Quantifizierung der Brustkrebs-Zelle Invasivität Mit einem Drei-dimensionale (3D) Modell

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Summary

Dieser Artikel enthält detaillierte Methoden für die Verwendung von dreidimensionalen (3D-) Assays auf Brustkrebszellinvasion zu quantifizieren. Insbesondere diskutieren wir die Verfahren erforderlich, um solche Tests einrichten, Quantifizierung und Datenanalyse, sowie Methoden, um den Verlust der Membranintegrität, die bei Zellen eindringen tritt zu untersuchen.

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Cvetković, D., Goertzen, C. G., Bhattacharya, M. Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model. J. Vis. Exp. (88), e51341, doi:10.3791/51341 (2014).

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Abstract

Es ist nun gut bekannt, daß die Zell-und Gewebemikroumgebung kritische Regulatoren beeinflussen Tumor Initiierung und Progression. Darüber hinaus ist die extrazelluläre Matrix (ECM) wurde gezeigt, dass ein kritischer Regulator des Zellverhaltens in Kultur und in vivo-Homöostase. Der aktuelle Ansatz der Kultivierung von Zellen auf zweidimensionalen (2D), Kunststoffoberflächen führt zu der Störung und Verlust der komplexen Wechselwirkungen zwischen Zellen und ihrer Mikroumgebung. Durch die Verwendung von dreidimensionalen (3D) Kultur-Assays werden die Bedingungen für die zellMikro Wechselwirkung fest ähnlich der in vivo-Mikroumgebung. Dieser Artikel enthält eine detaillierte Methode zur Brustkrebs-Zellen in einem 3D-Basalmembran Proteinmatrix wachsen Ausführungs das Potential der 3D-Kultur in der Beurteilung der Zellinvasion in die Umgebung. Darüber hinaus diskutieren wir, wie diese 3D-Tests haben das Potenzial, um den Verlust von Signal Mole prüfenModule, die epithelialen Morphologie regulieren durch Immunfärbung Verfahren. Diese Studien unterstützen wichtige mechanistische Details in die Prozesse regulieren Invasion, die Ausbreitung von Brustkrebs erforderlich identifizieren.

Introduction

Migration und Invasion von Einzel-oder Sammelzellen sind zwei Markenzeichen von Krebs und für die Metastasierung von Krebszellen 4.1 erforderlich. Die Fähigkeit von Krebszellen zur Metastasierung initiieren hängt von ihrer Fähigkeit zur Migration und dringen in mit invadopodia die Basalmembran der Zellen beeinträchtigen dem benachbarten Gewebe. Invadopodia sind dynamische Aktin-reichen Matrixabbau Vorsprünge, Abbau der extrazellulären Matrix durch die Freisetzung von Matrix-abbauenden Proteasen 5 zu ermöglichen. Invasion von Krebszellen beinhaltet den Abbau der Matrix, gefolgt von der Wanderung der Krebszellen, und dies wird durch eine Umgestaltung der dreidimensionalen (3D-) Matrix-Umgebung 2 verbunden. So, um durch die Matrix zu durchdringen, eine Zelle muss seine Form zu transformieren und die Interaktion mit der extrazellulären Matrix (ECM) 2.

