24 घंटे) सूखी छोड़ दिया.

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Representative Results

3 डी मैट्रिक्स में हमलावर एमडीए MB-231 कोशिकाओं का एक उदाहरण चित्रा -3 सी में सचित्र है. कोशिकाओं मैट्रिक्स (दिवस 1) में एम्बेडेड, और 3 दिन से आक्रामक (तारामय) संरचनाओं बनाने शुरू, और पूरी तरह से दिन 5 (चित्रा -3 सी) द्वारा मैट्रिक्स में आक्रमण कर रहे हैं. गठन तारामय कालोनियों की संख्या गिना, और (इनवेसिव और गैर इनवेसिव) पकवान प्रति कालोनियों की कुल संख्या का एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त कर रहे हैं. माप पांच दिनों के लिए दैनिक काम कर रहे हैं के बाद से ही, आक्रमण की दर का भी मूल्यांकन किया जा सकता है.

Morphogenetic घटनाओं की एक समय की स्थापना इन assays में कई मानकों का परीक्षण करने के लिए एक आधार प्रदान करता है. उदाहरण के लिए, स्तन कैंसर की कोशिकाओं को cytoskeletal फिर से व्यवस्था को बढ़ावा देने सकता है कि कैंसर रोधी दवाओं या दवाओं के साथ इलाज किया जा सकता है, और आक्रमण पर इन दवाओं के प्रभाव unstimulated कोशिकाओं और वाहन 24 नियंत्रण की तुलना में पता लगाया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, स्तन की क्षमता कर सकते हैंआक्रामक उभार के लिए फार्म का प्रमाणपत्र कोशिकाओं आनुवंशिक रूप से शाही सेना हस्तक्षेप (जैसे shRNA के रूप में) 18,24,25 का उपयोग कर एक संभावित ओंकोजीन या कम जीन अभिव्यक्ति को व्यक्त करने के लिए कोशिकाओं को संशोधित करने पर मात्रा निर्धारित किया जा सकता है.

एक प्रायोगिक उपकरण के रूप में 3 डी सेल संस्कृतियों का उपयोग करने का एक प्रमुख लाभ सेल morphological परिवर्तन के दौरान महत्वपूर्ण संकेतन अणुओं के स्थानिक और लौकिक सुविधाओं की जांच करने की क्षमता है. Immunofluorescence धुंधला उपयोग करके, इन अणुओं की अभिव्यक्ति नेत्रहीन 3D संस्कृति के भीतर पाया जा सकता है. चित्रा 3E में, हम झिल्ली अखंडता और तहखाने झिल्ली प्रोटीन laminin वी 24 फैलाना स्थानीयकरण का नुकसान प्रदर्शित एमडीए MB-231 कोशिकाओं के प्रतिनिधि आक्रामक (तारामय) कालोनियों दिखा. स्तन कैंसर की कोशिकाओं में मनाया जाता है के विपरीत में, laminin वी अनुपचारित गैर घातक MCF10A कोशिकाओं के स्तन acini (चित्रा enclosing एक अक्षुण्ण तहखाने झिल्ली परत के लिए स्थानीयकृत किया गया था3E) 24.

चित्रा 3
चित्रा 3. छवि अधिग्रहण और प्रतिनिधि छवियों का चित्रण. ए) एक खुर्दबीन के साथ लिया छवियों. बी) अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) इमेजिंग खुर्दबीन छवियों को प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है और बाद में छवियों (एक बार एक दिन में ले लिया के लिए एमडीए MB-231 कोशिकाओं की छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर. सी) नमूना प्रतिनिधि डीआईसी छवियों का उपयोग विश्लेषण पांच दिन) दिखाए जाते हैं. एक तरह से एनोवा Dunnett के एकाधिक तुलना परीक्षण के बाद: *, पी <0.05. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग स्केल बार, 100 माइक्रोन. डी) छवि अधिग्रहण. ई) एमडीए MB-231 में laminin वी स्थानीयकरण (5 दिनों के लिए हो) और 12 दिनों के लिए हो MCF10A कोशिकाओं () चित्रण नमूना Immunofluorescent चित्र दिखाया जाता है. स्केल बार, 20 माइक्रोन.

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Discussion

3 डी सेल कल्चर तकनीक के विकास के शोधकर्ताओं ने हमें नाटकीय रूपात्मक परिवर्तन कल्पना करने की इजाजत दी, स्तन उपकला कोशिकाओं के परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए अनुमति दी गई है. सेल आक्रमण का विश्लेषण करने के अलावा, एक या बहुकोशिकीय स्तन उपकला spheroids सेलुलर आसंजन, प्रसार, आकार, और बेसल शिखर ध्रुवता में परिवर्तन का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. कोशिकाओं ईसीएम 8 के साथ मढ़ा जाता है जहां पहले की रिपोर्ट के तरीके के विपरीत, हमारे विधि मात्रा निर्धारित किया जा करने के लिए multidirectional आक्रमण के लिए अनुमति देता है जो ईसीएम 18,19,24, में कोशिकाओं को एम्बेड करता है. ये अभिनव 3D संस्कृति मॉडल शोधकर्ताओं पारंपरिक transwell कक्ष आक्रमण assays का उपयोग, monolayer में कोशिकाओं का अध्ययन करते समय संभव नहीं है कि प्ररूपी परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए अनुमति देते हैं. सेल कालोनियों के confocal immunofluorescence विश्लेषण के साथ दोनों जैव रासायनिक और औषधीय रणनीतियों के माध्यम से शामिल, 3 डी मॉडल carefull करने की क्षमता में मदद की हैY अधिक परिष्कार और विस्तार के साथ रूपात्मक परिवर्तन का विश्लेषण. इस तकनीक को इसलिए कैंसर की दीक्षा और उन्नति को प्रभावित तंत्र की हमारी समझ furthered है.

हम confocal पकवान प्रति एमडीए MB-231 कोशिकाओं के चढ़ाना के लिए इष्टतम संख्या 25,000 कोशिकाओं होना निर्धारित किया गया था. इस सेल नंबर बढ़ाने से संभावित '(fluffing घटना' के रूप में) अत्यधिक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स गिरावट में हो सकता है, और इस प्रकार, सिफारिश नहीं होगा. अन्य मानकों समायोजित कर रहे हैं हालांकि, अगर उच्च सेल नंबर ऐसी तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स मात्रा में एक साथ वृद्धि के साथ के रूप में, काम कर सकते हैं. इसके अतिरिक्त, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स मिश्रण एक बैच से दूसरे एकाग्रता में भिन्न हो सकती हैं. इस प्रकार यह शुरू में 3 डी assays में गैर घातक स्तन उपकला कोशिकाओं के सामान्य morphogenesis को बनाए रखने की क्षमता के लिए मिश्रण का परीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण है. 3 डी संस्कृतियों जब इमेजिंग, अद्वितीय समस्याएं हैं कि उठताmonolayer में उगाया संस्कृतियों जब इमेजिंग उपस्थित नहीं. ध्यान के विमान के बाहर स्थित अगर जब इमेजिंग तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में उगाई कालोनियों बहु आयामी हैं यह देखते हुए कि, पूरे संरचनाओं याद किया जा सकता है. यह कई विमानों में लिया जाना है और इस तरह 3 डी कॉलोनी के प्रत्येक व्यक्ति आक्रामक संरचना imaged किया जा सकता छवियों कि सक्षम confocal जेड के ढेर का उपयोग इमेजिंग से दूर है.

80% मेथनॉल समाधान ऐसे ट्राइटन-X समाधान के साथ paraformaldehyde के रूप में अन्य फिक्सिंग एजेंटों का उपयोग की तुलना में, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में एम्बेडेड कालोनियों फिक्सिंग के लिए इष्टतम एजेंट है: हम भी 20% एसीटोन कि निर्धारित किया है. मेथनॉल लगानेवाला immunolabeling में सुधार और पृष्ठभूमि autofluorescence को कम करता है: हम एसीटोन कि मिल गया है. हालांकि, धुंधला प्रक्रिया का अनुकूलन आम तौर पर monolayer धुंधला के लिए कार्यरत लोगों से अलग हो सकता है कि आदर्श एंटीबॉडी dilutions निर्धारित करने के लिए, हर प्रयोग में आवश्यक है. अधिकांश antibodiतों monolayers पर काम है कि 3 डी immunostaining के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन समय की लंबाई भिन्न हो सकते हैं, और यह एक व्यक्ति के आधार पर निर्धारित किया जाना होगा.

