Количественное определение клеток рака молочной железы инвазивности Использование трехмерной (3D) модель

* These authors contributed equally
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Эта статья содержит подробные методологии использования трехмерных (3D) анализах для количественного вторжение клеток рака молочной железы. В частности, мы обсудим процедуры, необходимые для настройки таких анализах количественную и анализа данных, а также методы для изучения потерю целостности мембраны, которая возникает, когда клетки вторгнуться.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Cvetković, D., Goertzen, C. G., Bhattacharya, M. Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model. J. Vis. Exp. (88), e51341, doi:10.3791/51341 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

В настоящее время хорошо известно, что клеточной и тканевой микросреда являются важнейшими регуляторами, влияющие инициации и прогрессии опухоли. Кроме того, внеклеточного матрикса (ECM) было продемонстрировано, чтобы быть критическим регулятором поведения клеток в культуре и гомеостаза в естественных условиях. Нынешний подход культивирования клеток на двумерной (2D), пластиковые поверхности приводит к нарушению и потери сложных взаимодействий между клетками и их микросреды. Благодаря использованию трехмерной (3D) Культура анализов, условия для клеток микроокружения взаимодействия устанавливаются напоминающие микросреды в естественных условиях. В данной статье приводится подробная методика расти клетки рака молочной железы в матрице 3D базальной мембраны белка, иллюстрирующих потенциал 3D культуры в оценке вторжения клеток в окружающую среду. Кроме того, мы обсудим, как эти 3D анализы есть потенциал, чтобы изучить потерю Molec сигнализацииULES которые регулируют эпителиальных морфологию по иммуноокрашивания процедуры. Эти исследования помогают определить важные механистические детали в процессы, регулирующие вторжение, необходимых для распространения рака молочной железы.

Introduction

Миграция и вторжение в индивидуальных или коллективных клеток два клейма рака, и требуется для метастазирования раковых клеток 1-4. Способность раковых клеток, чтобы инициировать метастазов зависит от их способности к миграции и вторжение в соседнюю ткань с использованием invadopodia деградировать базальную мембрану клеток. Invadopodia динамические актина богатых деградации матрица выступы, которые позволяют деградацию внеклеточного матрикса через выпуск матричных разрушающих протеаз 5. Вторжение Раковая клетка включает деградацию матрицы с последующим миграции раковых клеток, и это сопровождается реорганизацией трехмерное (3D) матрицы среды 2. Таким образом, чтобы проникнуть через матрицу, клетка должна преобразовывать свою форму и взаимодействуют с внеклеточным матриксом (ECM) 2.

Поддержание целостности ткани молочной железы зависит от плотно Controlleд архитектура ткани с клеточной ECM и межклеточной адгезии переходы влиять на экспрессию генов и разрушение эпителиальной полярности может привести к возникновению рака 6-10. Тем не менее, большинство в пробирке миграции и вторжения анализы, такие как Transwell камерных анализов или рана царапин анализов являются двумерные (2D) и, следовательно, они пренебрегают сложные взаимодействия между клетками и их прилегающей среды 3,6,8,11-14. Значительные морфологические и функциональные различны в том числе изменений в клеточной морфологии, клеточной дифференцировки, клетка-матрикс спаек и паттернов экспрессии генов были обнаружены путем культивирования клеток в 3D культур, которые обычно отсутствуют в 2D анализах 2,6,8,11. Таким образом, использует 3D-анализов значительно полезным в обобщал более физиологичным в естественных состоянии, что приводит к лучшему переводе новаторских находок в фундаментальных исследованиях в клинику 6-10. Тем не менее, следует отметить,, Несмотря на многие преимущества, полученных с использованием 3D-культур, эта модель не может учесть все сложности в естественных условиях опухоли микроокружения, что включает в себя различные типы клеток. Тем не менее, можно включить стромальных клеток в 3D-модели (например, фибробласты, лейкоциты и макрофаги) для изучения влияния опухолевых-стромальных взаимодействий на адгезии раковых клеток и вторжения 15-17.