Die Pflege von Brustgewebe Integrität hängt eng Controlled Gewebearchitektur, da Zell-ECM-und Zell-Zell-Adhäsion Gänge beeinflussen die Genexpression und die Störung der epithelialen Polarität an der Entstehung von Tumoren führen 6-10. Die meisten in vitro die Migration und Invasion von Assays wie Transwell Kammer-Assays oder wundKratzTests sind zweidimensionale (2D) und damit diese die komplizierten Wechselwirkungen zwischen Zellen und der benachbarten Umgebung 3,6,8,11-14 vernachlässigen. Erhebliche morphologische und funktionelle Vielfalt einschließlich Schwankungen in der Zellmorphologie, Zelldifferenzierung, Zell-Matrix-Adhäsionen und Genexpressionsmuster wurden durch Kultivierung von Zellen in 3D-Kulturen, die häufig fehlen in 2D-Assays 2,6,8,11 erkannt. Daher verwendet der 3D-Tests sind deutlich vorteilhaft rekapituliert einen physiologischen Zustand in vivo, was zu einer besseren Übersetzung von bahnbrechenden Erkenntnisse in der Grundlagenforschung in die Klinik 10.06. Es sollte jedoch angemerkt werden,Trotz der vielen Vorteile der Verwendung von 3D-Kulturen gewonnen, kann dieses Modell nicht erfassen alle die Komplexität der in vivo-Tumor-Mikroumgebung, die verschiedene Zelltypen umfasst. Es ist jedoch möglich, Stromazellen in die 3D-Modelle enthalten (z. B. Fibroblasten, Leukozyten und Makrophagen), um den Effekt von Tumor-Stroma-Interaktionen auf Krebszell Adhäsion und Invasion 15-17 studieren.

Brust-Epithelzellen in Kultur effektiv wachsen, wenn ECM-Proteine ​​wie Laminin und Kollagen vorhanden sind. Bei dieser bekannten, wurde eine im Handel erhältliche Mischung aus Matrix Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) murinen Tumor abgeleitet und wird als Matrigel Basalmembranmatrix 2,8 bekannt. Eine Anzahl von Techniken wurden eingerichtet, um Epithelzellen als 3D Kolonien in Basalmembranmatrix 2,8 wachsen. Die 3D Basalmembranmatrix Modell ist für die Festlegung sowohl malignen und nicht-malignen BrustzellenWachstum, ähnlich wie in der in vivo Umgebung 18,19 auftritt. MCF10A-Zellen sind nicht-malignen Brustepithelzellen. Wenn in Basalmembranmatrix gewachsen, diese Zellen in vivo Merkmale der normalen Brustzellen zu unterziehen und kontrollierten Zellproliferation, Zellpolarisation und Apoptose, um das Lumen Raum 8,12,20 herzustellen. Ferner das Auftreten von Zellkernen MCF10A-Zellen bilden Acini in 3D-Kulturen mehr ähneln denen von Brustepithelzellen im Gewebe als in Monoschicht 21 gezüchtet. Studien von Bissell und seine Kollegen waren die ersten, zu zeigen, dass bösartige Brustzellen aus nicht-malignen Brustzellen differenziert, wenn in einem Laminin-reichen Umgebung aufgewachsen, da die bösartigen Zellen zeigen eine sehr unorganisiert Phänotyp, erhöhte Proliferation, verringert werden Zell-zu- Zelladhäsion, erhöhte Expression des mesenchymalen Marker und ein Anstieg in der Zahl der invasiven Struktur gebildet 3,6,22.

Fehlbildungen der Zellumgebung kann die Tumorbildung 20 beeinflussen. Die 3D-Kulturverfahren verwendet werden, um wirksam zu untersuchen, die die Kommunikation zwischen Tumorzellen und ihrer Umgebung auftritt, und bestimmen, wie die Proteinexpression Einflüsse wie Kommunikations 14,20,21,23 werden. Dieser Artikel enthält eine detaillierte Methodik zur MDA-MB-231 Brustkrebszellen in 3D-Kulturen wachsen, um Invasivität zu analysieren und den Verlust der epithelialen Morphologie mit einem epithelialen Marker Laminin, ein Bestandteil der Zell Basalmembran 18,19,24 studieren, 25. Die Verfahren bieten die Möglichkeit, sternförmige (invasiv) Strukturbildung genau und reproduzierbar zu quantifizieren von invasiven Krebszelle und ist nicht auf die gemeinsame Brustkrebszelllinien (z. B. MDA-MB-231, Hs578T, MCF-7, T47D oder Begrenzungs ). Somit kann dieser Test als Plattform zur Bewertung, wie Protein-Expression in Zellen oder Behandlung dienen mit pro-oder anti-invasive Verbindungen regulieren Abbau der extrazellulären Matrix, durch einzelne oder mehrere Zellen.

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Protocol

1. Dreidimensionale Kultur von Brustkrebszellen in Basalmembranmatrix (Die Einbettung Technique)

  1. Handhabung Matrigel Basalmembranmatrix: Tauwetter auf Eis über Nacht bei 4 ° C Basalmembran-Matrix bei niedriger Temperatur flüssig, sondern verfestigt sich bei Raumtemperatur. Halten Basalmembranmatrix auf Eis (Fig. 1A-B).
  2. Decken Sie die konfokale No.1 Glasbodenschale mit 50 ul Basalmembranmatrix durch die Verbreitung der Matrix mit der Spitze eines P-200 Pipetman in einem Spiralmuster (Abbildung 1C). Vorsicht, wenn die Verbreitung der Basalmembran Matrix, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden. Ebenso vermeiden Verbreitung der Matrix, um bis zu den Grenzen der Glasbodenschale schließen, um Meniskusbildung zu verhindern. Wenn unerfahrene Handhabung Basalmembranmatrix, vorgekühlt, dann die Schale, P-200 Pipetman und Pipetten auf Eis (alternativ über Nacht im Kühlschrank bei 4 ° C links). Dieser Schritt Angebotezusätzliche Zeit, um die Basalmembran Matrix vor der Verfestigung zu verbreiten. Die Schale (n) in einem Zellkulturbrutschrank (bei ​​37 ° C mit 5% CO 2) für mindestens 30 Minuten, bis die Basalmembran-Matrix zu ermöglichen sich zu verfestigen (Fig. 1D).
  3. Während die Matrix erlebt Erstarrung trypsinize eine 70-80% konfluente 100-mm-Platte von Zellen. Sobald die Zellen begonnen haben, ein Abheben der Platte zu resuspendieren sie in 10 ml RPMI 1640-Medium mit 10% (v / v) fötalem Rinderserum (FBS), um das Trypsin (1E) zu inaktivieren. Dann übertragen Sie die resuspendierten Zellen in ein 15 ml konischen Röhrchen (1F).
  4. Drehen Sie die Zellen (in konischen Rohr vorhanden) bei 100 g für 3 min in einem speziellen Zellkulturzentrifuge (Figuren 1G-H).
  5. Während die Zellen werden abzentrifugiert Aliquot 50 ul Matrix in eine 1 ml-Mikrozentrifugenröhrchen (Anmerkung: wird jede Glasbodenschale zuge ein Mikrozentrifugenröhrchen, daher, wennDas Experiment erfordert drei Gerichte, dann folgt daraus, dass 3-Mikrozentrifugenröhrchen notwendig sind als auch), und dann die Röhrchen auf Eis (Abbildung 1B).
  6. Saugen Sie das Medium aus dem konischen Rohr von Schritt 1.4, während gleichzeitig das Pellet ungestört (1I). Die Zellen in 1 ml FBS-ergänztem RPMI-Medium (Fig. 1J) (, die abzentrifugiert haben).
  7. Sobald die Zellen mit einer Zählkammer (Abbildung 1 K) oder eine Zelle Partikelzähler aliquoten 2,5 x 10 4 Zellen in den Mikrozentrifugenröhrchen gezählt und das Ganze abzurunden mit geeigneten Medien, so Gesamtvolumen von 50 ul (Abb. 1 l) zu erhalten.
  8. Mischen der Zellen aus Schritt 1.7 (25.000 Zellen in 50 &mgr; l) mit der Matrix enthaltenden Mikrozentrifugenröhrchen aus Schritt 1.5 in einem Verhältnis von 1:1; Abschlussvolumen 100 ul (Abbildung 1 M) sein.
  9. Sanft Platte 100 ul der Matrix: Zellgemisch aus Schritt 1.8 in die Solidified Basalmembranmatrix-beschichtete Schale aus Schritt 1.2 (Abbildung 1 N). Dies ermöglicht die Zellen in Basalmembran-Matrix eingebettet werden.
  10. Übertragen die Schale (n) in den Zellkulturbrutschrank (bei ​​37 ° C mit 5% CO 2) und damit die Matrix: Zellgemisch für mindestens 30 Minuten zu verfestigen.
  11. Sobald die Matrix: Zellgemisch verfestigt, 2 ml FBS-RPMI-Medium, ergänzt um die Schale (Abbildung 1O) und nehmen Sie die Schale wieder den Brutkasten, wo es für den Rest des Experiments (Abbildung 1P) gelagert werden.
  12. Ändern Medien jeden Tag für einen Zeitraum von 5 Tagen (oder nach für einen Assay erforderlich, die Dauer des Assays für MDA-MB-231-Zellen 5 Tage lang).
  13. Mit einem Lichtmikroskop, nehmen Differentialinterferenzkontrast (DIC) Bilder der MDA-MB-231 Kolonien in Basalmembranmatrix (3A) suspendiert. Bild 20 repräsentativen Bereichen bei 10X-Objektiv einmal am Tagfür fünf Tage Kolonie Morphogenese (3C) zu bestimmen.
  14. Analysieren Bilder blind Zellkolonie Sternformation (Fig. 3B) zu bestimmen. Eine Kolonie wird als stern sein, wenn ein oder mehrere Vorsprünge aus dem Sphäroid von Zellen wahrgenommen werden. Zur Bestimmung des Prozentsatzes von invasiven stern Kolonien, teilen die Anzahl von Stern Kolonien durch die Gesamtzahl der Zellkolonien pro erfassten Bild, und dann der Mittelwert der prozentualen stern Kolonien der 20 Bilder pro Tag.

Figur 1
1. Dreidimensionale Kultur von MDA-MB-231-Brustkrebszellen in Basalmembran-Matrix (die Einbettungstechnik). AB) Eine schematische Darstellung des Versuchsaufbaus (im Abzug durchgeführt). C) Die auch von der Glasbodenschale beschichtetenmit 50 ul Basalmembranmatrix D). Geschirr (n) in einem Zellkulturbrutschrank mit 5% CO 2) gegeben (37 ° C, um die Matrix zu ermöglichen, für mindestens 30 Minuten zu verfestigen. E) Die Zellen wurden mit Trypsin behandelt. F ) Die Zellen wurden in einer 15 ml konischen Röhrchen. GH) Zellen (im konischen Rohr vorhanden) wurden bei 100 × g für 3 min in einem Gewebekultur-Zentrifuge resuspendiert. I) Zellpellet. J) Zellen (oder der fest gesponnen) wurden in 1 ml FBS-ergänzt RPMI Medium resuspendiert. K) wurden die Zellen mit einer Zählkammer. gezählt L) 2,5 x 10 4 Zellen in den Mikrozentrifugenröhrchen aliquotiert und gekrönt mit geeigneten Medien, so Gesamtvolumen von 50 ul zu erhalten. M ) Mischen Zellen aus Schritt 1.7 (25.000 Zellen in 50 &mgr; l) mit der Matrix enthaltenden Mikrozentrifugenröhrchen aus Schritt 1.5 in einem Verhältnis von 1:1; Abschlussvolumen 100 μ sein. L N) vorsichtig Platte 100 &mgr; l der Matrix: Zellgemisch von Schritt 8 auf die verfestigte Matrix-beschichtete Schale aus Schritt 1.2 O) Sobald die Matrix: Zellgemisch verfestigt, 2 ml FBS-ergänztem RPMI-Medium zu. das Gericht. P) wird die Schale in den Brutschrank, wo sie für den Rest des Experiments gespeichert werden.