Immunofluorescence पढ़ाई के लिए 3 डी संस्कृतियों इमेजिंग कुछ चुनौती 8 पैदा कर सकते हैं. कारण नमूना की मोटाई के लिए 'blurriness / graininess' की समस्या को दूर करने के लिए, कुछ कदम ऐसे नमूना के Z-ढेर प्राप्त करने या समय जोखिम बढ़ रही है, और फ्रेम संख्या औसत वृद्धि के रूप में छवि की गुणवत्ता में सुधार करने के लिए लिया जा सकता है . यह जगह एक विमान में एक छवि प्राप्त करने से गोलाकार आकृति विज्ञान की तुलना में भी (आक्रामक) तारामय भेद करने के लिए बेहद फायदेमंद है. Imaged Z-ढेर भी immunostaining दिखा नमूना के एक 3 डी छवि प्रस्तुत करने के लिए कार्रवाई की जा सकती. इसके अलावा, एमडीए MB-231 या MCF10A सेल लाइनों का उपयोग कर, समय अवधि में हम सफल गठित सेल समुच्चय हो. इस प्रकार, हम स्थान की जांच करने में सक्षम थेऔर immunofluorescence से 3 डी संस्कृतियों में सेल polarity मार्करों की अभिव्यक्ति में परिवर्तन. वैकल्पिक रूप से, सेलुलर समुच्चय तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में रखा जा रहा से पहले पूर्व गठित किया जा सकता है और ब्याज की प्रोटीन का स्थानीयकरण फिर से मूल्यांकन किया जा सकता है.

समाप्त करने के लिए, संभव आवेदनों की विविधता में आता है 3 डी संस्कृतियों का उपयोग कोशिकाओं की एक व्यापक स्पेक्ट्रम के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक गतिशील परख, कि क्या तय नमूनों में सेलुलर आकारिकी और आक्रमण में परिवर्तन के मूल्यांकन के लिए अनुमति देने के मूल में रोग और / या सामान्य या वास्तविक समय 18,19,24 में.

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Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 ml tubes VWR CA10011-700 Sterile, disposable
100-mm culture dish BD353003 VWR CABD353003 Sterile, disposable
15 ml Falcon tube VWR CA21008-918 Sterile, disposable
1 ml filtered tips VWR 10011-350 Sterile, disposable
200 μl filtered tips VWR 22234-016 Sterile, disposable
20 μl filtered tips VWR 22234-008 Sterile, disposable
35-mm glass-bottomed Confocal No.1 culture dishes  MatTek Corporation P35G-1.0-14-C Precooled before use
Bovine serum albumin (BSA) BioShop ALB003.100 Used at 3% for IF
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed Life Technologies  A11029 1:250 for IF
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody Life Technologies  A11011 1:1,200 for IF
Anti-Beta-Catenin  BD Transduction Laboratories 610153 Mouse-monoclonal; Used at 1:100 for IF
Fetal bovine serum (FBS) Sigma F1051 Used at 10% (v/v) 
Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) - 10 mg⁄ml Solution in Water Life Technologies H3569 Used at 0.1% (1:10,000 dilution)
InVivo Analyzer Suite  Media Cybernetics Used for 3D culture imaging (DIC images at 10X and 40X)
Kisspeptin-10 (KP-10) EZ Biolabs PT0512100601 Used at 100 nM 
Anti-Laminin  Cedarlane AB19012(CH) Rabbit-polyclonal full length human; Used at 1:100 for IF
LSM-510 META laser scanning microscope  Zeiss Used at 63X objective; oil immersion lens
Matrigel phenol red free (BD356237) VWR CACB356237  Lot No.2180819; 10.4 mg/ml
Olympus IX-81 microscope  Olympus Used for 3D culture imaging (DIC images at 10X and 40X)
Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml) Life Technologies 15140-122 Antibiotic (added to media; used at 0.01%)
10 ml pipette VWR CA53300-523 Sterile, disposeable
RPMI 1640 Medium with Glutamine Life Technologies 11875-119 Used for culturing of MDA-MB-231 cells
0.25% Trypsin-EDTA (1x), Phenol Red Life Technologies 25200-072 Used to trypsinize MDA-MB-231 cells
MEGM (bullet kit): MEBM (CC3151)+Single quots (CC4136) Lonza CC-3150 Used for culturing of MCF10A cells

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References

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