Грудные эпителиальные клетки в культуре расти наиболее эффективно, когда ECM белки, такие как ламинин и коллагена присутствуют. При этом известно, имеющийся в продаже матрица смесь была получена из Engelbreth-Холм-Рой (EHS) мышиного опухоли и известен как Матригель базальной мембраны матрицы 2,8. Ряд методов были созданы расти эпителиальные клетки как 3D колоний в базальной мембраны матрицы 2,8. В подвале матричная модель 3D мембрана является эффективным для установления и злокачественной и не злокачественной клетки грудирост, напоминающее то, что происходит в окружающей среде в естественных 18,19. MCF10A клетки доброкачественных эпителиальные клетки молочной железы. При выращивании в базальной мембраны матрицы, эти клетки демонстрируют в естественных черт нормальных клеток молочной железы и пройти под контролем пролиферации клеток, клеток поляризацию, и апоптоз о создании просвета пространство 8,12,20. Кроме того, внешний вид ядрах клеток MCF10A клеток, образующих ацинусов в 3D культур больше напоминают те из эпителиальных клеток молочной железы в ткани, чем те, культивировали в монослое 21. Исследования Бисселл и коллегами были первыми, чтобы показать, что злокачественные клетки молочной железы могут быть дифференцированы от доброкачественных клеток молочной железы при выращивании в ламинином богатых окрестностях, так как злокачественные клетки отображать высоко дезорганизованы фенотип, увеличение распространения, снижение клетки к клеточной адгезии, повышенная экспрессия мезенхимальных маркеров и увеличение числа инвазивного структуру, образованную 3,6,22.

Аномалии окружающей среды клеток может влиять на формирование опухоли 20. Способ 3D культура может быть использована для эффективной изучить взаимодействие, которое происходит между опухолевыми клетками и окружающей их среды и определить, как влияет на экспрессию белка такой 14,20,21,23 связи. В данной статье приводится подробная методика расти MDA-MB-231 клеток рака молочной железы в 3D культур для анализа инвазивность и учиться потерю эпителиального морфологии с использованием эпителиальных маркеров ламинин, компонент клеточной базальной мембраны 18,19,24, 25. Подробное описание процедур обеспечивают возможность точно и воспроизводимо количественно звездчатый (инвазивный) формирование структуры на любой инвазивной раковой клетки и не ограничивая этим клеточных линий рака молочной железы общий (например, MDA-MB-231, HS578T, MCF-7 или T47D ). Таким образом, этот анализ может служить в качестве платформы для оценки того, как экспрессии белка в клетках или лечение с про-или анти-инвазивные соединения регулируют внеклеточный деградации матрицы, по одной или нескольких клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Трехмерная Культура клеток рака молочной железы в базальной мембраны Matrix (анкеровки Техника)