2. Prüfung der Morphogenic Eigenschaften von 3D-Kulturen mit Immunfluoreszenz

  1. (2A), bevor Sie die Schale (n), 80% Methanol (Fixierungslösung) und 3% Rinderserumalbumin (BSA Blocking-Lösung): bis Eiswürfelschale, Kälte-Phosphat-Pufferlösung (PBS), 20% Aceton Set aus dem Inkubator.
  2. Die Schale (n) auf dem Eis Tablett und saugen Medien, dann waschen 3x mit 2 ml kaltem PBS (2B).
  3. Sobald die letzte PBS-Wasch wird abgesaugt, 2 ml 20% Aceton: 80% Methanol-Lösung in die Schale (n) (2C (Fig. 2D) zu fixieren.
  4. Sobald die 20 Minuten der Fixierung beendet wird, bringen die Gerichte wieder auf Raumtemperatur absaugen Fixiermittel und anschließend 3x mit PBS waschen. Sobald die endgültige PBS waschen wird abgesaugt, 2 ml 3% BSA in die Schale (n), für mindestens 30 min bei Raumtemperatur (Fig. 2E) zu blockieren.
  5. Während der Sperrzeit vorzubereiten Verdünnungen der primären (Laminin V 1:100) und Sekundärantikörper (bei entsprechender Verdünnung) in 3% Rinderserumalbumin (BSA) Blocking-Puffer gelöst. Bitte beachten Sie, dass 400 bis 500 ul der "BSA + primärer Antikörper-Lösung sollte direkt auf die Matrix hinzugefügt: Zellgemisch.
  6. Sobald die 30 Minuten der Blockierung abgelaufen sind, fügen Sie die primären Antikörper und Inkubation für mindestens 1 h bei Raumtemperatur (2F). Bitte beachten Sie, dass keine PBS-Waschungen sollte nach 30 Minuten durchgeführt werden blocking Zeitraum.
  7. Nach Abschluss von Schritt 2.6, entfernen Sie die '+ BSA primären Antikörper-Lösung und wäscht 3x mit PBS.
  8. Fügen Sie den sekundären Antikörper in 3% BSA gelöst (bei ​​entsprechender Verdünnung), die direkt auf die Matrix: Zellgemisch, decken Sie die Speisen und Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur (2G).
  9. Entfernen Sie die '+ BSA sekundären Antikörper-Lösung und wäscht 3x mit PBS.
  10. 2 ml Hoechst 33258 (1:10.000), gelöst in PBS für Kerne Färbung und Inkubation für 5 Minuten unter Alufolie (oder Deckel mit einem undurchsichtigen Behälter zu begrenzen Photobleaching) (2H).
  11. Sobald die 5 min Inkubation mit Hoechst 33258t abgelaufen sind, waschen Sie die Schale (n) 5x mit PBS.
  12. In Montage Medium direkt auf die Matrix: Zellgemisch in der konfokalen Schüssel geben und mit Deckglas sorgfältig Induktion keine Störungen der Integrität der Kolonien in der Basalmembran Matri zu verhindernx: Zellgemisch (2I).
  13. Anschließend wird die Schale (n) über Nacht (oder 24 h) bei Raumtemperatur (2I) trocknen. Nach dem Trocknen kann die Schale (n) bei -20 ° C gelagert werden, aber es wird empfohlen, dass sie so schnell wie möglich dargestellt werden.
  14. Erwerben von Bildern unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops mit geeigneten Laserwellenlängen von Antikörpern verwendet (Figuren 3D-E).

Figur 2
2. Prüfung der 3D-Kulturen durch Immunofluoreszenz. . A) Eine schematische Darstellung des experimentellen Aufbaus B) Dish (n) auf dem Eis Schale gelegt und Medium abgesaugt; . Anschließend wurden die Zellen dreimal mit 2 ml kaltem PBS C), 2 ml 20% Aceton: 80% Methanollösung in die Schale (n) D) Fixieren der Zellen.20 min bei 4 ° C (entweder auf Eis oder im Kühlschrank). E) 2 ml 3% BSA in die Schale (n) hinzugefügt, um für mindestens 30 min bei Raumtemperatur Block F). Sobald die 30 min von Blockierung abgelaufen sind, fügen Sie die primären Antikörper und Inkubation für mindestens 1 h bei Raumtemperatur G) Sekundäre Antikörper in 3% BSA gelöst (bei ​​entsprechender Verdünnung) wurden direkt auf der Basalmembran Matrix hinzugefügt:. Zellgemisch; . anschließend Speisen abgedeckt und für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert H) 2 ml Hoechst (1:10.000, gelöst in PBS) zugegeben, um die dishe (n) und die Zellen für 5 min unter Aluminiumfolie inkubiert I) Montage Medium direkt zugegeben. auf die Matrix: Zellgemisch in der konfokalen Gericht und dem Gericht wird mit Deckglas abgedeckt. Schale (n) über Nacht (oder 24 h) bei Raumtemperatur trocknen.

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Representative Results

Ein Beispiel für die MDA-MB-231-Zellen eindringende in 3D-Matrix ist in Fig. 3C dargestellt. Die Zellen werden in Matrix (Tag 1) eingebettet und bilden beginnen invasive (sternförmige) Strukturen von Tag 3, und vollständig in die Matrix eindringen von Tag 5 (3C). Die Anzahl der gebildeten Kolonien stern gezählt und als Prozentsatz der Gesamtzahl der Kolonien pro Schale (invasive und nicht-invasive) ausgedrückt. Zusätzlich wird, da Messungen täglich für die fünf Tagen durchgeführt, die Rate des Eindringens kann ebenfalls ausgewertet werden.

Über einen zeitlichen Rahmen von morphogenetischen Ereignisse bietet eine Grundlage, um zahlreiche Parameter in diesen Assays zu testen. Zum Beispiel kann Brustkrebszellen mit Anti-Krebs-Arzneimittel oder Medikamente, die Zytoskelett-Umlagerung fördern kann behandelt werden, und die Wirkungen dieser Arzneimittel auf Invasion kann festgestellt werden, im Vergleich zu den unstimulierten Zellen und Fahrzeugsteuerungen 24. Alternativ kann die Kapazität von MammakarzinomKrebszellen zu invasiven Vorsprünge bilden auf genetische Modifikation der Zellen, um ein Potential Onkogen oder reduzierte Genexpression mittels RNA-Interferenz (wie shRNA) 18,24,25 Ausdruck quantifiziert werden.

Ein wesentlicher Vorteil der Verwendung von 3D-Zellkulturen als experimentelles Werkzeug ist die Fähigkeit, die räumlichen und zeitlichen Eigenschaften der wichtige Signalmoleküle während der Zell morphologische Veränderungen zu untersuchen. Durch Immunfluoreszenzfärbung unter Verwendung kann die Expression dieser Moleküle optisch innerhalb des 3D-Kultur nachgewiesen werden. In 3E, zeigen wir Vertreter invasive (sternförmig) Kolonien der MDA-MB-231-Zellen, die einen Verlust der Membranintegrität und diffuse Lokalisation der Basalmembran Protein Laminin V 24. Im krassen Gegensatz zu dem, was in den Brustkrebszellen beobachtet wurde, wurde Laminin V auf eine intakte Basalmembran Schicht umschließt die Brust Acini von unbehandelten nicht-malignen Zellen MCF10A (Abbildung lokalisierten3E) 24.

Fig. 3
Abbildung 3. Bilderfassung und Darstellung von repräsentativen Bildern. A) Die mit einer Lupe genommen. B) Differenzinterferenzkontrast (DIC) Imaging-Mikroskop verwendet, um Bilder zu erwerben und anschließend analysiert Bilder mit Bildanalyse-Software. C) Proben Vertreter DIC Bilder von MDA-MB-231-Zellen (einmal täglich für fünf Tage) werden angezeigt. One-Way-ANOVA gefolgt von Dunnett-Mehrfachvergleichstest: *, P <0,05. Maßstabsbalken, 100 um. D) Bildaufnahme mit Fluoreszenzmikroskop. E) Beispiel Immunfluoreszenz-Bilder darstellen Laminin V Lokalisierung in MDA-MB-231 (für 5 Tage gezüchtet) und MCF10A Zellen (für 12 Tage gezüchtet) gezeigt. Maßstabsbalken, 20 um.

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Discussion

Die Entwicklung der 3D-Zellkultur-Techniken konnten die Forscher die Umwandlung von Brust-Epithelzellen, um zu studieren, so dass wir die dramatischen morphologischen Veränderungen zu visualisieren. Neben der Analyse der Zellinvasion, können die Einzel-oder mehrzellige Sphäroide Brustepithelzellen verwendet, um Änderungen in der zellulären Adhäsion, Proliferation, Größe und basal-apikalen Polarität zu beurteilen. Im Gegensatz zu früher berichteten Verfahren, falls die Zellen mit ECM 8 überlagert, bettet unsere Methode die Zellen in ECM 18,19,24, die für multidirektionale Invasion quantifiziert werden können. Diese innovativen 3D-Kulturmodelle Forschern erlauben, phänotypische Veränderungen, die nicht, wenn das Studium in Monolayer-Zellen, mit traditionellen Transwell-Kammer Invasion Assays möglich zu studieren. Durch den Einbau der beiden biochemische und pharmakologische Strategien zusammen mit der konfokalen Immunfluoreszenz-Analyse von Zellkolonien, haben 3D-Modellen die Möglichkeit, carefull erleichterty analysieren morphologischen Veränderungen mit mehr Raffinesse und Details. Diese Technik hat daher unser Verständnis der Mechanismen, die Beeinflussung der Initiierung und Weiterentwicklung von Krebs gefördert.

Wir fanden, daß die optimale Anzahl für die Beschichtung von MDA-MB-231 Zellen pro Schale wurde bestimmt konfokalen bis 25.000 Zellen. Erhöhen dieses Zellzahl kann möglicherweise zu einer übermäßigen Basalmembran Matrixabbau ("das Auflockern Phänomen" bezeichnet) führen, und somit nicht zu empfehlen. Jedoch können höhere Zellzahlen zu arbeiten, wenn andere Parameter eingestellt werden, wie mit einem begleitenden Anstieg der Basalmembran Matrixvolumen. Zusätzlich kann Basalmembranmatrix Mischungen in einer Konzentration von einer Charge zur anderen variieren. Daher ist es wichtig, das Gemisch zunächst zu testen für seine Fähigkeit, normale Morphogenese der nicht-malignen Brustepithelzellen in 3D Assays aufrechtzuerhalten. Bei der Abbildung 3D-Kulturen, entstehen Probleme, die sind einzigartignicht bei der Abbildung in Monolayer-Kulturen aufgewachsen zu präsentieren. Da die Kolonien in Basalmembranmatrix gewachsen sind multi-dimensional, können ganze Strukturen bei der Abbildung, wenn außerhalb der Fokusebene befinden verpasst werden. Dies wird durch die Abbildung mit Hilfe der konfokalen Z-Stapel, der Bilder ermöglichen, in mehreren Ebenen getroffen werden und somit jeder einzelne invasive Struktur des 3D-Kolonie abgebildet werden überwinden.

Wir haben auch festgestellt, dass der 20% Aceton: 80% Methanol-Lösung ist die optimale Mittel zur Befestigung Kolonien in Basalmembran-Matrix eingebettet ist, im Vergleich zur Verwendung anderer Befestigungsmittel, wie Paraformaldehyd mit Triton-X Lösung. Wir haben gefunden, daß das Aceton: Methanol Fixiermittel verbessert Immunmarkierung und dazu neigt, Hintergrundautofluoreszenz zu verringern. Jedoch ist die Optimierung des Färbeverfahrens in jedem Experiment erforderlich ist, um die optimale Antikörperverdünnungen, die von denen in der Regel für Monoschicht-Färbung eingesetzt unterscheiden könnte bestimmen. Die meisten Antibodies, dass die Arbeit an Monoschichten kann für 3D-Immunfärbung verwendet werden. Jedoch kann die Länge der Inkubation mit dem Antikörper zu variieren, und dies wird auf individueller Basis bestimmt werden.

Imaging 3D-Kulturen für Immunfluoreszenz-Untersuchungen können einige Herausforderung 8 darstellen. Um das Problem der "Unschärfe / Körnigkeit" durch die Dicke der Probe zu überwinden, können bestimmte Schritte unternommen, um die Qualität des Bildes wie Erwerb Z-Stapel der Probe oder zunehmender Belichtungszeit und zunehmende Rahmennummer durchschnittliche verbessern . Dies ist äußerst vorteilhaft, stern unterscheiden (invasiven) im Vergleich zu kugelförmigen Morphologie statt Erfassen eines Bildes in einer Ebene. Die Z-Stapel abgebildet können verarbeitet werden, um ein 3D-Bild der Probe, die die Immunfärbung machen. Zusätzlich hatte der MDA-MB-231 MCF10A oder Zelllinien, die wir erfolgreich gebildeten Zellaggregate über den Zeitraum gezüchtet. So waren wir in der Lage, den Standort prüfenund Veränderungen in der Expression der Zellpolarität Marker in 3D-Kulturen durch Immunofluoreszenz. Alternativ zelluläre Aggregate, bevor sie in die Basalmembran-Matrix angeordnet vorgeformt werden und die Lokalisierung der Proteine ​​von Interesse können dann bewertet werden.

Zum Schluss wird die Vielfalt der möglichen Anwendungen ist die Verwendung von 3D-Kulturen ein dynamischer Test, der mit einem breiten Spektrum von Zellen verwendet werden kann, ob pathologischen und / oder normalen Ursprungs so dass für die Auswertung der Veränderungen der zellulären Morphologie und Invasion in fixierten Proben oder in Echtzeit 18,19,24.

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Disclosures

Wir haben nichts zu offenbaren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 ml tubes VWR CA10011-700 Sterile, disposable
100-mm culture dish BD353003 VWR CABD353003 Sterile, disposable
15 ml Falcon tube VWR CA21008-918 Sterile, disposable
1 ml filtered tips VWR 10011-350 Sterile, disposable
200 μl filtered tips VWR 22234-016 Sterile, disposable
20 μl filtered tips VWR 22234-008 Sterile, disposable
35-mm glass-bottomed Confocal No.1 culture dishes  MatTek Corporation P35G-1.0-14-C Precooled before use
Bovine serum albumin (BSA) BioShop ALB003.100 Used at 3% for IF
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed Life Technologies  A11029 1:250 for IF
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody Life Technologies  A11011 1:1,200 for IF
Anti-Beta-Catenin  BD Transduction Laboratories 610153 Mouse-monoclonal; Used at 1:100 for IF
Fetal bovine serum (FBS) Sigma F1051 Used at 10% (v/v) 
Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) - 10 mg⁄ml Solution in Water Life Technologies H3569 Used at 0.1% (1:10,000 dilution)
InVivo Analyzer Suite  Media Cybernetics Used for 3D culture imaging (DIC images at 10X and 40X)
Kisspeptin-10 (KP-10) EZ Biolabs PT0512100601 Used at 100 nM 
Anti-Laminin  Cedarlane AB19012(CH) Rabbit-polyclonal full length human; Used at 1:100 for IF
LSM-510 META laser scanning microscope  Zeiss Used at 63X objective; oil immersion lens
Matrigel phenol red free (BD356237) VWR CACB356237  Lot No.2180819; 10.4 mg/ml
Olympus IX-81 microscope  Olympus Used for 3D culture imaging (DIC images at 10X and 40X)
Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml) Life Technologies 15140-122 Antibiotic (added to media; used at 0.01%)
10 ml pipette VWR CA53300-523 Sterile, disposeable
RPMI 1640 Medium with Glutamine Life Technologies 11875-119 Used for culturing of MDA-MB-231 cells
0.25% Trypsin-EDTA (1x), Phenol Red Life Technologies 25200-072 Used to trypsinize MDA-MB-231 cells
MEGM (bullet kit): MEBM (CC3151)+Single quots (CC4136) Lonza CC-3150 Used for culturing of MCF10A cells

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References

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