La cuantificación de la invasividad de las células del cáncer de mama El uso de un modelo (3D) Tres Dimensiones

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Summary

Este artículo proporciona metodologías detalladas para el uso de ensayos (3D) en tres dimensiones para cuantificar la invasión de células de cáncer de mama. En concreto, se discuten los procedimientos necesarios para configurar este tipo de ensayos, la cuantificación y el análisis de datos, así como los métodos para examinar la pérdida de integridad de la membrana que se produce cuando las células invaden.

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Cvetković, D., Goertzen, C. G., Bhattacharya, M. Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model. J. Vis. Exp. (88), e51341, doi:10.3791/51341 (2014).

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Abstract

Ahora es bien conocido que el microambiente celular y tisular son reguladores críticos que influyen en la iniciación del tumor y la progresión. Por otra parte, la matriz extracelular (ECM) se ha demostrado que es un regulador crítico de comportamiento de las células en cultivo y la homeostasis in vivo. El enfoque actual de cultivo de células en dos dimensiones (2D), las superficies de plástico resulta en la alteración y la pérdida de interacciones complejas entre las células y su microambiente. Mediante el uso de tres dimensiones (3D) de ensayos de cultivo, se establecieron las condiciones para la interacción de células-microambiente se asemeja a la microentorno in vivo. Este artículo proporciona una metodología detallada para hacer crecer células de cáncer de mama en una matriz de proteína de membrana basal 3D, que ejemplifica el potencial de la cultura 3D en la evaluación de la invasión de células en el medio ambiente circundante. Además, se discutirá cómo estos ensayos 3D tienen el potencial para examinar la pérdida de señalización molecdulos que regulan la morfología del epitelio mediante inmunotinción procedimientos. Estos estudios ayudan a identificar importantes detalles mecanicistas de los procesos que regulan la invasión, necesarios para la propagación del cáncer de mama.

Introduction

La migración y la invasión de células individuales o colectivos son dos características del cáncer, y necesarios para la diseminación metastásica de células de cáncer de 1-4. La capacidad de las células de los cánceres de iniciar la metástasis depende de su capacidad para migrar e invadir en el tejido vecino usando invadopodia para degradar la membrana basal de las células. Invadopodia son protuberancias degradación de la matriz de actina-rica dinámicos que permiten la degradación de la matriz extracelular a través de la liberación de proteasas que degradan la matriz 5. La invasión de células del cáncer implica la degradación de la matriz, seguido de la migración de las células cancerosas y esto va acompañado por una reorganización del medio ambiente matriz tridimensional (3D) 2. Por lo tanto, para penetrar a través de la matriz, una célula debe transformar su forma y interactuar con la matriz extracelular (ECM) 2.

El mantenimiento de la integridad del tejido mamario depende fuertemente controlled arquitectura del tejido desde las uniones célula-ECM y célula-célula de adhesión influyen en la expresión génica y la interrupción de la polaridad epitelial puede conducir a la aparición de cáncer de 6-10. Sin embargo, la mayoría vitro de migración y la invasión ensayos in como transwell ensayos de cámara de ensayos o herida-scratch son de dos dimensiones (2D) y por lo tanto éstos descuidan las intrincadas interacciones entre las células y su entorno adyacente 3,6,8,11-14. Diversidades morfológicas y funcionales considerables tales como las variaciones en la morfología celular, la diferenciación celular, las adherencias célula-matriz y patrones de expresión génica han sido detectadas por el cultivo de células en los cultivos 3D que faltan comúnmente en 2D ensayos 2,6,8,11. Por lo tanto, los usos de los ensayos en 3D están significativamente beneficioso en la recapitulación de una forma más fisiológica en condiciones in vivo, lo que lleva a una mejor transposición de los resultados innovadores en la investigación básica a la clínica 6-10. Sin embargo, hay que señalar, A pesar de las muchas ventajas que se obtienen con el uso de cultivos 3D, este modelo no puede capturar todas las complejidades de la microambiente del tumor in vivo en que incluye diversos tipos de células. Sin embargo, es posible incorporar las células del estroma en los modelos 3D (por ejemplo, fibroblastos, leucocitos, y macrófagos) para estudiar el efecto de las interacciones tumor-estroma sobre la adhesión de células de cáncer y la invasión 15-17.

Células epiteliales de mama en cultivo crecen con mayor eficacia cuando las proteínas ECM, como la laminina y el colágeno están presentes. Con esta conocida, una mezcla de la matriz disponible comercialmente se ha derivado de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) del tumor murino y se conoce como matriz de la membrana de Matrigel sótano 2,8. Un número de técnicas se han establecido para hacer crecer células epiteliales como colonias 3D en la matriz de la membrana basal 2,8. El modelo de matriz de membrana basal 3D es eficaz para el establecimiento de células de mama tanto maligno y no malignocrecimiento, parecido a lo que está ocurriendo en el entorno in vivo 18,19. Células MCF10A son células epiteliales mamarias no malignas. Cuando se cultiva en la matriz de la membrana basal, estas células exhiben en los rasgos in vivo de las células normales del seno y se someten a control de la proliferación celular, la polarización celular y la apoptosis de establecer el espacio lumen 8,12,20. Además, la aparición de núcleos celulares de las células MCF10A que forman acinos en cultivos 3D se asemejan más a las de las células epiteliales mamarias en el tejido que las cultivadas en monocapa 21. Los estudios realizados por Bissell y sus colegas fueron los primeros en revelar que las células malignas de mama pueden diferenciarse de células de mama no malignas cuando se cultiva en un entorno de laminina-rica, ya que las células malignas muestran un fenotipo altamente desorganizado, aumento de la proliferación, la disminución de la célula-a- la adhesión celular, aumento de la expresión de marcadores mesenquimales y un aumento en el número de estructura invasiva formaron 3,6,22.

Anomalías del entorno celular pueden influir en la formación de tumores 20. El método de cultivo 3D se puede utilizar para estudiar con eficacia la comunicación que se produce entre las células tumorales y su ambiente circundante y determinar cómo influye en la expresión de proteínas tales 14,20,21,23 comunicación. En este artículo se presenta una metodología detallada para crecer MDA-MB-231 células de cáncer de mama en las culturas 3D para analizar la invasividad, y para estudiar la pérdida de la morfología epitelial utilizando un laminina marcadores epiteliales, un componente de la membrana basal de células 18,19,24, 25. Los procedimientos detallados proporcionan la capacidad de cuantificar con precisión y de manera reproducible estrelladas (invasiva) formación de la estructura por cualquier célula de cáncer invasivo y no es limitante para las líneas celulares de cáncer de mama común (tales como MDA-MB-231, Hs578T, MCF-7, o T47D ). Por lo tanto, este ensayo puede servir como una plataforma para la evaluación de cómo la expresión de proteínas en las células o el tratamiento con pro-o anti-compuestos invasivos regular degradación de la matriz extracelular, por las células individuales o múltiples.

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Protocol

1. Cultivo tridimensional de células de cáncer de mama en Sótano matriz de la membrana (La Técnica de empotramiento)

  1. Manejo de la matriz de la membrana basal Matrigel: Descongelar en hielo durante la noche a 4 ° C. Matriz de la membrana basal es líquido a baja temperatura pero solidifica a temperatura ambiente. Mantener la matriz de la membrana basal en hielo (figuras 1A-B).
  2. Cubra el plato No.1 Confocal con fondo de vidrio con 50 l de la matriz de la membrana basal por medio de la difusión de la matriz usando la punta de un P-200 Pipetman en forma de espiral (Figura 1C). Tenga cuidado cuando la difusión de la matriz de la membrana basal para evitar la formación de burbujas de aire. Del mismo modo, evitar la propagación de la matriz a cerca de los bordes de la placa con fondo de cristal para evitar la formación de menisco. Si matriz de la membrana de manipulación inexperta sótano, a continuación, preenfriado el plato, P-200 Pipetman y pipetas puede ser en hielo (alternativamente dejó durante la noche en una nevera a 4 ° C). Este paso ofertastiempo adicional para ampliar la matriz de la membrana basal antes de la solidificación. Coloque el plato (s) en una incubadora de cultivo celular (a 37 ° C con 5% de CO 2) durante al menos 30 minutos para permitir que la matriz de la membrana basal para solidificar (Figura 1D).
  3. Mientras que la matriz está experimentando la solidificación, trypsinize un confluente de 100 mm de placa de las células del 70-80%. Una vez que las células han comenzado de elevación fuera de la placa, volver a suspender en 10 ml de medio RPMI 1640 que contiene 10% (v / v) de suero bovino fetal (FBS), para inactivar la tripsina (Figura 1E). A continuación, transferir las células resuspendidas en un tubo cónico de 15 ml (Figura 1F).
  4. Haga girar las células (presentes en tubo cónico) a 100 xg durante 3 minutos en una centrífuga de cultivo celular específico (Figuras 1G-H).
  5. Mientras que las células se centrifugan, alícuota de 50 l de la matriz en un tubo de microcentrífuga de 1 ml (nota: cada plato con fondo de cristal se asigna un tubo de microcentrífuga, por lo que, siel experimento requiere de 3 platos, entonces se deduce que 3 tubos de microcentrífuga son necesarias también), y luego colocar el tubo en hielo (Figura 1B).
  6. Aspirar el medio desde el tubo cónico de la etapa 1.4, dejando el sedimento inalteradas (Figura 1I). Resuspender las células (que se han hecho girar hacia abajo) en 1 ml de FBS suplementado con medio RPMI (Figura 1J).
  7. Una vez que las células se contaron usando un hemocitómetro (Figura 1K), o un contador de partículas alícuota de células 2,5 x 10 4 células en el tubo de microcentrífuga y por si fuera poco el uso de los medios adecuados para obtener el volumen total de 50 l (Figura 1D).
  8. Mezclar las células de la etapa 1.7 (25.000 células en 50 l) con el tubo de microcentrífuga que contiene matriz de la etapa 1.5 en una proporción de 1:1; volumen final será de 100 l (Figura 1M).
  9. Suavemente la placa 100 l de la matriz: mezcla de células de la etapa 1.8 en el solidified matriz recubiertos con membrana basal plato de la etapa 1.2 (Figura 1 N). Esto permite que las células se pueden incrustar en la matriz de la membrana basal.
  10. Transferir el plato (s) en la incubadora de cultivo celular (a 37 ° C con 5% de CO 2) y permitir que la matriz: mezcla de células se solidifique durante al menos 30 min.
  11. Una vez que la matriz: mezcla de células se solidifica, añadir 2 ml de medio RPMI suplementados con FBS al plato (Figura 1O) y tomar el plato de nuevo la incubadora donde se almacenará durante el resto del experimento (Figura 1P).
  12. Cambio de medio cada día durante un período de 5 días (o según requerido para un ensayo; la duración del ensayo para MDA-MB-231 células es de 5 días de duración).
  13. El uso de un microscopio de luz, toma de contraste de interferencia diferencial (DIC) imágenes de los MDA-MB-231 colonias suspendidas en la matriz de la membrana basal (Figura 3A). Imagen 20 áreas representativas a 10X objetivo una vez al díadurante cinco días para determinar colonia morfogénesis (Figura 3C).
  14. Analizar las imágenes a ciegas para determinar la formación de colonias de células estrelladas (Figura 3B). Una colonia se considera que es estrelladas si se perciben una o más proyecciones de la esferoide de células. Para determinar el porcentaje de colonias estrelladas invasivos, dividir el número de colonias estrelladas por el número total de colonias de células por imagen adquirida, y que la media de las colonias estrelladas porcentajes de las 20 imágenes para cada día.

Figura 1
Figura 1. Cultivo tridimensional de células MDA-MB-231 células de cáncer de mama en matriz de membrana basal (la técnica de empotramiento). AB) un esquema del montaje experimental (realizado en la campana de humos). C) El pozo de la placa de fondo de vidrio recubiertocon 50 l de matriz de membrana basal. D) Plato (ES) colocado en una incubadora de cultivo celular (a 37 ° C con 5% de CO 2) para permitir la matriz para solidificar durante al menos 30 min se trataron con tripsina. E) Células. F ) Se resuspendieron las células en un tubo cónico de 15 ml. GH) Las células (presentes en tubo cónico) se centrifugaron a 100 xg durante 3 min en una centrífuga de cultivo de tejidos. I) sedimento celular. J) Las células (que han sido hechos girar hacia abajo) se resuspendieron en 1 ml de medio RPMI suplementado-FBS. K) Las células se contaron usando un hemocitómetro. L) 2,5 x 10 4 células en alícuotas en tubo de microcentrífuga y rematado apagado utilizando medios apropiados con el fin de obtener el volumen total de 50 l. M ) Mezclar las células de la etapa 1.7 (25.000 células en 50 l) con el tubo de microcentrífuga que contiene matriz de la etapa 1.5 en una proporción de 1:1; volumen final será de 100 μ.; L N) placa suavemente 100 l de la matriz: mezcla de células desde el paso 8 en el plato de la matriz con recubrimiento solidificado desde el paso 1.2 O) Una vez que la matriz: mezcla de células se solidifica, añadir 2 ml de medio RPMI suplementados con FBS al. el plato. P) colocar la cápsula en la incubadora, donde se almacenará para el resto del experimento.

2. Examen de las Características Morfogénicas de Culturas 3D con inmunofluorescencia

  1. Configurar una bandeja de hielo, fosfato fría solución tamponada (PBS), 20% de acetona: 80% de metanol (solución de fijación), y 3% de albúmina de suero bovino (BSA; solución de bloqueo) (Figura 2A) antes de sacar el plato (ES) de la incubadora.
  2. Coloque el recipiente (es) en el soporte de la bandeja de hielo y aspirar, lavar 3 veces con 2 ml de PBS frío (Figura 2B).
  3. Una vez que el último lavado PBS se aspira, añadir 2 ml de 20% de acetona: solución de metanol al 80% en el plato (es) (Figura 2C (Figura 2D).
  4. Una vez que el 20 min de fijación se termina, llevar los platos de nuevo a temperatura ambiente, aspirar el fijador, y posteriormente lavar 3x con PBS. Una vez que el lavado final de PBS se aspiró, añadir 2 ml de 3% de BSA a la placa (s) para bloquear por lo menos durante 30 min a temperatura ambiente (Figura 2E).
  5. Durante el período de bloqueo preparar diluciones de primaria (laminina V 1:100) y anticuerpos secundarios (con una dilución adecuada) disueltos en 3% de albúmina de suero bovino (BSA) tampón de bloqueo. Por favor, tenga en cuenta que la solución de 400-500 l 'BSA + anticuerpo primario "debe añadirse directamente en la matriz: mezcla de células.
  6. Una vez que el bloqueo de 30 minutos de haber caducado, añada los anticuerpos primarios y se incuba durante al menos 1 hora a temperatura ambiente (Figura 2F). Por favor, tenga en cuenta que no hay lavados de PBS se deben realizar después de la 30 min blockinperiodo g.
  7. Sobre la terminación de la etapa 2.6, eliminar la solución 'de BSA + anticuerpo primario', y lavar 3x con PBS.
  8. Añadir el anticuerpo secundario disuelto en 3% de BSA (a una dilución apropiada) directamente sobre la matriz: mezcla de células, cubrir los platos y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente (Figura 2G).
  9. Retire la solución "BSA + anticuerpo secundario ', y lavar 3 veces con PBS.
  10. Añadir 2 ml de Hoechst 33258 (1:10.000) disueltos en PBS para la tinción de los núcleos, y se incuba durante 5 minutos bajo una lámina de aluminio (o cubra con un envase opaco para limitar fotoblanqueo) (Figura 2H).
  11. Una vez que el 5 min de incubación con Hoechst 33258t han expirado, lavar el plato (es) de 5x con PBS.
  12. Añadir medio de montaje directamente sobre la matriz: mezcla de células en el plato confocal y cubrir con cubreobjetos de vidrio con cuidado para evitar la inducción de cualquier interrupción de la integridad de las colonias en el Matri membrana basalx: mezcla de células (Figura 2I).
  13. Dejar que la cápsula (es) que se seque durante la noche (o 24 horas) a temperatura ambiente (Figura 2I). Una vez seco, el plato (s) se puede almacenar a -20 ° C, pero se recomienda que deben ser reflejados lo más rápidamente posible.
  14. Adquirir imágenes utilizando un microscopio de fluorescencia con longitudes de onda láser adecuados de anticuerpos utilizados (Figuras 3D-E).

Figura 2
Figura 2. Examen de las culturas 3D mediante inmunofluorescencia. . A) Un esquema del montaje experimental B) del plato (es) colocado en la bandeja de hielo y de los medios de aspiración; posteriormente las células se lavaron tres veces con 2 ml de PBS frío C) 2 ml de 20% de acetona:. solución de metanol 80% añadido en la cápsula (s) D) Fijar las células para.20 min a 4 ° C (ya sea en hielo, o en un refrigerador). E) 2 ml de 3% de BSA añadido a la placa (s) para bloquear por lo menos durante 30 min a temperatura ambiente. F) Una vez que el 30 min de bloqueo han expirado, añadir los anticuerpos primarios y se incuba durante al menos 1 hora a temperatura ambiente G) Los anticuerpos secundarios disueltos en 3% de BSA (a una dilución apropiada) se añadieron directamente sobre la matriz de membrana basal:. mezcla de células; . posteriormente platos cubrieron y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente H) 2 ml de Hoechst (1:10.000; disuelto en PBS) añadido a la platos y cubiertos (es) y las células se incubaron durante 5 min bajo papel de aluminio i) Medio de montaje añade directamente. sobre la matriz: mezcla de células en el plato confocal y el plato se cubre con cubreobjetos de vidrio. Plato (ES) dejó secar durante la noche (o 24 horas) a temperatura ambiente.

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Representative Results

Un ejemplo de las células MDA-MB-231 invasores en la matriz 3D se ilustra en la Figura 3C. Las células están incrustadas en la matriz (Día 1), y se empiezan a formar (estrelladas) estructuras invasoras por Día 3, y completamente invaden la matriz por el día 5 (Figura 3C). El número de colonias formadas estrelladas se cuentan, y se expresó como un porcentaje del número total de colonias por placa (invasivos y no invasivos). Además, ya que las mediciones se realizan al día durante los cinco días, la tasa de invasión puede también ser evaluada.

El establecimiento de una cronología de los eventos morfogenéticos proporciona una base para probar numerosos parámetros en estos ensayos. Por ejemplo, las células de cáncer de mama se pueden tratar con medicamentos contra el cáncer o medicamentos que pueden promover la reorganización del citoesqueleto, y los efectos de estos fármacos sobre la invasión se pueden determinar, en comparación con las células no estimuladas y controla el vehículo 24. Como alternativa, la capacidad de mama puedecélulas cer para formar protuberancias invasoras pueden ser cuantificados en la modificación genética de las células para expresar un potencial oncogen o reducción de la expresión de genes usando ARN de interferencia (como shRNA) 18,24,25.

Una ventaja importante del uso de cultivos de células en 3D como una herramienta experimental es la capacidad de examinar las características espaciales y temporales de las moléculas de señalización importantes durante celulares cambios morfológicos. Mediante la utilización de la tinción de inmunofluorescencia, la expresión de estas moléculas puede ser detectado visualmente dentro de la cultura 3D. En la Figura 3E, se muestra (estrelladas) colonias invasoras representativas de las células MDA-MB-231 que muestra una pérdida de integridad de la membrana y la localización difusa de la proteína de membrana basal laminina V 24. En marcado contraste con lo que se observa en las células de cáncer de mama, laminina V fue localizado en una capa de membrana basal intacta adjuntando los acinos mamarios de células MCF10A no maligno sin tratar (Figura3E) 24.

Figura 3
Figura 3. Adquisición de imagen y de la ilustración de imágenes representativas. A) de contraste de interferencia Las imágenes tomadas con un microscopio. B) diferencial (DIC) de imágenes de microscopio utilizado para adquirir imágenes y posteriormente las imágenes analizadas usando el software de análisis de imágenes. C) muestra representativa DIC imágenes de MDA-MB-231 células (se toma una vez al día durante cuatro días) se muestran. ANOVA de una vía seguido por prueba de comparación múltiple de Dunnett: *, p <0,05. La barra de escala, 100 m. D) La adquisición de imágenes mediante microscopio de fluorescencia. E) se muestran imágenes de inmunofluorescencia Muestra representan laminina V localización en MDA-MB-231 (cultivados durante 5 días) y las células MCF10A (cultivadas durante 12 días). La barra de escala, 20 micras.

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Discussion

El desarrollo de técnicas de cultivo de células en 3D ha permitido a los investigadores estudiar la transformación de células epiteliales de mama, lo que nos permite visualizar los dramáticos cambios morfológicos. Además de analizar la invasión de células, los esferoides epiteliales mamarias individuales o multicelulares pueden usarse para evaluar los cambios en la adhesión celular, la proliferación, el tamaño, y la polaridad basal-apical. En contraste con las metodologías reportadas previamente donde las células se superponen con ECM 8, nuestro método incrusta las células en ECM 18,19,24, que permite la invasión multidireccional para ser cuantificado. Estos innovadores modelos de cultivo en 3D permiten a los investigadores estudiar los cambios fenotípicos que no son posibles en el estudio de las células en monocapa, utilizando ensayos tradicionales de invasión cámara transwell. A través de la incorporación de ambas estrategias bioquímicos y farmacológicos, junto con el análisis de inmunofluorescencia confocal de colonias de células, modelos 3D han facilitado la capacidad de cuidadoy analizar las alteraciones morfológicas con más sofisticación y detalle. Por tanto, esta técnica ha favorecido nuestra comprensión de los mecanismos que influyen en el inicio y el avance del cáncer.

Se encontró que el número óptimo para la siembra de MDA-MB-231 células por placa confocal se determinó que era de 25.000 células. El aumento de este número de célula puede potencialmente resultar en sótano excesiva degradación de la matriz de la membrana (en lo sucesivo «el fenómeno de esponjamiento '), y, por tanto, no se recomienda. Sin embargo, el número de células más altas pueden trabajar si otros parámetros se ajustan, tal como con un consiguiente aumento de volumen de la matriz de la membrana basal. Además, mezclas de la matriz de la membrana basal pueden variar en concentración de un lote a otro. Por lo tanto, es importante probar inicialmente la mezcla por su capacidad para sostener la morfogénesis normal de no malignas células epiteliales mamarias en ensayos de 3D. Cuando proyección de imagen 3D culturas, surgen problemas únicos que estánno presentar cuando formación de imágenes culturas cultivadas en monocapa. Dado que las colonias que crecen en la matriz de la membrana basal son multidimensionales, estructuras enteras se pueden perder al tomar las imágenes si se encuentra fuera del plano de enfoque. Este es superada por formación de imágenes confocal utilizando Z-pilas que permiten a las imágenes que deben tomarse en múltiples planos y por lo tanto cada estructura invasiva individual de la colonia 3D se pueden obtener imágenes.

También hemos determinado que el 20% de acetona: solución de metanol 80% es el agente óptimo para la fijación de colonias incrustados en la matriz de la membrana basal, en comparación con el uso de otros agentes de fijación, tales como paraformaldehído con una solución de Triton-X. Hemos encontrado que la acetona: metanol fijador mejora inmunomarcaje y tiende a reducir la autofluorescencia de fondo. Sin embargo, se requiere la optimización del procedimiento de tinción en cada experimento, con el fin de determinar las diluciones de anticuerpos ideales que pueden diferir de los empleados típicamente para la tinción monocapa. La mayoría de Antibodies que el trabajo sobre las monocapas se puede utilizar para la inmunotinción 3D. Sin embargo, la longitud del tiempo de incubación con el anticuerpo puede variar, y esto tendrá que ser determinada sobre una base individual.

Imaging culturas 3D para estudios de inmunofluorescencia puede plantear algún desafío 8. Con el fin de superar el problema de 'visión borrosa / grado de aspereza' debido al espesor de la muestra, ciertos pasos se pueden tomar para mejorar la calidad de la imagen, tales como la adquisición de Z-pilas de la muestra o aumentar el tiempo de exposición, y el aumento de número medio marco . Esto también es muy beneficioso para distinguir estrelladas (invasiva) en comparación con la morfología esferoidal en lugar de la adquisición de una imagen en un plano. El Z-stack fotografiado también se puede procesar para hacer una imagen en 3D de la muestra que muestran la inmunotinción. Por otra parte, el uso de las células MDA-MB-231 o de células MCF10A líneas, nosotros los exitosos agregados de células formadas durante el período de tiempo cultivan. Por lo tanto, hemos sido capaces de examinar la ubicacióny los cambios en la expresión de marcadores de polaridad celular en cultivos 3D mediante inmunofluorescencia. Alternativamente, los agregados celulares pueden ser pre-formados antes de ser colocado en la matriz de la membrana basal y la localización de las proteínas de interés pueden entonces ser evaluados.

Para concluir, la variedad de posibles aplicaciones hace que el uso de cultivos 3D un ensayo dinámico que puede ser utilizado con un amplio espectro de células, ya sea patológica y / o normal en origen que permite la evaluación de los cambios en la morfología celular y la invasión en muestras fijadas o en tiempo real 18,19,24.

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Disclosures

No tenemos nada que revelar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 ml tubes VWR CA10011-700 Sterile, disposable
100-mm culture dish BD353003 VWR CABD353003 Sterile, disposable
15 ml Falcon tube VWR CA21008-918 Sterile, disposable
1 ml filtered tips VWR 10011-350 Sterile, disposable
200 μl filtered tips VWR 22234-016 Sterile, disposable
20 μl filtered tips VWR 22234-008 Sterile, disposable
35-mm glass-bottomed Confocal No.1 culture dishes  MatTek Corporation P35G-1.0-14-C Precooled before use
Bovine serum albumin (BSA) BioShop ALB003.100 Used at 3% for IF
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed Life Technologies  A11029 1:250 for IF
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody Life Technologies  A11011 1:1,200 for IF
Anti-Beta-Catenin  BD Transduction Laboratories 610153 Mouse-monoclonal; Used at 1:100 for IF
Fetal bovine serum (FBS) Sigma F1051 Used at 10% (v/v) 
Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) - 10 mg⁄ml Solution in Water Life Technologies H3569 Used at 0.1% (1:10,000 dilution)
InVivo Analyzer Suite  Media Cybernetics Used for 3D culture imaging (DIC images at 10X and 40X)
Kisspeptin-10 (KP-10) EZ Biolabs PT0512100601 Used at 100 nM 
Anti-Laminin  Cedarlane AB19012(CH) Rabbit-polyclonal full length human; Used at 1:100 for IF
LSM-510 META laser scanning microscope  Zeiss Used at 63X objective; oil immersion lens
Matrigel phenol red free (BD356237) VWR CACB356237  Lot No.2180819; 10.4 mg/ml
Olympus IX-81 microscope  Olympus Used for 3D culture imaging (DIC images at 10X and 40X)
Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml) Life Technologies 15140-122 Antibiotic (added to media; used at 0.01%)
10 ml pipette VWR CA53300-523 Sterile, disposeable
RPMI 1640 Medium with Glutamine Life Technologies 11875-119 Used for culturing of MDA-MB-231 cells
0.25% Trypsin-EDTA (1x), Phenol Red Life Technologies 25200-072 Used to trypsinize MDA-MB-231 cells
MEGM (bullet kit): MEBM (CC3151)+Single quots (CC4136) Lonza CC-3150 Used for culturing of MCF10A cells

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References

  1. Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2, 563-572 (2002).
  2. Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutat Res. 752, 10-24 (2013).
  3. Shaw, K. R., Wrobel, C. N., Brugge, J. S. Use of three-dimensional basement membrane cultures to model oncogene-induced changes in mammary epithelial morphogenesis. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 9, 297-310 (2004).
  4. Eccles, S. A., Welch, D. R. Metastasis: recent discoveries and novel treatment strategies. Lancet. 369, 1742-1757 (2007).
  5. Poincloux, R., Lizarraga, F., Chavrier, P. Matrix invasion by tumour cells: a focus on MT1-MMP trafficking to invadopodia. Journal of cell science. 122, 3015-3024 (2009).
  6. Bissell, M. J., Labarge, M. A. Context, tissue plasticity, and cancer: are tumor stem cells also regulated by the microenvironment. Cancer Cell. 7, 17-23 (2005).
  7. Burgstaller, G., Oehrle, B., Koch, I., Lindner, M., Eickelberg, O. Multiplex Profiling of Cellular Invasion in 3D Cell Culture Models. PLoS One. 8, (2013).
  8. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, 256-268 (2003).
  9. Mroue, R., Bissell, M. J. Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells. Methods Mol Biol. 945, 221-250 (2013).
  10. Vidi, P. A., Bissell, M. J., Lelievre, S. A. Three-dimensional culture of human breast epithelial cells: the how and the why. Methods Mol Biol. 945, 193-219 (2013).
  11. Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Curr Opin Cell Biol. 15, 753-762 (2003).
  12. Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111, 29-40 (2002).
  13. Weaver, V. M., Bissell, M. J. Functional culture models to study mechanisms governing apoptosis in normal and malignant mammary epithelial cells. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 4, 193-201 (1999).
  14. Weaver, V. M., Howlett, A. R., Langton-Webster, B., Petersen, O. W., Bissell, M. J. The development of a functionally relevant cell culture model of progressive human breast cancer. Semin Cancer Biol. 6, 175-184 (1995).
  15. Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells to the omentum. Int J Cancer. 121, 1463-1472 (2007).
  16. Cougoule, C., et al. Blood leukocytes and macrophages of various phenotypes have distinct abilities to form podosomes and to migrate in 3D environments. European journal of cell biology. 91, 938-949 (2012).
  17. Sung, K. E., et al. Understanding the Impact of 2D and 3D Fibroblast Cultures on In Vitro Breast Cancer Models. PLoS One. (2013).
  18. Li, T. T., et al. Beta-arrestin/Ral signaling regulates lysophosphatidic acid-mediated migration and invasion of human breast tumor cells. Mol Cancer Res. 7, 1064-1077 (2009).
  19. Zajac, M., et al. GPR54 (KISS1R) transactivates EGFR to promote breast cancer cell invasiveness. PLoS One. 6, (2011).
  20. Underwood, J. M., et al. The ultrastructure of MCF-10A acini. J Cell Physiol. 208, 141-148 (2006).
  21. Lelievre, S. A., et al. Tissue phenotype depends on reciprocal interactions between the extracellular matrix and the structural organization of the nucleus. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 14711-14716 (1998).
  22. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 9064-9068 (1992).
  23. Weaver, V. M., et al. beta4 integrin-dependent formation of polarized three-dimensional architecture confers resistance to apoptosis in normal and malignant mammary epithelium. Cancer Cell. 2, 205-216 (2002).
  24. Cvetkovic, D., et al. KISS1R Induces Invasiveness of Estrogen Receptor-Negative Human Mammary Epithelial and Breast Cancer Cells. Endocrinology. 1999-2014 (2013).
  25. Alemayehu, M., et al. beta-Arrestin2 regulates lysophosphatidic acid-induced human breast tumor cell migration and invasion via Rap1 and IQGAP1. PLoS One. (2013).

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