  1. Обращение Матригель базальной мембраны матрица: Оттепель на льду в течение ночи при 4 ° С. Базальная мембрана матрица является жидкостью при низкой температуре, но затвердевает при комнатной температуре. Держите базальной мембраны матрицу на льду (фиг.1А-B).
  2. Накройте конфокальной № 1 со стеклянным дном блюдо с 50 мкл базальной мембраны матрицы с помощью распространения матрицу с помощью кончика Р-200 Pipetman в виде спирали (рис. 1в). Соблюдайте осторожность при распространении базальной мембраны матрицу, чтобы избежать образования воздушных пузырей. Кроме того, во избежание распространения матрицу к близко к границам стеклянным дном блюдо, чтобы предотвратить образование мениска. Если неопытный обработка базальная мембрана матрица, то предварительно охлажденный блюдо, P-200 Pipetman и пипетки может быть на льду (в качестве альтернативы оставили на ночь в холодильнике при 4 ° С). На этом этапе предложениядополнительное время для распространения базальной мембраны матрицу до затвердевания. Место блюдо (адреса) в инкубаторе для клеточных культур (при 37 ° С с 5% СО 2) в течение не менее 30 мин для того, чтобы базальной мембраны матрицу, чтобы укрепить (рис. 1D).
  3. В то время как матрица претерпевает затвердевание, Trypsinize 70-80% сливной 100-мм пластины клеток. Как только клетки начали подъема от пластины, ресуспендируют их в 10 мл среды RPMI 1640 среде, содержащей 10% (объем / объем) фетальной бычьей сыворотки (FBS), чтобы инактивировать трипсин (рис. 1E). Затем передавать ресуспендировали клетки в 15 мл коническую пробирку (рис. 1F).
  4. Вращайте клетки (присутствующие в конической трубе) при 100 мкг в течение 3 мин в специальной культуры клеток центрифуги (рис. 1G-H).
  5. В то время как клетки центрифугировали время, аликвоту 50 мкл матрицы в 1 мл микроцентрифужных трубки (примечание: каждый стеклянным дном тарелки выделяется один микроцентрифужную пробирку, следовательно, еслиэксперимент требуется 3 блюда, то из этого следует, что 3 микроцентрифужные пробирки необходимы, а), а затем поместить трубку на льду (рис. 1В).
  6. Аспирируйте среды из коническую пробирку со стадии 1.4, в то время как оставляя осадок ненарушенных (рис. 1I). Ресуспендируют клеток (которые были центрифугировали) в 1 мл FBS-дополненной RPMI среде (рис. 1j).
  7. После того, как клетки подсчитывают с помощью гемоцитометра (рис. 1K) или встречный аликвоты клеток частиц 2,5 х 10 4 клеток в микроцентрифужных трубки и довершение всего с помощью соответствующего средства массовой информации так, чтобы получить общий объем 50 мкл (рис. 1 л).
  8. Смешайте клетки от стадии 1.7 (25000 клеток в 50 мкл) с матрицей, содержащей микроцентрифужных трубки с шагом 1,5 в соотношении 1:1; Конечный объем будет 100 мкл (Рисунок 1M).
  9. Осторожно пластина 100 мкл матрицы: смесь клеток из стадии на 1,8 секolidified базальной мембраны матрица покрытием блюдо с шага 1.2 (рис. 1 н). Это позволяет клетки для встраивания в базальной мембраны матрицы.
  10. Передача блюдо (адреса) в инкубаторе для клеточных культур (при 37 ° С с 5% CO 2) и позволяют матрица: смесь клеток затвердеть в течение по крайней мере 30 мин.
  11. После того, как матрица: смесь клеток затвердевает, добавить 2 мл FBS-дополненных RPMI СМИ к блюду (Рисунок 1O) и возьмите блюдо назад инкубатор, где она будет храниться в течение оставшейся части эксперимента (рис. 1P).
  12. Изменение носитель каждый день в течение 5 дней (или в соответствии с требуется для анализа; продолжительность анализа на MDA-MB-231 клеток 5 дней в длину).
  13. Использование светового микроскопа, принять дифференциального интерференционного контраста (DIC) изображения колоний MDA-MB-231, взвешенных в базальной мембраны матрицы (рис. 3А). Image 20 репрезентативных районов в 10 раз Цель раз в деньв течение пяти дней, чтобы определить колонии морфогенез (рис. 3C).
  14. Анализ изображений слепо определить колонии клеток образование звездчатый (рис. 3б). Колония считается севрюга, если один или более выступов от сфероида клеток воспринимаются. Чтобы определить процент инвазивных колоний звездчатых, разделить количество звездчатых колоний общего числа клеточных колоний на получившемся изображении, а затем усреднить звездчатые колонии процент 20 изображений на каждый день.

Рисунок 1
Рисунок 1. Трехмерная культуру MDA-MB-231 клеток рака молочной железы в базальной мембраны матрицы (техника посадки). А.Б.) Схема экспериментальной установки (выполненного в вытяжной шкаф). C) а из стеклянным дном блюдо с покрытием50 мкл базальной мембраны матрицы. D) Dish (а) помещают в инкубаторе для клеточных культур (при 37 ° С с 5% CO 2), чтобы разрешить матрицу затвердеть в течение по крайней мере 30 мин обрабатывали трипсином. E) клеток. F ) Клетки ресуспендировали в 15 мл коническую пробирку. GH) Клетки (присутствующие в коническую пробирку) центрифугировали при 100 х г в течение 3 мин в центрифуге тканевой культуры. I) Клеточный осадок J). Клетки (которые были центрифугировали) ресуспендировали в 1 мл FBS-дополненной RPMI среде. K) Клетки подсчитывали с помощью гемоцитометра. L) 2,5 х 10 4 клеток на аликвоты в центрифужную пробирку и завершенный с помощью соответствующего средства массовой информации так, чтобы получить общий объем 50 мкл. M ) Смешать клетки от стадии 1.7 (25000 клеток в 50 мкл) с матрицей, содержащей микроцентрифужных трубки с шагом 1,5 в соотношении 1:1; Конечный объем будет 100 μ.; Л N) Осторожно пластина 100 мкл матрицы: смесь клеток из стадии 8 на затвердевшего матрицы покрытием блюдо из стадии 1,2 O) После того, как матрица: смесь клеток затвердевает, добавляют 2 мл FBS-дополненной RPMI массовой информации. блюдо. Р) Место блюдо в инкубаторе, где она будет храниться в течение оставшейся части эксперимента.

2. Экспертиза морфогенный Особенности 3D культур с иммунофлуоресценции

  1. Установка фразу лоток, холодный растворе с фосфатным буфером (PBS), 20% ацетон: 80% метанол (фиксирующий раствор), а 3% бычьего сывороточного альбумина (BSA; блокирующий раствор) (рис. 2а) до вынимая блюдо (адреса) из инкубатора.
  2. Место блюдо (адреса) на лед в трее и аспирации СМИ, затем промыть 3 раза с 2 мл холодной PBS (рис. 2В).
  3. После того, как последний PBS мытья отсасывают, добавить 2 мл 20% ацетона: 80% раствор метанола в блюдо (ов) (рис. 2С (рис. 2D).
  4. После 20 мин фиксации прекращается, довести посуду обратно при комнатной температуре, аспирации фиксатор, а затем промыть 3 раза с PBS. После того, как окончательный мытья PBS отсасывают, добавить 2 мл 3% БСА к блюду (ов), чтобы заблокировать в течение по крайней мере 30 мин при комнатной температуре (рис. 2Е).
  5. В течение периода блокировки подготовки разведений первичного (ламинина V 1:100) и вторичными антителами (при соответствующем разведении), растворенного в 3% бычьего сывороточного альбумина (BSA) блокирующем буфере. Обратите внимание, что 400-500 мкл на 'БСА + первичное антитело »решения должны быть добавлены непосредственно на матрице: смесь клеток.
  6. После 30 мин блокировки истек, добавьте первичных антител и инкубируют в течение по крайней мере 1 часа при комнатной температуре (рис. 2F). Обратите внимание, что PBS моет не следует проводить после 30 мин blockinг период.
  7. После завершения этапа 2.6, удалите 'БСА + первичное антитело "решение, и промыть 3 раза с PBS.
  8. Добавьте вторичного антитела, растворенного в 3% БСА (в соответствующем разведении) непосредственно на матрице: смесь клеток, покрыть посуду и выдержать в течение 1 часа при комнатной температуре (рис. 2G).
  9. Снимите 'BSA + вторичное антитело "решение, и промыть 3 раза с PBS.
  10. Добавить 2 мл Hoechst 33258 (1:10000), растворенных в PBS для окрашивания ядер, и инкубировать 5 мин при алюминиевой фольги (или накройте непрозрачным контейнер, чтобы ограничить фотообесцвечивания) (рис. 2H).
  11. После 5 мин инкубации с Hoechst 33258t истекли, мыть посуду (а) 5x с PBS.
  12. Добавить монтажную среду непосредственно на матрице: смесь клеток в конфокальной блюдо и накройте покровным стеклом тщательно, чтобы предотвратить вызывая каких-либо нарушений целостности колоний в базальной мембраны Матрих: смесь клеток (рис. 2I).
  13. Разрешить блюдо (ы) для высыхания на ночь (или 24 ч) при комнатной температуре (рис. 2i). После высыхания, блюдо (а) может храниться при -20 ° С, но настоятельно рекомендуется, что они должны быть отображены как можно быстрее.
  14. Получение изображений с помощью флуоресцентного микроскопа с соответствующими длинами волн лазерного антител, используемых (фиг. 3D-E).

Рисунок 2
Рисунок 2. Экспертиза 3D культур по иммунофлюоресценции. .) Схема экспериментальной установки Б) Блюдо (а) помещен на лоток льда и СМИ атмосферный; Впоследствии клетки промывали три раза с 2 мл холодного PBS C) 2 мл 20% ацетона. 80% раствор метанола добавили в чашку (ов) D) фиксации клеток на.20 мин при 4 ° С (либо на льду, либо в холодильнике). E) 2 мл 3% БСА добавлен к чашке (ов), чтобы блокировать, по крайней мере 30 мин при комнатной температуре. F) После 30 мин блокирования истекло, добавьте первичных антител и инкубируют в течение по крайней мере 1 часа при комнатной температуре G) Вторичные антитела, растворенного в 3% БСА (в соответствующем разведении) добавляли непосредственно на базальной мембраны матрицы. смесь клеток; . впоследствии блюда закрывали и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре H) 2 мл Hoechst (1:10000; растворенного в PBS) добавляется к dishe (ов) и клетки инкубируют в течение 5 мин при алюминиевой фольги I) Монтаж среда добавляется непосредственно. на матрице: смесь клеток в конфокальной блюдо и блюдо покрывается покровным стеклом. Dish (а) оставляют сохнуть в течение ночи (или 24 ч) при комнатной температуре.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Примером MDA-MB-231 клеток вторжения в 3D матрицы показана на рисунке 3C. Клетки встроены в матрицу (день 1) и начало формирования инвазивных (звездчатые) структур на 3-й день, и полностью вторжение в матрицу на 5-й день (фиг. 3C). Количество звездчатых колоний, образованных подсчитывают и выражают в процентах от общего числа колоний на чашку (инвазивных и неинвазивных). Кроме того, поскольку измерения производятся в день в течение пяти дней, скорость вторжения также может быть оценена.

Установление сроков морфогенетических событий дает основание для проверки многочисленных параметров в этих анализах. Например, клетки рака молочной железы можно лечить с помощью противораковых препаратов или наркотиков, которые могут способствовать цитоскелета перестановка, и эффекты этих препаратов на вторжения может быть установлено, по сравнению с нестимулированных клеток и органов управления автомобилем 24. С другой стороны, емкость груди можетССВ клетки образуют инвазивных выступы могут быть количественно по генетической модификации клеток выразить потенциальную онкоген или снижение экспрессии генов с помощью РНК-интерференция (например, shRNA) 18,24,25.

Основное преимущество использования 3D клеточных культур в качестве экспериментальной инструмента является возможность изучить пространственные и временные особенности важных сигнальных молекул в ходе морфологических изменений клеток. При использовании иммунофлуоресцентного окрашивания, выражение этих молекул может быть визуально обнаружен в 3D культуры. На рисунке 3Е, мы покажем представительства инвазивных (звездчатые) колонии в MDA-MB-231 клеток, воспроизводящих потерю целостности мембраны и диффузного локализации базальной мембраны белка ламинина V 24. В резком контрасте с тем, что наблюдается в раковых клетках молочной железы, ламинин V был локализован в неповрежденной слоя мембраны подвала, охватывающей молочной ацинусы неочищенных доброкачественная MCF10A клеток (рис.3E) 24.

Рисунок 3
Рисунок 3. Получение изображений и иллюстрации представительных изображений. А) Изображения, полученные с помощью микроскопа. Б) Дифференциальный интерференционный контраст (DIC) изображений микроскоп используется для получения изображений, а затем изображения анализируются с помощью программного обеспечения для анализа изображений. C) репрезентативной выборке ДИК изображения MDA-MB-231 клеток (принимать один раз в день в течение пять дней) показаны. В одну сторону ANOVA с последующим многократным сравнительного теста Даннетта: *, р <0,05. Шкала бар, 100 мкм. D) Получение изображений с помощью флуоресцентного микроскопа. Е) Образец иммунофлуоресцентные картинки, изображающие ламинин V локализацию в MDA-MB-231 (выращивали в течение 5 дней) и MCF10A клетки (выращенные в течение 12 дней) показаны. Шкала бар, 20 мкм.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Развитие 3D методы культивирования клеток позволило исследователям изучить трансформацию молочной эпителиальных клеток, что позволяет нам визуализировать драматические морфологические изменения. Кроме анализа вторжение клеток, единичные или многоклеточные эпителиальные сфероиды могут быть использованы для оценки изменений в клеточной адгезии, пролиферации, размера и базального-верхушечный полярности. В отличие от ранее представленных методологий, где клетки накладываются с ECM 8, наш метод внедряет клетки в ECM 18,19,24, что позволяет разнонаправленного вторжения быть количественно. Эти инновационные 3D модели культуры позволит исследователям изучить изменения фенотипических, которые невозможно при изучении клеток в монослое, используя традиционные Transwell камера вторжения анализов. Приемом обоих биохимических и фармакологических стратегий наряду с конфокальной иммунофлуоресцентного анализа клеточных колоний, 3D модели способствовали способность осторожныу анализировать морфологические изменения с большей изысканности и подробно. Следовательно, эта методика содействовала наше понимание механизмов, влияющих на возникновение и продвижение рака.

Мы обнаружили, что оптимальное количество для обшивки MDA-MB-231 клеток на конфокальной блюдо было определено в размере 25 000 клеток. Увеличение этого количества клеток потенциально может привести к чрезмерному базальной мембраны деградации матрицы (обозначается как "разрыхлить явления»), и, таким образом, не будет рекомендовано. Однако, более высокие числа клеток могут работать, если другие параметры регулируют, например, с сопутствующей увеличением объема матрицы базальной мембраны. Кроме того, матричные смеси базальной мембраны может изменяться в концентрации от одной партии к другой. Таким образом, важно, чтобы первоначально проверить смеси в течение его способности поддерживать нормальную морфогенез доброкачественных эпителиальных клеток молочной железы в 3D-анализах. При визуализации 3D культур, уникальные проблемы возникают, которыенет при визуализации культуры, выращенные в монослоя. Учитывая, что колонии, выращенные в базальной мембраны матрицы являются многомерными, целые структуры могут быть пропущены при визуализации, если находится за пределами плоскости фокуса. Это преодолевается визуализации с помощью конфокальной Z-стеки, которые позволяют выполнять съемку в нескольких плоскостях и, таким образом, могут быть отображены каждый отдельный инвазивной структура 3D колонии.

Мы также установили, что 20% ацетон: 80% раствор в метаноле является оптимальным агент для фиксации колоний, внедренных в матрицу базальной мембраны, по сравнению с использованием других крепежные средства, такие как параформальдегид с помощью раствора Triton-X. Мы обнаружили, что ацетон: метанол фиксатор улучшает иммунного и ведет к снижению фонового аутофлюоресценция. Тем не менее, оптимизация процедуры окрашивания требуется в каждом эксперименте, с тем чтобы определить идеальные антител разведений, которые могут отличаться от тех, обычно используют для окрашивания монослоя. Большинство antibodiэс, что работа над монослоев может быть использована для 3D иммунной окраски. Однако продолжительность времени инкубации с антителом может варьироваться, и это должны быть определены на индивидуальной основе.

Визуализация 3D культур для иммунофлюоресценции исследований может представлять некоторый вызов 8. Для того чтобы преодолеть проблему «размытость / зернистости" из-за толщины образца, некоторые шаги могут быть предприняты для улучшения качества изображения, так как приобретая Z-стеки образца или увеличения времени экспозиции, а также увеличение кадра номер среднем . Это также очень полезно, чтобы отличить звездчатых (инвазивный) по сравнению с шаровидным морфологии, а не сканировать изображение в одной плоскости. Z-стек отображаемого также могут быть обработаны, чтобы сделать 3D изображение образца, показывающих иммуноокрашивания. Кроме того, с помощью MDA-MB-231 или MCF10A клеточных линий, мы успешные, образованные клеточные агрегаты за период времени выросли. Таким образом, мы смогли изучить расположениеи изменения в экспрессии клеточной полярности маркеров в 3D культур по иммунофлюоресценции. С другой стороны, клеточные агрегаты могут быть предварительно сформирована перед помещением в базальной мембраны матрицы и локализация интерес белков затем могут быть оценены.

В заключение, разнообразие возможных применений делает использование 3D культур динамический анализ, который может быть использован с широким спектром клеток, патологический ли и / или нормально по происхождению, позволяя для оценки изменений в клеточной морфологии и инвазии в основной образцов или в режиме реального времени 18,19,24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нам нечего раскрывать.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 ml tubes VWR CA10011-700 Sterile, disposable
100-mm culture dish BD353003 VWR CABD353003 Sterile, disposable
15 ml Falcon tube VWR CA21008-918 Sterile, disposable
1 ml filtered tips VWR 10011-350 Sterile, disposable
200 μl filtered tips VWR 22234-016 Sterile, disposable
20 μl filtered tips VWR 22234-008 Sterile, disposable
35-mm glass-bottomed Confocal No.1 culture dishes  MatTek Corporation P35G-1.0-14-C Precooled before use
Bovine serum albumin (BSA) BioShop ALB003.100 Used at 3% for IF
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed Life Technologies  A11029 1:250 for IF
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody Life Technologies  A11011 1:1,200 for IF
Anti-Beta-Catenin  BD Transduction Laboratories 610153 Mouse-monoclonal; Used at 1:100 for IF
Fetal bovine serum (FBS) Sigma F1051 Used at 10% (v/v) 
Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) - 10 mg⁄ml Solution in Water Life Technologies H3569 Used at 0.1% (1:10,000 dilution)
InVivo Analyzer Suite  Media Cybernetics Used for 3D culture imaging (DIC images at 10X and 40X)
Kisspeptin-10 (KP-10) EZ Biolabs PT0512100601 Used at 100 nM 
Anti-Laminin  Cedarlane AB19012(CH) Rabbit-polyclonal full length human; Used at 1:100 for IF
LSM-510 META laser scanning microscope  Zeiss Used at 63X objective; oil immersion lens
Matrigel phenol red free (BD356237) VWR CACB356237  Lot No.2180819; 10.4 mg/ml
Olympus IX-81 microscope  Olympus Used for 3D culture imaging (DIC images at 10X and 40X)
Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml) Life Technologies 15140-122 Antibiotic (added to media; used at 0.01%)
10 ml pipette VWR CA53300-523 Sterile, disposeable
RPMI 1640 Medium with Glutamine Life Technologies 11875-119 Used for culturing of MDA-MB-231 cells
0.25% Trypsin-EDTA (1x), Phenol Red Life Technologies 25200-072 Used to trypsinize MDA-MB-231 cells
MEGM (bullet kit): MEBM (CC3151)+Single quots (CC4136) Lonza CC-3150 Used for culturing of MCF10A cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2, 563-572 (2002).
  2. Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutat Res. 752, 10-24 (2013).
  3. Shaw, K. R., Wrobel, C. N., Brugge, J. S. Use of three-dimensional basement membrane cultures to model oncogene-induced changes in mammary epithelial morphogenesis. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 9, 297-310 (2004).
  4. Eccles, S. A., Welch, D. R. Metastasis: recent discoveries and novel treatment strategies. Lancet. 369, 1742-1757 (2007).
  5. Poincloux, R., Lizarraga, F., Chavrier, P. Matrix invasion by tumour cells: a focus on MT1-MMP trafficking to invadopodia. Journal of cell science. 122, 3015-3024 (2009).
  6. Bissell, M. J., Labarge, M. A. Context, tissue plasticity, and cancer: are tumor stem cells also regulated by the microenvironment. Cancer Cell. 7, 17-23 (2005).
  7. Burgstaller, G., Oehrle, B., Koch, I., Lindner, M., Eickelberg, O. Multiplex Profiling of Cellular Invasion in 3D Cell Culture Models. PLoS One. 8, (2013).
  8. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, 256-268 (2003).
  9. Mroue, R., Bissell, M. J. Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells. Methods Mol Biol. 945, 221-250 (2013).
  10. Vidi, P. A., Bissell, M. J., Lelievre, S. A. Three-dimensional culture of human breast epithelial cells: the how and the why. Methods Mol Biol. 945, 193-219 (2013).
  11. Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Curr Opin Cell Biol. 15, 753-762 (2003).
  12. Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111, 29-40 (2002).
  13. Weaver, V. M., Bissell, M. J. Functional culture models to study mechanisms governing apoptosis in normal and malignant mammary epithelial cells. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 4, 193-201 (1999).
  14. Weaver, V. M., Howlett, A. R., Langton-Webster, B., Petersen, O. W., Bissell, M. J. The development of a functionally relevant cell culture model of progressive human breast cancer. Semin Cancer Biol. 6, 175-184 (1995).
  15. Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells to the omentum. Int J Cancer. 121, 1463-1472 (2007).
  16. Cougoule, C., et al. Blood leukocytes and macrophages of various phenotypes have distinct abilities to form podosomes and to migrate in 3D environments. European journal of cell biology. 91, 938-949 (2012).
  17. Sung, K. E., et al. Understanding the Impact of 2D and 3D Fibroblast Cultures on In Vitro Breast Cancer Models. PLoS One. (2013).
  18. Li, T. T., et al. Beta-arrestin/Ral signaling regulates lysophosphatidic acid-mediated migration and invasion of human breast tumor cells. Mol Cancer Res. 7, 1064-1077 (2009).
  19. Zajac, M., et al. GPR54 (KISS1R) transactivates EGFR to promote breast cancer cell invasiveness. PLoS One. 6, (2011).
  20. Underwood, J. M., et al. The ultrastructure of MCF-10A acini. J Cell Physiol. 208, 141-148 (2006).
  21. Lelievre, S. A., et al. Tissue phenotype depends on reciprocal interactions between the extracellular matrix and the structural organization of the nucleus. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 14711-14716 (1998).
  22. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 9064-9068 (1992).
  23. Weaver, V. M., et al. beta4 integrin-dependent formation of polarized three-dimensional architecture confers resistance to apoptosis in normal and malignant mammary epithelium. Cancer Cell. 2, 205-216 (2002).
  24. Cvetkovic, D., et al. KISS1R Induces Invasiveness of Estrogen Receptor-Negative Human Mammary Epithelial and Breast Cancer Cells. Endocrinology. 1999-2014 (2013).
  25. Alemayehu, M., et al. beta-Arrestin2 regulates lysophosphatidic acid-induced human breast tumor cell migration and invasion via Rap1 and IQGAP1. PLoS One. (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics