Kvantificering af Breast Cancer Cell invasiv Ved hjælp af en tre-dimensionel (3D) Model

* These authors contributed equally
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denne artikel indeholder detaljerede metoder til anvendelse af tre-dimensionelle (3D) assays at kvantificere brystkræft celle invasion. Konkret har vi diskutere de procedurer, der kræves for at oprette sådanne assays, kvantificering og dataanalyse, samt metoder til at undersøge tabet af membranintegritet der opstår, når celler invadere.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Cvetković, D., Goertzen, C. G., Bhattacharya, M. Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model. J. Vis. Exp. (88), e51341, doi:10.3791/51341 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Det er nu velkendt, at den cellulære og væv mikromiljø er kritiske regulatorer, der påvirker tumor initiering og progression. Desuden er den ekstracellulære matrix (ECM) er påvist at være en kritisk regulator af celle adfærd i kultur og homeostase in vivo. Den nuværende tilgang til dyrkning af celler på to-dimensionelle (2D), plastoverflader resulterer i forstyrrelse og tab af komplekse interaktioner mellem celler og deres mikromiljø. Gennem brug af tre-dimensionelle (3D) kultur assays, er betingelserne for celle-mikromiljø vekselvirkning etableret ligner in vivo mikromiljø. Denne artikel giver en detaljeret metode til at vokse brystcancerceller i en 3D-basalmembran proteinmatrix, eksemplificering potentiale 3D kultur i vurderingen af ​​celleinvasion i det omgivende miljø. Desuden diskuterer vi, hvordan disse 3D assays har potentiale til at undersøge tabet af signalering Molecbundmoduler der regulerer epitelial morfologi ved immunfarvning procedurer. Disse undersøgelser hjælpe til at identificere vigtige mekanistiske detaljer i de processer, der regulerer invasion, der er nødvendige for spredningen af ​​brystkræft.

Introduction

Migration og invasion af individuelle eller kollektive celler er to kendetegnende for kræft, og der kræves til metastatisk spredning af kræftceller 1-4. Evnen af ​​cancerceller til at indlede metastase afhænger af deres evne til at migrere og invadere de tilgrænsende væv ved hjælp af invadopodia at nedbryde basalmembranen af ​​cellerne. Invadopodia er dynamiske actin-rige matrixnedbrydning fremspring, der muliggør nedbrydning af den ekstracellulære matrix gennem frigivelse af matrix-nedbrydende proteaser 5. Kræftcelle invasion involverer nedbrydningen af matrix efterfulgt af migrationen af de kræftceller, og det er ledsaget af en reorganisering af den tre-dimensionelle (3D) matrix miljø 2. Således at trænge gennem matrixen, skal en celle ændre sin form og interagerer med den ekstracellulære matrix (ECM) 2.

Vedligeholdelsen af ​​brystvæv integritet afhænger stramt controlled vævsarkitekturen siden celle-ECM og celle-celle adhæsion vejkryds påvirke genekspression og forstyrrelse af epitelial polaritet kan føre til udbrud af kræft 6-10. Men de fleste in vitro migration og invasion assays, såsom Transwell kammer assays eller sår-scratch analyser er to-dimensionelle (2D) og dermed disse forsømmer de indviklede interaktioner mellem celler og deres tilstødende miljø 3,6,8,11-14. Betydelige morfologiske og funktionelle forskelligheder, herunder variationer i cellulær morfologi, cellulær differentiering, celle-matrix sammenvoksninger og genekspression mønstre er blevet opdaget ved dyrkning af celler i 3D-kulturer, der er almindeligt mangler i 2D-analyser 2,6,8,11. Således anvendelser af 3D-analyser er signifikant fordel i opridset en mere fysiologisk in vivo tilstand, der fører til en bedre oversættelse banebrydende resultater inden for grundforskning til klinikken 6-10. Det bør imidlertid bemærkes,På trods af de mange fordele, der opnås ved anvendelse af 3D-kulturer, kan denne model ikke fange alle de komplekse in vivo tumor mikromiljø, der omfatter forskellige celletyper. Det er imidlertid muligt at inkorporere stromaceller i 3D modeller (for eksempel fibroblaster, leukocytter og makrofager) til at studere virkningen af tumor-stroma interaktioner på kræft celleadhæsion og invasion 15-17.

Breast epitelceller i kultur vokser mest effektivt, når ECM-proteiner, såsom laminin og kollagen er til stede. Med dette kendte, har et kommercielt tilgængeligt matrixblandingen stammer fra Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) murin tumor og er kendt som Matrigel basalmembranmatrix 2,8. Der er etableret en række teknikker til at dyrke epitelceller som 3D kolonier i basalmembranmatrix 2,8. 3D basalmembranmatrix model er effektiv til oprettelse af både maligne og non-maligne bryst cellervækst, der ligner det, der sker i in vivo miljø 18,19. MCF10A celler er ikke-maligne brystepitelceller celler. Når der dyrkes i basalmembranmatrix, udviser disse celler in vivo træk af normale bryst celler og underkastes kontrolleret celleproliferation, celledifferentiering polarisering, og apoptose at etablere lumen plads 8,12,20. Desuden forekomsten af cellekerner fra MCF10A celler danner acini i 3D kulturer mere ligner dem af brystepitelceller celler i væv end dem dyrket i monolag 21.. Undersøgelser foretaget af Bissell og kolleger var de første til at afsløre, at maligne bryst celler kan skelnes fra ikke-maligne bryst celler, når de dyrkes i en laminin-rige omgivelser, da de maligne celler vise en meget uorganiseret fænotype, øget spredning, nedsat celle-til- celleadhæsion, forøget ekspression af mesenchymale markører og en stigning i antallet af invasive struktur dannet 3,6,22.

Abnormiteter i cellen miljø kan påvirke tumordannelse 20. 3D kultur metode kan bruges til effektivt at studere kommunikation, der opstår mellem tumorceller og deres omgivende miljø og bestemme, hvordan protein udtryk påvirkninger såsom kommunikation 14,20,21,23. Denne artikel giver en detaljeret metode til at vokse MDA-MB-231 brystkræftceller i 3D kulturer at analysere invasiv og undersøge tabet af epitelial morfologi ved hjælp af en epitelial markør laminin, en komponent af cellen basalmembran 18,19,24, 25.. De detaljerede procedurer giver evnen til præcist og reproducerbart kvantificere stellate (invasive) strukturdannelse af enhver invasiv cancer celle og er ikke begrænsende til de fælles brystcancercellelinjer (såsom MDA-MB-231, Hs578T, MCF-7 eller T47D ). Således kan denne analyse fungere som en platform for at vurdere, hvordan protein-ekspression i celler eller behandling med pro-eller anti-invasive forbindelser regulerer ekstracellulær matrix nedbrydning ved enkelt eller flere celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Tre-dimensionel Culture of Breast Cancer Celler i basalmembranmatrix (indlejringsprocessen Technique)

  1. Håndtering Matrigel basalmembranmatrix: optøs på is natten over ved 4 ° C. Basalmembranmatrix er flydende ved lav temperatur, men størkner ved stuetemperatur. Hold basalmembranmatrix på is (figurerne 1A-B).
  2. Dæk Konfokal No.1 glasbund fad med 50 pi basalmembranmatrix ved at sprede den matrix, med spidsen af en P-200 Pipetman i en spiral mønster (figur 1C). Vær forsigtig, når sprede basalmembranmatrix at undgå dannelse af luftbobler. Ligeledes undgå at sprede matricen til tæt på grænsen af ​​glas-bund fad for at forhindre menisken dannelse. Hvis uerfarne håndtering basalmembranmatrix, så forafkølet skålen, P-200 Pipetman og pipetter kan være på is (alternativt efterladt natten over i et køleskab ved 4 ° C). Dette trin tilbudyderligere tid til at sprede basalmembranmatrix før størkning. Skålen (r) i en cellekultur inkubator (ved 37 ° C med 5% CO 2) i mindst 30 minutter for at aktivere basalmembranmatrix at størkne (figur 1D).
  3. Mens matrixen undergår størkning Trypsinisér en 70-80% sammenflydende 100 mm plade af celler. Når cellerne er begyndt afløftning af pladen resuspendere dem i 10 ml RPMI 1640 medium indeholdende 10% (v / v) kalvefosterserum (FBS), for at inaktivere trypsin (fig. 1E). Derefter overføre resuspenderede celler i en 15 ml konisk rør (fig. 1F).
  4. Spin celler (til stede i konisk rør) ved 100 x g i 3 minutter i en dedikeret cellekultur centrifuge (figur 1G-H).
  5. Mens cellerne bliver spundet ned, portion 50 pi matrix til en 1 ml mikrocentrifugerør (bemærk: hver glas-bund fad tildelt én mikrocentrifugerør, og derfor hviseksperimentet kræver 3 retter, så følger det, at 3 mikrocentrifugerør er nødvendige, så godt), og derefter placere røret på is (Figur 1B).
  6. Aspirer mediet fra den koniske rør fra trin 1.4, samtidig med pillen uforstyrret (Figur 1I). Resuspender cellerne (der er blevet spundet ned) i 1 ml FBS-suppleret RPMI-medium (figur 1J).
  7. Når cellerne tælles ved hjælp af et hæmocytometer (figur 1K), eller en celle partikeltæller portion 2,5 x 10 4 celler i mikrocentrifugerør og top det af med passende medier for at opnå samlet volumen på 50 ul (Figur 1 l).
  8. Bland cellerne fra trin 1.7 (25.000 celler i 50 pi) med matrixen indeholdende mikrocentrifugerør fra trin 1.5 i forholdet 1:1; endelige volumen vil være 100 pi (Figur 1 mio.)
  9. Forsigtigt plade 100 pi af matrixen: celle blandingen fra trin 1.8 til solidified basalmembranmatrix-belagt skål fra trin 1.2 (fig. 1 N). Dette gør det muligt for celler at blive indlejret i basalmembranmatrix.
  10. Diglen (r) i cellekultur inkubator (ved 37 ° C med 5% CO 2) og tillade matrix: celleblanding at størkne i mindst 30 minutter.
  11. Når matrixen: Celleblandingen størknet, tilsættes 2 ml FBS-suppleret RPMI-medium i skålen (figur 1O) og tage skålen tilbage inkubatoren, hvor den vil blive gemt i den resterende del af eksperimentet (figur 1P).
  12. Skift medier hver dag i en periode på 5 dage (eller som pr kræves for en assay; varigheden af ​​analysen for MDA-MB-231-celler er 5 dage i længden).
  13. Ved hjælp af et lysmikroskop, tage forskellen interferens kontrast (DIC) billeder af MDA-MB-231 kolonier suspenderet i basalmembranmatrix (figur 3A). Billede 20 repræsentative områder ved 10X objektiv en gang om dageni fem dage for at bestemme koloni morfogenese (figur 3C).
  14. Analyser billeder blindt at bestemme cellekolonidannelse stjerneformet dannelse (figur 3B). En koloni anses for at være stjerneformet hvis én eller flere fremskrivninger fra klumpformet af celler bliver opfattet. For at bestemme den procentdel af invasive stjerneformige kolonier, dividere antallet af stjerneformige kolonier med det samlede antal af celle kolonier pr erhvervet billedet og derefter gennemsnittet af stjerneformige kolonier procentdele af de 20 billeder for hver dag.

Figur 1
Fig. 1. Tredimensionale kultur af MDA-MB-231 brystcancerceller i basalmembranmatrix (indlejringsprocessen teknik). AB) En skematisk af forsøgsopstillingen (udføres i stinkskab). C) Brønden af glas-bund fad belagtmed 50 ul basalmembranmatrix. D) Dish (r) anbringes i en cellekultur inkubator (ved 37 ° C med 5% CO 2) for at tillade, at matrixen størkne i mindst 30 min. E) Celler blev trypsiniseret. F ) Celler blev resuspenderet i en 15 ml konisk rør. GH) celler (til stede i konisk rør) blev centrifugeret ved 100 x g i 3 minutter i en vævskultur centrifuge. I) cellepellet. J) celler (der er blevet spundet ned) blev resuspenderet i 1 ml FBS-suppleret RPMI-medium. K) Celler blev talt under anvendelse af et hæmocytometer. L) 2,5 x 10 4 celler i alikvoter i mikrocentrifugerør og kronet anvendelse af passende medier for at opnå samlet volumen på 50 ul. M ) Bland cellerne fra trin 1.7 (25.000 celler i 50 pi) med matrixen indeholdende mikrocentrifugerør fra trin 1.5 i forholdet 1:1; endelige volumen vil være 100 μ.; L N) pladen forsigtigt 100 pi af matrixen: celle blandingen fra trin 8 på størknede matrix-belagt skål fra trin 1.2 O) Når matricen: Celleblandingen størknet, tilsættes 2 ml FBS-suppleret RPMI medier. skålen. P) Skålen anbringes i inkubatoren, hvor den vil blive gemt i den resterende del af forsøget.

2.. Undersøgelse af Morphogenic Funktioner af 3D-kulturer med Immunofluorescence

  1. Opsæt en is bakke, kold phosphatbufferet opløsning (PBS), 20% acetone: 80% methanol (fikseringsopløsning), og 3% bovint serumalbumin (BSA; blokerende opløsning) (figur 2A), før du tager skålen (r) fra inkubatoren.
  2. Placer fadet (r) på isen bakke og aspirere medier, vask derefter 3x med 2 ml kold PBS (figur 2B).
  3. Når den sidste vask med PBS aspireret, tilsættes 2 ml 20% acetone: 80% methanol-opløsning i skålen (r) (figur 2C (figur 2D).
  4. Når 20 min fiksering er afsluttet, sætter de retter tilbage ved stuetemperatur aspireres fiksativ og vaskes derefter 3 gange med PBS. Når den endelige vask med PBS aspireret, tilsættes 2 ml 3% BSA i skålen (r) for at blokere for mindst 30 minutter ved stuetemperatur (figur 2E).
  5. Under blokeringen periode forberede fortyndinger af primær (laminin V 1:100) og sekundære antistoffer (ved passende fortynding) opløst i 3% bovint serumalbumin (BSA) blokerende buffer. Bemærk venligst, at 400-500 pi den »BSA + primære antistof" løsning skal lægges direkte på matrix: celleblandingen.
  6. Når 30 min blokering er udløbet, tilføje de primære antistoffer og inkuberes i mindst 1 time ved stuetemperatur (figur 2F). Bemærk, at ingen PBS vask skal udføres efter 30 min blocking periode.
  7. Ved afslutningen af ​​trin 2.6, fjerne 'BSA + primære antistof "løsning, og vask 3 gange med PBS.
  8. Tilføj det sekundære antistof opløst i 3% BSA (ved passende fortynding) direkte på matricen: celleblanding dække de retter og inkuberes i 1 time ved stuetemperatur (figur 2G).
  9. Fjern 'BSA + sekundært antistof "løsning, og vask 3 gange med PBS.
  10. Tilsæt 2 ml Hoechst 33258 (1:10.000) opløst i PBS i kerner farvning, og der inkuberes i 5 min under aluminiumsfolie (eller dække med en uigennemsigtig beholder for at begrænse fotoblegning) (figur 2H).
  11. Når 5 min inkubation med Hoechst 33258t er udløbet, (r) vaske fad 5x med PBS.
  12. Tilføj montering medium direkte på matrix: celleblandingen i konfokal fad og dæk med dækglas forsigtigt for at undgå at give anledning til forstyrrelser på integriteten af ​​kolonierne i basalmembranen Matrix: celleblanding (fig. 2i).
  13. Diglen (r) til at tørre natten over (eller 24 timer) ved stuetemperatur (figur 2I). Når tør, kan fadet (r) skal opbevares ved -20 ° C, men det anbefales stærkt, at de skal blive afbildet så hurtigt som muligt.
  14. Optage billeder ved hjælp af et fluorescensmikroskop med passende laserbølgelængder af antistoffer, der anvendes (figur 3D-E).

Figur 2
Figur 2. Undersøgelse af 3D-kulturer ved immunofluorescens. . A) En skematisk af forsøgsopstillingen B) Dish (r) placeret på isen bakke og medier aspireret; derefter blev cellerne vasket tre gange med 2 ml kold PBS C) 2 ml af 20% acetone:. 80% methanolopløsning tilsat til skålen (r) D) Fastgør celler til.20 min ved 4 ° C (enten på is eller i køleskab). E) 2 ml 3% BSA tilsat til skålen (r) for at blokere for mindst 30 minutter ved stuetemperatur. F) Når 30 min blokering er udløbet, tilføje de primære antistoffer og inkuberes i mindst 1 time ved stuetemperatur G) Sekundære antistoffer opløst i 3% BSA (ved passende fortynding) blev tilsat direkte på basalmembranmatrix:. celleblanding; . efterfølgende retter dækket og inkuberet i 1 time ved stuetemperatur H) 2 ml Hoechst (1:10.000; opløst i PBS) tilsat til dishe (r), og cellerne inkuberes i 5 minutter under aluminiumsfolie I) Montering medium tilsættes direkte. på matrix: celleblandingen i konfokal skålen og skålen dækkes med dækglas. Skål (r) lov til at tørre natten over (eller 24 timer) ved stuetemperatur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Et eksempel på MDA-MB-231-celler invaderer i 3D matrix er vist i figur 3C. Cellerne er indlejret i matricen (dag 1), og begynder at danne invasive (stjerneformige) strukturer på dag 3, og helt invadere matrixen ved dag 5 (figur 3C). Tælles Antallet af stjerneformige dannede kolonier, og udtrykt som en procentdel af det samlede antal kolonier pr fad (invasive og non-invasive). Derudover, da målingerne er færdig dagligt i fem dage, satsen for invasion kan også evalueres.

Etablering af en tidslinje for morfogenetiske begivenheder giver et grundlag for at teste en lang række parametre i disse analyser. For eksempel kan brystkræftceller behandles med anti-cancer medicin eller narkotika, der kan fremme cytoskeletal re-arrangement, og virkningerne af disse lægemidler på invasion kan konstateres i forhold til de ikke-stimulerede celler og køretøj styrer 24. Alternativt kapacitet bryst kanCER-celler til at danne invasive fremspring kan kvantificeres ved genetisk ændring af cellerne til at udtrykke en potentiel onkogen eller nedsat genekspression hjælp RNA-interferens (f.eks shRNA) 18,24,25.

En stor fordel ved at bruge 3D-cellekulturer som en eksperimentel værktøj er evnen til at undersøge de rumlige og tidslige træk af vigtige signalstoffer i løbet celle morfologiske ændringer. Ved at udnytte immunofluorescensfarvning kan ekspressionen af ​​disse molekyler detekteres visuelt i 3D-kultur. I figur 3E, viser vi repræsentative invasive (stjerneformige) kolonier af MDA-MB-231-celler, der udviser et tab af membranintegritet og diffus lokalisering af basalmembranen protein laminin V 24. I skarp kontrast til det, der observeres i brystcancerceller blev laminin V lokaliseret til et intakt basalmembran lag omslutter mammae acini ubehandlede ikke-malign MCF10A-celler (figur3E) 24.

Figur 3
Erhvervelse og illustration af repræsentative billeder Figur 3.. Image. A) kontrast billeder taget med et mikroskop. B) Differential interferens (DIC) imaging mikroskop bruges til at hente billeder og efterfølgende billeder, analyseres ved hjælp af billedanalyse software. C) repræsentativ prøve DIC billeder af MDA-MB-231-celler (taget en gang om dagen for fem dage) er vist. Envejs ANOVA efterfulgt af Dunnetts multipel sammenligning test: *, p <0,05. Scale bar, 100 um. D) Billede erhvervelse med fluorescerende mikroskop. E) Prøve immunfluorescerende billeder skildrer laminin V lokalisering i MDA-MB-231 (dyrket i 5 dage) og MCF10A celler (dyrket i 12 dage) er vist. Scale bar, 20 um.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Udviklingen af ​​3D cellekultur teknikker har tilladt forskerne at studere omdannelsen af ​​bryst epitelceller, giver os mulighed for at visualisere de dramatiske morfologiske ændringer. Udover at analysere celle invasion, kan enkelt-eller flercellede brystepitelceller sphæroider bruges til at vurdere ændringer i cellulær adhæsion, spredning, størrelse og basal-apikal polaritet. I modsætning til tidligere beskrevne metoder, hvor cellerne er overlejret med ECM 8, vores metode integrerer celler i ECM 18,19,24, som giver mulighed for flerstrenget invasion kvantificeres. Disse innovative 3D kultur modeller tillader forskerne at studere fænotypiske ændringer, som ikke er mulig, når de studerer celler i monolag, ved hjælp af traditionelle invasion transwell kammer assays. Gennem inkorporering af både biokemiske og farmakologiske strategier sammen med konfokal immunfluorescens analyse af celle kolonier, har 3D-modeller lettet muligheden for at carefully analysere morfologiske forandringer med mere raffinement og smukke detaljer. Denne teknik har derfor fremmet vores forståelse af de mekanismer, der påvirker initiering og udvikling af kræft.

Vi fandt, at det optimale antal til galvanisering af MDA-MB-231 celler pr konfokal skålen blev bestemt til at være 25.000 celler. Forøgelse denne celle nummer, kan potentielt resultere i overdreven basalmembranmatrix nedbrydning (benævnt »den fnugger fænomen"), og derfor ikke ville blive anbefalet. Men højere celletal kan fungere, hvis andre parametre justeres, såsom med en ledsagende stigning i basalmembranmatrix volumen. Derudover kan basalmembranmatrix blandinger varierer i koncentration fra et parti til et andet. Derfor er det vigtigt i første omgang at teste blandingen for sin evne til at opretholde normale morfogenese af ikke-maligne brystepitelceller celler i 3D-assays. Når billeddannelse 3D kulturer, der opstår særlige problemer, der erikke til stede, når billeddannelse kulturer dyrket i monolag. Da kolonier dyrket i basalmembranmatrix er multi-dimensionelle, kan hele strukturer blive savnet når billeddannelse hvis placeret uden for flyet af fokus. Dette er overvundet af imaging hjælp konfokal Z-stakke, der giver billeder, der skal tages i flere planer, og dermed hver enkelt invasiv struktur i 3D koloni kan filmede.

Vi har også fastslået, at 20% acetone: 80% methanol-opløsning er det optimale middel til fastsættelse kolonier indlejret i basalmembranmatrix forhold til anvendelse af andre fikseringsmidler, såsom paraformaldehyd med Triton-X-opløsning. Vi har fundet, at acetone: methanol fiksativ forbedrer immunolabeling og har tendens til at reducere baggrunden autofluorescens. Imidlertid er optimering af farvning, som kræves i hvert eksperiment for at bestemme den ideelle antistoffortyndinger, der kan afvige fra dem, der typisk anvendes til monolag farvning. De fleste antibodies, at arbejdet med monolag kan bruges til 3D-immunfarvning. Længden af ​​inkubationstiden med antistoffet, kan dog variere, og det skal fastsættes på et individuelt grundlag.

Imaging 3D kulturer for immunfluorescens undersøgelser kan udgøre nogle udfordring 8.. For at overvinde problemet med "slørethed / kornethed 'på grund af tykkelsen af ​​prøven, kan tages visse skridt til at forbedre kvaliteten af ​​billedet, såsom at erhverve Z-stakke af prøveemnet eller stigende eksponering tid og øge stelnummer gennemsnit . Dette er også yderst gavnligt at skelne stellate (invasiv) i forhold til kugleformet morfologi snarere end at erhverve et billede i et plan. Z-stack filmede kan også behandles for at gengive et 3D-billede af prøven viser immunfarvning. Desuden ved hjælp af MDA-MB-231 eller MCF10A cellelinjer, vi succes dannet celleaggregater over det tidsrum vokset. Således var vi i stand til at undersøge det stedog ændringer i ekspression af celle polaritet markører i 3D-kulturer ved immunfluorescens. Alternativt cellulære aggregater kan være præ-dannet, inden det bringes i basalmembranmatrix og lokalisering af proteiner af interesse kan derefter vurderes.

Konklusionen er, at mange mulige anvendelser gør brug af 3D kulturer en dynamisk analyse, der kan bruges sammen med et bredt spektrum af celler, uanset om patologisk og / eller normal oprindelse giver mulighed for vurdering af ændringer i cellulær morfologi og invasion i faste prøver eller i realtid 18,19,24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har intet at afsløre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 ml tubes VWR CA10011-700 Sterile, disposable
100-mm culture dish BD353003 VWR CABD353003 Sterile, disposable
15 ml Falcon tube VWR CA21008-918 Sterile, disposable
1 ml filtered tips VWR 10011-350 Sterile, disposable
200 μl filtered tips VWR 22234-016 Sterile, disposable
20 μl filtered tips VWR 22234-008 Sterile, disposable
35-mm glass-bottomed Confocal No.1 culture dishes  MatTek Corporation P35G-1.0-14-C Precooled before use
Bovine serum albumin (BSA) BioShop ALB003.100 Used at 3% for IF
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed Life Technologies  A11029 1:250 for IF
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody Life Technologies  A11011 1:1,200 for IF
Anti-Beta-Catenin  BD Transduction Laboratories 610153 Mouse-monoclonal; Used at 1:100 for IF
Fetal bovine serum (FBS) Sigma F1051 Used at 10% (v/v) 
Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) - 10 mg⁄ml Solution in Water Life Technologies H3569 Used at 0.1% (1:10,000 dilution)
InVivo Analyzer Suite  Media Cybernetics Used for 3D culture imaging (DIC images at 10X and 40X)
Kisspeptin-10 (KP-10) EZ Biolabs PT0512100601 Used at 100 nM 
Anti-Laminin  Cedarlane AB19012(CH) Rabbit-polyclonal full length human; Used at 1:100 for IF
LSM-510 META laser scanning microscope  Zeiss Used at 63X objective; oil immersion lens
Matrigel phenol red free (BD356237) VWR CACB356237  Lot No.2180819; 10.4 mg/ml
Olympus IX-81 microscope  Olympus Used for 3D culture imaging (DIC images at 10X and 40X)
Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml) Life Technologies 15140-122 Antibiotic (added to media; used at 0.01%)
10 ml pipette VWR CA53300-523 Sterile, disposeable
RPMI 1640 Medium with Glutamine Life Technologies 11875-119 Used for culturing of MDA-MB-231 cells
0.25% Trypsin-EDTA (1x), Phenol Red Life Technologies 25200-072 Used to trypsinize MDA-MB-231 cells
MEGM (bullet kit): MEBM (CC3151)+Single quots (CC4136) Lonza CC-3150 Used for culturing of MCF10A cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2, 563-572 (2002).
  2. Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutat Res. 752, 10-24 (2013).
  3. Shaw, K. R., Wrobel, C. N., Brugge, J. S. Use of three-dimensional basement membrane cultures to model oncogene-induced changes in mammary epithelial morphogenesis. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 9, 297-310 (2004).
  4. Eccles, S. A., Welch, D. R. Metastasis: recent discoveries and novel treatment strategies. Lancet. 369, 1742-1757 (2007).
  5. Poincloux, R., Lizarraga, F., Chavrier, P. Matrix invasion by tumour cells: a focus on MT1-MMP trafficking to invadopodia. Journal of cell science. 122, 3015-3024 (2009).
  6. Bissell, M. J., Labarge, M. A. Context, tissue plasticity, and cancer: are tumor stem cells also regulated by the microenvironment. Cancer Cell. 7, 17-23 (2005).
  7. Burgstaller, G., Oehrle, B., Koch, I., Lindner, M., Eickelberg, O. Multiplex Profiling of Cellular Invasion in 3D Cell Culture Models. PLoS One. 8, (2013).
  8. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, 256-268 (2003).
  9. Mroue, R., Bissell, M. J. Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells. Methods Mol Biol. 945, 221-250 (2013).
  10. Vidi, P. A., Bissell, M. J., Lelievre, S. A. Three-dimensional culture of human breast epithelial cells: the how and the why. Methods Mol Biol. 945, 193-219 (2013).
  11. Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Curr Opin Cell Biol. 15, 753-762 (2003).
  12. Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111, 29-40 (2002).
  13. Weaver, V. M., Bissell, M. J. Functional culture models to study mechanisms governing apoptosis in normal and malignant mammary epithelial cells. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 4, 193-201 (1999).
  14. Weaver, V. M., Howlett, A. R., Langton-Webster, B., Petersen, O. W., Bissell, M. J. The development of a functionally relevant cell culture model of progressive human breast cancer. Semin Cancer Biol. 6, 175-184 (1995).
  15. Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells to the omentum. Int J Cancer. 121, 1463-1472 (2007).
  16. Cougoule, C., et al. Blood leukocytes and macrophages of various phenotypes have distinct abilities to form podosomes and to migrate in 3D environments. European journal of cell biology. 91, 938-949 (2012).
  17. Sung, K. E., et al. Understanding the Impact of 2D and 3D Fibroblast Cultures on In Vitro Breast Cancer Models. PLoS One. (2013).
  18. Li, T. T., et al. Beta-arrestin/Ral signaling regulates lysophosphatidic acid-mediated migration and invasion of human breast tumor cells. Mol Cancer Res. 7, 1064-1077 (2009).
  19. Zajac, M., et al. GPR54 (KISS1R) transactivates EGFR to promote breast cancer cell invasiveness. PLoS One. 6, (2011).
  20. Underwood, J. M., et al. The ultrastructure of MCF-10A acini. J Cell Physiol. 208, 141-148 (2006).
  21. Lelievre, S. A., et al. Tissue phenotype depends on reciprocal interactions between the extracellular matrix and the structural organization of the nucleus. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 14711-14716 (1998).
  22. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 9064-9068 (1992).
  23. Weaver, V. M., et al. beta4 integrin-dependent formation of polarized three-dimensional architecture confers resistance to apoptosis in normal and malignant mammary epithelium. Cancer Cell. 2, 205-216 (2002).
  24. Cvetkovic, D., et al. KISS1R Induces Invasiveness of Estrogen Receptor-Negative Human Mammary Epithelial and Breast Cancer Cells. Endocrinology. 1999-2014 (2013).
  25. Alemayehu, M., et al. beta-Arrestin2 regulates lysophosphatidic acid-induced human breast tumor cell migration and invasion via Rap1 and IQGAP1. PLoS One. (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics