Kwantificering van de Breast Cancer Cell Invasiviteit met een drie-dimensionale (3D) Model

* These authors contributed equally
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Dit artikel geeft gedetailleerde methodologieën voor het gebruik van driedimensionale (3D) assays om borstkanker cel invasie kwantificeren. Concreet bespreken we het nodig om dergelijke assays procedures, kwantificering en gegevensanalyse, alsook werkwijzen voor het verlies van membraan integriteit die ontstaat wanneer cellen binnendringen onderzoeken.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Cvetković, D., Goertzen, C. G., Bhattacharya, M. Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model. J. Vis. Exp. (88), e51341, doi:10.3791/51341 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Het is nu bekend dat de cellen en weefsels micro-omgeving zijn kritische toezichthouders beïnvloeden tumor initiatie en progressie. Bovendien heeft de extracellulaire matrix (ECM) is aangetoond dat een kritische regulator van celgedrag in cultuur en homeostase in vivo. De huidige benadering van het kweken van cellen op tweedimensionale (2D), kunststof oppervlakken leidt tot verstoring en verlies van complexe interacties tussen cellen en hun micromilieu. Door het gebruik van driedimensionale (3D) cultuur assays, worden de voorwaarden voor cel-interactie micro vastgesteld lijkt de in vivo micro-omgeving. Dit artikel geeft een gedetailleerde methodologie om borstkanker cellen groeien in een 3D basaal membraan eiwit matrix, tekenend is voor het potentieel van de 3D-cultuur in de beoordeling van de cel invasie in de omgeving. Daarnaast bespreken we hoe deze 3D assays hebben de potentie om het verlies van signalering Molec onderzochtules dat epitheliale morfologie reguleren door immuunkleuring procedures. Deze studies helpen belangrijke mechanistische informatie te verkrijgen in de processen reguleren invasie, vereist voor de verspreiding van borstkanker.

Introduction

Migratie en invasie van individuele of collectieve cellen zijn twee kenmerken van kanker, en die nodig zijn voor de metastatische verspreiding van kankercellen 1-4. Het vermogen van kanker cellen om metastase te starten hangt af van hun vermogen om te migreren en binnen te dringen in het naburige weefsel met behulp invadopodia aan de basale membraan van de cellen af ​​te breken. Invadopodia zijn dynamisch actine-rijke matrixafbraak uitsteeksels die afbraak van de extracellulaire matrix mogelijk door het vrijkomen van matrix-afbrekende proteasen 5. Kankercel invasie omvat de afbraak van de matrix gevolgd door de migratie van kankercellen en dit gepaard met een reorganisatie van de driedimensionale (3D) matrix milieu 2. Zo te dringen door de matrix, een cel moet zijn vorm veranderen en interactie met de extracellulaire matrix (ECM) 2.

Het onderhoud van het borstweefsel integriteit afhankelijk van strak controlled weefselarchitectuur aangezien cel-ECM en cel-cel adhesie verbindingen beïnvloeden genexpressie en verstoring van epitheliale polariteit kan leiden tot het ontstaan ​​van kanker 6-10. Echter, de meeste in vitro migratie en invasie assays zoals transwell kamer assays of wond krassen testen zijn tweedimensionale (2D) en bijgevolg deze verwaarlozing de wisselwerkingen tussen cellen en hun onmiddellijke omgeving 3,6,8,11-14. Aanzienlijke morfologische en functionele diversiteit, waaronder variaties in cellulaire morfologie, celdifferentiatie, cel-matrix adhesie en genexpressie patronen zijn ontdekt door het kweken van cellen in 3D culturen die vaak ontbreken in 2D-assays 2,6,8,11. Aldus gebruikt 3D assays aanzienlijk gunstig indient een fysiologische in vivo toestand, waardoor een betere vertaling baanbrekende bevindingen basisonderzoek naar de kliniek 6-10. Er moet echter worden opgemerktOndanks de vele voordelen die het gebruik van 3D culturen, dit model niet alle van de complexiteit van de in vivo tumormicromilieu dat verschillende celtypen omvat vangen. Het is echter mogelijk om stromale cellen nemen in de 3D-modellen (bijv. fibroblasten, leukocyten en macrofagen) het effect van tumor-stromale interacties over kanker celadhesie en invasie 15-17 bestuderen.

Borst epitheliale cellen in kweek groeien het meest effectief wanneer ECM eiwitten zoals laminine en collageen aanwezig zijn. Met deze bekende, is een commercieel verkrijgbaar mengsel matrix afgeleid van Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) muriene en staat bekend als Matrigel basaalmembraan matrix 2,8. Een aantal technieken zijn ingesteld om epitheelcellen 3D kolonies groeien basaalmembraan matrix 2,8. De 3D basale membraan matrix model effectief is voor het vaststellen van zowel maligne en niet-maligne borstcelgroei, lijkt op wat er gebeurt in de in vivo omgeving 18,19. MCF10A cellen niet-maligne mamma epitheelcellen. Wanneer gekweekt in basaalmembraan matrix deze cellen vertonen in vivo eigenschappen van normale borstcellen ondergaan gecontroleerde celproliferatie, polarisatie en apoptose het lumen ruimte 8,12,20 stellen. Ook het uiterlijk van celkernen van MCF10A cellen die acini in 3D culturen dichter op die van mammaire epitheelcellen in weefsel dan gekweekt in monolaag 21. Studies van Bissell en collega's waren de eerste om te tonen dat kwaadaardige borst cellen kunnen worden onderscheiden van niet-kwaadaardige borstcellen wanneer gekweekt in een laminine-rijke omgeving, aangezien de kwaadaardige cellen vertonen een zeer ongeorganiseerd fenotype, verhoogde proliferatie, verminderde cel- celadhesie, verhoogde expressie van mesenchymale markers en een toename van het aantal invasieve structuur gevormd 3,6,22.

Afwijkingen van de cel milieu tumorvorming 20 beïnvloeden. De 3D kweekmethode kan worden gebruikt om effectief bestuderen communicatie die plaatsvindt tussen de tumorcellen en hun omgeving en bepalen hoe eiwitexpressie invloeden communicatie 14,20,21,23. Dit artikel geeft een gedetailleerde methodologie voor MDA-MB-231 borstkankercellen groeien in 3D culturen invasiveness te analyseren, en om het verlies van epitheliale morfologie met een epitheliale marker laminin, een onderdeel van de cel basale membraan 18,19,24 bestuderen, 25. De voorschriften bieden de mogelijkheid om nauwkeurig en reproduceerbaar kwantificeren stervormige (invasieve) structuurvorming door een invasieve kankercel en niet beperkend voor de gemeenschappelijke borstkankercellijnen (zoals MDA-MB-231, Hs578T, MCF-7 of T47D ). Zo kan deze bepaling als platform voor het evalueren hoe eiwitexpressie in cellen of behandeling met pro-of anti-invasieve verbindingen regelen extracellulaire matrix degradatie, door een of meerdere cellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Driedimensionale Cultuur van borstkankercellen in Basement Membrane Matrix (De Verankering Techniek)

  1. Omgaan Matrigel basaal membraan matrix: Ontdooi op ijs overnacht bij 4 ° C. Basaalmembraan matrix vloeibaar is bij lage temperatuur, maar stolt op kamertemperatuur. Houd basale membraan matrix op ijs (figuren 1A-B).
  2. Bedek de Confocale No.1 glazen bodem schaal met 50 gl basaalmembraan matrix door middel van verspreiding van de matrix met de punt van een Pipetman P-200 in een spiraalvormig patroon (figuur 1C). Wees voorzichtig bij het verspreiden van het basaal membraan matrix om de vorming van luchtbellen te voorkomen. Ook voorkomen dat de verspreiding van de matrix dicht bij de randen van de glazen bodem gerecht meniscus te voorkomen. Als onervaren handling basaal membraan matrix, dan voorgekoeld de schotel, P-200 Pipetman en pipetten kan op ijs (alternatief gedurende de nacht in een koelkast bij 4 ° C). Deze stap aanbiedingenextra tijd om het basaal membraan matrix uitspreiden voor het stollen. Zet de schaal (n) in een cel incubator (bij 37 ° C met 5% CO2) gedurende ten minste 30 minuten aan de basale membraan matrix staat te stollen (figuur 1D).
  3. Terwijl de matrix ondergaat stollen, trypsinize een 70-80% confluent 100-mm plaat van cellen. Wanneer de cellen eenmaal zijn begonnen tillen van de plaat, resuspendeer ze in 10 ml RPMI 1640 medium dat 10% (v / v) foetaal runderserum (FBS), de trypsine (figuur 1E) inactiveren. Daarna brengt de geresuspendeerde cellen in een 15 ml conische buis (figuur 1F).
  4. Draai de cellen (aanwezig in conische buis) bij 100 xg gedurende 3 minuten in een specifieke celkweek centrifuge (fig. 1G-H).
  5. Terwijl de cellen worden afgedraaid, aliquot 50 pi matrix in een 1 ml microcentrifugebuis (let op: wordt elke glazen bodem schaal toegewezen een microcentrifugebuisje, vandaar, indienhet experiment vereist 3 gerechten, dan volgt daaruit dat 3 microcentrifugebuizen nodig ook), en plaats de buis vervolgens op ijs (Figuur 1B).
  6. Zuig het medium van de conische buis uit stap 1.4, terwijl het verlaten van de pellet ongestoord (Figuur 1I). Resuspendeer cellen (die zijn gecentrifugeerd) in 1 ml FBS aangevuld RPMI-medium (fig. 1J).
  7. Zodra de cellen geteld met een hemocytometer (fig. 1K), of een cel deeltjesteller aliquot 2,5 x 10 4 cellen in de microcentrifugebuis en het af met geschikte media om totaal volume van 50 pl (Figuur 1L) te verkrijgen.
  8. Meng de cellen van stap 1.7 (25.000 cellen in 50 ul) met de matrix bevattende microcentrifugebuis van stap 1.5 in een 1:1 verhouding; uiteindelijke volume zal 100 pi (figuur 1 M).
  9. Voorzichtig plaat 100 pl van de matrix: cel mengsel uit stap 1.8 op de solidified basaal membraan-matrix gecoate schaal van stap 1.2 (figuur 1 N). Hierdoor kunnen cellen worden ingebed in basaalmembraan matrix.
  10. Breng de schaal (sen) in de celkweek incubator (bij 37 ° C met 5% CO2) en laat de matrix: celmengsel stollen ten minste 30 minuten.
  11. Zodra de matrix: celmengsel is gestold, voeg 2 ml FBS aangevuld RPMI-media om de schaal (figuur 1O) en neem het gerecht terug de incubator waar deze wordt opgeslagen voor de rest van het experiment (Figuur 1P).
  12. Opnieuw media elke dag gedurende 5 dagen (of per vereist voor een test, de duur van de test voor MDA-MB-231 cellen 5 dagen lang).
  13. Met behulp van een lichtmicroscoop, neem differentieel interferentie contrast (DIC) beelden van de MDA-MB-231 kolonies gesuspendeerd in basaal membraan matrix (figuur 3A). Afbeelding 20 representatieve gebieden op 10X doel een keer per dagvoor vijf dagen naar kolonie morfogenese (figuur 3C) te bepalen.
  14. Analyseer beelden blindelings naar cel kolonie gestraalde vorming (Figuur 3B) te bepalen. Een kolonie wordt geacht stellaatcellen als een of meer projecties van de bolvormige cellen worden waargenomen. Het percentage invasieve gestraalde kolonies te bepalen, verdeel het aantal gestraalde kolonies door het totaal aantal celkolonies per verworven imago, en dan het gemiddelde van de gestraalde kolonies percentages van de 20 beelden voor elke dag.

Figuur 1
Figuur 1. Driedimensionale cultuur van MDA-MB-231 borstkankercellen in basaal membraan matrix (de inbedding techniek). AB) Een schematische weergave van de experimentele opstelling (uitgevoerd in de zuurkast). C) Het goed van de glazen bodem schaal gecoat50 ui basaalmembraan matrix. D) Schotel (sen) in een celkweek incubator (bij 37 ° C met 5% CO2) aan de matrix toe te stollen ten minste 30 minuten. E) F Cellen werden getrypsiniseerd. ) Cellen werden opnieuw gesuspendeerd in een 15 ml conische buis. GH) cellen (aanwezig in conische buis) werden gecentrifugeerd bij 100 xg gedurende 3 minuten in een weefselkweek centrifuge. I) celpellet. J) cellen (die zijn gecentrifugeerd) werden geresuspendeerd in 1 ml FBS-medium aangevuld RPMI. K) cellen werden geteld met een hemocytometer. L) 2,5 x 10 4 cellen verdeeld in de microcentrifugebuis en afgewerkt met geschikte media om totaal volume van 50 ui te verkrijgen. M ) Meng cellen van stap 1.7 (25.000 cellen in 50 ul) met de matrix bevattende microcentrifugebuis van stap 1.5 in een 1:1 verhouding; uiteindelijke volume zal 100 μ.; L N) plaat voorzichtig 100 pi van de matrix: cel mengsel van stap 8 op de gestolde matrix-gecoate schaal van stap 1.2 O) Zodra de matrix: celmengsel is gestold, voeg 2 ml FBS-aangevuld RPMI media. de schotel. P) Plaats de schaal in de incubator waar deze wordt opgeslagen voor de rest van het experiment.

2. Onderzoek van morfogene Kenmerken van 3D Culturen met immunofluorescentie

  1. Stel een ijs lade koude fosfaat gebufferde oplossing (PBS), 20% aceton: 80% methanol (fixeeroplossing), en 3% runderserumalbumine (BSA; blokkerende oplossing) (Figuur 2A) voordat de schaal (es) uit de incubator.
  2. Zet de schaal (sen) op het ijs lade en zuig media, vervolgens 3x wassen met 2 ml koude PBS (figuur 2B).
  3. Zodra de laatste PBS was wordt opgezogen, voeg 2 ml 20% aceton: 80% methanol-oplossing in de schaal (es) (figuur 2C (Figuur 2D).
  4. Zodra de 20 min fixatie wordt beëindigd, brengt de schotels terug op kamertemperatuur zuig het fixeermiddel en vervolgens 3x wassen met PBS. Zodra de uiteindelijke PBS-wassing wordt afgezogen, 2 ml van 3% BSA om de schotel (n) bij blok ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur (Figuur 2E).
  5. Gedurende de blokkeringsperiode verdunningen bereiden van primaire (laminine V 1:100) en secundaire antilichamen (op geschikte verdunning) opgelost in 3% runderserumalbumine (BSA) blokkerende buffer. Let op: 400-500 pi de 'BSA + primaire antilichaam-oplossing direct te worden toegevoegd aan de matrix: celmengsel.
  6. Zodra de 30 min blokkering verstreken, voeg de primaire antilichamen en incubeer gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur (Figuur 2F). Let geen PBS wast worden uitgevoerd na 30 min blocking periode.
  7. Na voltooiing van stap 2.6, verwijder de 'BSA + primaire antilichaam' oplossing, en was 3x met PBS.
  8. Voeg het tweede antilichaam opgelost in 3% BSA (op geschikte verdunning) direct op de matrix: celmengsel, omvatten de gerechten en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (Figuur 2G).
  9. Haal de 'BSA + secundair antilichaam' oplossing, en was 3x met PBS.
  10. Voeg 2 ml van Hoechst 33258 (1:10.000), opgelost in PBS voor kernen kleuring, en incubeer gedurende 5 minuten onder aluminiumfolie (of bedekken met een ondoorzichtige container photobleaching beperken) (figuur 2H).
  11. Zodra de 5 min incubatie met Hoechst 33258t zijn verstreken, was het gerecht (es) 5x met PBS.
  12. Voeg fixeermiddel direct op de matrix: celmengsel in de confocale schaal dek met glazen dekglaasje voorzichtig voorkomen induceren verstoringen van de integriteit van de kolonies in de basaalmembraan matrix: celmengsel (figuur 2I).
  13. Laat de schaal (n) bij nacht drogen (of 24 uur) bij kamertemperatuur (figuur 2I). Eenmaal droog, kan de schotel (es) worden bewaard bij -20 ° C, maar het wordt ten zeerste aanbevolen dat zij zo snel mogelijk moet worden afgebeeld.
  14. Acquire beelden met behulp van een fluorescentiemicroscoop met geschikte laser golflengten van antilichamen gebruikt (figuren 3D-E).

Figuur 2
Figuur 2. Onderzoek van 3D culturen met immunofluorescentie. . A) Een schema van de experimentele opstelling B) Schotel (es) geplaatst op het ijs dienblad en media opgezogen; Vervolgens werden de cellen driemaal gewassen met 2 ml koude PBS C) 2 ml 20% aceton:. 80% methanoloplossing toegevoegd in de schaal (sen) D) Bevestig de cellen.20 min bij 4 ° C (op ijs of in een koelkast). E) 2 ml 3% BSA toegevoegd aan de schaal (n) bij blok ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd. F) Na de 30 min blokkeren verstreken, voeg de primaire antilichamen en incubeer gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur G) Secundaire antilichamen opgelost in 3% BSA (op geschikte verdunning) werden direct toegevoegd aan de basale membraan matrix. celmengsel; . Vervolgens gerechten bedekt en gedurende 1 uur bij kamertemperatuur H) 2 ml Hoechst (1:10.000, opgelost in PBS) toegevoegd aan de dishe (sen) en cellen geïncubeerd gedurende 5 minuten onder aluminiumfolie I) fixeermiddel rechtstreeks toegevoegd. op de matrix: cel mengsel in de confocale schotel en de schotel is bedekt met glas dekglaasje. Schotel (n) te drogen overnacht (of 24 uur) bij kamertemperatuur geroerd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Een voorbeeld van de MDA-MB-231-cellen invasie in 3D matrix wordt getoond in figuur 3C. De cellen zijn ingebed in matrix (dag 1), en start de vorming invasief (stervormige) structuren op dag 3, en volledig binnendringen in de matrix tegen Dag 5 (figuur 3C). Het aantal gestraalde gevormde koloniën geteld, en uitgedrukt als een percentage van het totale aantal kolonies per schaal (invasieve en niet-invasief). Bovendien, aangezien de metingen dagelijks uitgevoerd gedurende vijf dagen, de mate van invasie kan worden geëvalueerd.

De oprichting van een tijdlijn van morfogenetische gebeurtenissen biedt een basis om talrijke parameters in deze testen testen. Zo kan borstkankercellen behandeld met anti-kanker middelen of geneesmiddelen die cytoskelet herschikking kunnen bevorderen en de effecten van deze geneesmiddelen op invasie kan worden vastgesteld, vergeleken met niet gestimuleerde cellen en het voertuig bestuurt 24. Anders, de capaciteit van borst kancer cellen om invasieve uitsteeksels vormen kan worden gekwantificeerd op genetisch te modificeren dat de cellen een potentiële oncogen of verminderde genexpressie te uiten met behulp van RNA interferentie (zoals shRNA) 18,24,25.

Een groot voordeel van het gebruik van 3D celculturen als een experimentele tool is de mogelijkheid om de ruimtelijke en temporele kenmerken van belangrijke signaalmoleculen tijdens cel morfologische veranderingen te onderzoeken. Door gebruik immunofluorescentie kleuring, kan de expressie van deze moleculen visueel gedetecteerd in de 3D-kweek. In figuur 3E tonen wij representatieve invasief (stervormige) kolonies van de MDA-MB-231 cellen die een verlies van membraan integriteit en diffuse lokalisatie van het basale membraan eiwit laminine V 24. In sterke tegenstelling tot hetgeen wordt waargenomen in de cellen van borstkanker, werd laminine V gelokaliseerd op een intacte kelder membraanlaag omsluit de borstklier acini van onbehandelde niet-maligne MCF10A cellen (figuur3E) 24.

Figuur 3
Figuur 3. Beeldacquisitie en illustratie van representatieve beelden. A) Opnamen die met een microscoop. B) Differentieel interferentie contrast (DIC) imaging microscoop gebruikt om beelden te verwerven en vervolgens beelden geanalyseerd met behulp van software voor beeldanalyse. C) Sample representatief DIC beelden van MDA-MB-231-cellen (een keer per dag genomen voor vijf dagen) getoond. One-way ANOVA gevolgd door Dunnett's meervoudige vergelijkingstest: *, p <0,05. Schaal bar, 100 micrometer. D) Beeldacquisitie behulp fluorescentiemicroscoop. E) Sample immunefluorescentie beelden beeltenis laminin V lokalisatie in MDA-MB-231 (gekweekt voor 5 dagen) en MCF10A cellen (gekweekt voor 12 dagen) worden getoond. Schaal bar, 20 urn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De ontwikkeling van 3D celkweektechnieken heeft onderzoekers toegestaan ​​om de transformatie van borst epitheelcellen bestuderen, zodat we de dramatische morfologische veranderingen zichtbaar. Naast het analyseren celinvasie, kan het een of multicellulaire sferoïden mammaire epitheliale worden om veranderingen in cellulaire adhesie, proliferatie, maat en basale-apicale polariteit beoordelen. In tegenstelling tot eerder beschreven methoden waarbij de cellen bedekt met ECM 8, onze methode sluit de cellen in ECM 18,19,24, die zorgt voor multidirectionele invasie te kwantificeren. Deze innovatieve 3D-cultuur-modellen kunnen de onderzoekers de fenotypische veranderingen die niet mogelijk zijn bij het bestuderen van cellen in monolaag, met behulp van traditionele transwell kamer invasie assays bestuderen. Door de integratie van zowel biochemische en farmacologische strategieën met confocale immunofluorescentie analyse van cel kolonies werden 3D-modellen het vermogen om voorzichtig vergemakkelijkty analyseren morfologische veranderingen met meer verfijning en detail. Deze techniek heeft daarom bevorderd ons begrip van de mechanismen beïnvloeden de initiatie en ontwikkeling van kanker.

We vonden dat het optimale aantal voor plating van MDA-MB-231 cellen per schaaltje confocale werd bepaald op 25.000 cellen. Het verhogen van dit aantal cellen kan mogelijk resulteren in een overmatige basaal membraan matrixafbraak (aangeduid als 'het losmaken fenomeen'), en dus niet zou worden aanbevolen. Bij hoge celaantallen werken als andere parameters worden aangepast, bijvoorbeeld met een bijbehorende toename basaalmembraan matrix volume. Bovendien kan basaal membraan matrix mengsels variëren in concentratie van de ene partij naar de andere. Dus is het belangrijk om in eerste instantie te testen op het vermogen ervan normale morfogenese van niet-maligne mamma epitheelcellen 3D assays houden van het mengsel. Bij beeldvorming 3D culturen, unieke problemen ontstaan ​​dieniet aanwezig toen beeldvorming culturen gekweekt in monolaag. Gezien het feit dat kolonies gegroeid in de basale membraan matrix zijn multi-dimensionale, kan de gehele structuren worden gemist wanneer beeldvorming als zich buiten het vlak van focus. Dit wordt overwonnen door beeldvorming via confocale Z-stacks waarmee beelden kunnen worden genomen in meerdere vlakken en aldus elk afzonderlijk invasieve structuur van de 3D kolonie kan worden afgebeeld.

We hebben ook vastgesteld dat de 20% aceton: 80% methanoloplossing de optimale middel voor de vaststelling kolonies ingebed in basaalmembraan matrix vergelijking met andere fixeermiddelen zoals paraformaldehyde met Triton-X oplossing. We hebben gevonden dat de aceton: methanol fixatief verbetert immunokleuring en neigt naar achtergrond autofluorescentie te verminderen. Echter, is optimalisering van de kleuring procedure vereiste elk experiment, om het ideale antilichaam verdunningen die afwijken van die welke gewoonlijk toegepast voor eenlagige bepalen. De meeste antibodies dat werk op monolayers kan worden gebruikt voor 3D immunokleuring. Echter, de lengte van de incubatietijd met het antilichaam variëren, en zal moeten worden bepaald op een individuele basis.

Beeldvorming 3D culturen voor immunofluorescentie studies kunnen enkele uitdaging 8 vormen. Om het probleem van onscherpte / korreligheid 'vanwege de dikte van het specimen te overwinnen, kunnen bepaalde maatregelen worden genomen om de kwaliteit van het beeld zoals het verwerven Z-stacks van het monster of toenemende belichtingstijd en toenemend framenummer gemiddelde verbeteren . Dit is ook zeer gunstig voor gestraalde onderscheiden (invasieve) vergeleken met bolvormige morfologie eerder dan om een ​​afbeelding in een vlak. De Z-stack afgebeeld kan ook worden verwerkt tot een 3D-beeld van het monster met de immunostaining maken. Verder met de MDA-MB-231 of MCF10A cellijnen we succesvol gevormde cel aggregaten via tijdsperiode gegroeid. Zo waren we in staat om de locatie te onderzoekenen veranderingen in expressie van celpolariteit merkers in 3D culturen met immunofluorescentie. Alternatief cellulaire aggregaten worden voorgevormd vóór de kelder membraan matrix geproduceerd en de lokalisatie van eiwitten van belang kunnen dan beoordeeld.

Tot slot is de verscheidenheid van mogelijke toepassingen maakt het gebruik van 3D culturen een dynamische test die kan worden gebruikt met een breed spectrum van cellen of pathologische en / of normaal oorsprong waardoor de evaluatie van veranderingen in celmorfologie en invasie in vaste monsters of in real-time 18,19,24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

We hebben niets te onthullen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 ml tubes VWR CA10011-700 Sterile, disposable
100-mm culture dish BD353003 VWR CABD353003 Sterile, disposable
15 ml Falcon tube VWR CA21008-918 Sterile, disposable
1 ml filtered tips VWR 10011-350 Sterile, disposable
200 μl filtered tips VWR 22234-016 Sterile, disposable
20 μl filtered tips VWR 22234-008 Sterile, disposable
35-mm glass-bottomed Confocal No.1 culture dishes  MatTek Corporation P35G-1.0-14-C Precooled before use
Bovine serum albumin (BSA) BioShop ALB003.100 Used at 3% for IF
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed Life Technologies  A11029 1:250 for IF
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody Life Technologies  A11011 1:1,200 for IF
Anti-Beta-Catenin  BD Transduction Laboratories 610153 Mouse-monoclonal; Used at 1:100 for IF
Fetal bovine serum (FBS) Sigma F1051 Used at 10% (v/v) 
Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) - 10 mg⁄ml Solution in Water Life Technologies H3569 Used at 0.1% (1:10,000 dilution)
InVivo Analyzer Suite  Media Cybernetics Used for 3D culture imaging (DIC images at 10X and 40X)
Kisspeptin-10 (KP-10) EZ Biolabs PT0512100601 Used at 100 nM 
Anti-Laminin  Cedarlane AB19012(CH) Rabbit-polyclonal full length human; Used at 1:100 for IF
LSM-510 META laser scanning microscope  Zeiss Used at 63X objective; oil immersion lens
Matrigel phenol red free (BD356237) VWR CACB356237  Lot No.2180819; 10.4 mg/ml
Olympus IX-81 microscope  Olympus Used for 3D culture imaging (DIC images at 10X and 40X)
Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml) Life Technologies 15140-122 Antibiotic (added to media; used at 0.01%)
10 ml pipette VWR CA53300-523 Sterile, disposeable
RPMI 1640 Medium with Glutamine Life Technologies 11875-119 Used for culturing of MDA-MB-231 cells
0.25% Trypsin-EDTA (1x), Phenol Red Life Technologies 25200-072 Used to trypsinize MDA-MB-231 cells
MEGM (bullet kit): MEBM (CC3151)+Single quots (CC4136) Lonza CC-3150 Used for culturing of MCF10A cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2, 563-572 (2002).
  2. Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutat Res. 752, 10-24 (2013).
  3. Shaw, K. R., Wrobel, C. N., Brugge, J. S. Use of three-dimensional basement membrane cultures to model oncogene-induced changes in mammary epithelial morphogenesis. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 9, 297-310 (2004).
  4. Eccles, S. A., Welch, D. R. Metastasis: recent discoveries and novel treatment strategies. Lancet. 369, 1742-1757 (2007).
  5. Poincloux, R., Lizarraga, F., Chavrier, P. Matrix invasion by tumour cells: a focus on MT1-MMP trafficking to invadopodia. Journal of cell science. 122, 3015-3024 (2009).
  6. Bissell, M. J., Labarge, M. A. Context, tissue plasticity, and cancer: are tumor stem cells also regulated by the microenvironment. Cancer Cell. 7, 17-23 (2005).
  7. Burgstaller, G., Oehrle, B., Koch, I., Lindner, M., Eickelberg, O. Multiplex Profiling of Cellular Invasion in 3D Cell Culture Models. PLoS One. 8, (2013).
  8. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, 256-268 (2003).
  9. Mroue, R., Bissell, M. J. Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells. Methods Mol Biol. 945, 221-250 (2013).
  10. Vidi, P. A., Bissell, M. J., Lelievre, S. A. Three-dimensional culture of human breast epithelial cells: the how and the why. Methods Mol Biol. 945, 193-219 (2013).
  11. Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Curr Opin Cell Biol. 15, 753-762 (2003).
  12. Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111, 29-40 (2002).
  13. Weaver, V. M., Bissell, M. J. Functional culture models to study mechanisms governing apoptosis in normal and malignant mammary epithelial cells. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 4, 193-201 (1999).
  14. Weaver, V. M., Howlett, A. R., Langton-Webster, B., Petersen, O. W., Bissell, M. J. The development of a functionally relevant cell culture model of progressive human breast cancer. Semin Cancer Biol. 6, 175-184 (1995).
  15. Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells to the omentum. Int J Cancer. 121, 1463-1472 (2007).
  16. Cougoule, C., et al. Blood leukocytes and macrophages of various phenotypes have distinct abilities to form podosomes and to migrate in 3D environments. European journal of cell biology. 91, 938-949 (2012).
  17. Sung, K. E., et al. Understanding the Impact of 2D and 3D Fibroblast Cultures on In Vitro Breast Cancer Models. PLoS One. (2013).
  18. Li, T. T., et al. Beta-arrestin/Ral signaling regulates lysophosphatidic acid-mediated migration and invasion of human breast tumor cells. Mol Cancer Res. 7, 1064-1077 (2009).
  19. Zajac, M., et al. GPR54 (KISS1R) transactivates EGFR to promote breast cancer cell invasiveness. PLoS One. 6, (2011).
  20. Underwood, J. M., et al. The ultrastructure of MCF-10A acini. J Cell Physiol. 208, 141-148 (2006).
  21. Lelievre, S. A., et al. Tissue phenotype depends on reciprocal interactions between the extracellular matrix and the structural organization of the nucleus. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 14711-14716 (1998).
  22. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 9064-9068 (1992).
  23. Weaver, V. M., et al. beta4 integrin-dependent formation of polarized three-dimensional architecture confers resistance to apoptosis in normal and malignant mammary epithelium. Cancer Cell. 2, 205-216 (2002).
  24. Cvetkovic, D., et al. KISS1R Induces Invasiveness of Estrogen Receptor-Negative Human Mammary Epithelial and Breast Cancer Cells. Endocrinology. 1999-2014 (2013).
  25. Alemayehu, M., et al. beta-Arrestin2 regulates lysophosphatidic acid-induced human breast tumor cell migration and invasion via Rap1 and IQGAP1. PLoS One. (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics