फ्लो द्वारा प्राथमिक प्रतिरक्षा सेल subpopulations साथ फ्लोरोसेंट Nanoparticle बातचीत का पता लगाने

1Center for Micro-BioRobotics @SSSA, Istituto Italiano di Tecnologia, 2Department of Biology, University of Pisa, 3Center for Biomolecular Nanotechnologies @UniLe, Istituto Italiano di Tecnologia
Published 3/28/2014
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Immunology and Infection
 

Summary

फ्लो से प्रतिरक्षा कोशिकाओं की परिभाषित subpopulations साथ nanoparticle बातचीत का विश्लेषण.

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Gamucci, O., Bertero, A., Malvindi, M. A., Sabella, S., Pompa, P. P., Mazzolai, B., et al. Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (85), e51345, doi:10.3791/51345 (2014).

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Abstract

इंजीनियर नैनोकणों चिकित्सीय और नैदानिक ​​प्रयोजनों के लिए बहुत आशाजनक गुणों के साथ संपन्न होते हैं. इस काम के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ nanoparticle बातचीत का अध्ययन फ्लो द्वारा विश्लेषण के लिए एक तेज और विश्वसनीय विधि का वर्णन करता है. प्राथमिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं को आसानी से एंटीबॉडी की मध्यस्थता चुंबकीय अलगाव से मानव या माउस ऊतकों से शुद्ध किया जा सकता है. पहले उदाहरण में, एक प्रवाह cytometer में चल रहे अलग सेल आबादी आंतरिक जटिलता सेल सेल से संबंधित आकार के लिए आनुपातिक है जो आगे बिखरे हुए प्रकाश (एफएससी), और एक ओर बिखरे हुए प्रकाश (एसएससी) द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता. इसके अलावा, विशिष्ट कोशिका की सतह रिसेप्टर्स के खिलाफ fluorescently लेबल एंटीबॉडी ही नमूना भीतर कई subpopulations की पहचान की अनुमति. कोशिकाओं को अपनी शारीरिक और रूपात्मक राज्य है कि परिवर्तन बाहरी उत्तेजनाओं द्वारा बढ़ाया जाता है अक्सर, जब इन सभी सुविधाओं के लिए अलग अलग. इधर, 50 एनएम FITC-2 Sio नैनोकणों वीं की पहचान करने के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैंमानव रक्त प्रतिरक्षा कोशिकाओं में nanostructured सामग्री की ई internalization. सेल प्रतिदीप्ति और एक ओर बिखरे हुए प्रकाश वृद्धि नैनोकणों के साथ ऊष्मायन के बाद हमें समय और nanoparticle सेल बातचीत की एकाग्रता निर्भरता को परिभाषित करने की अनुमति दी. इसके अलावा, इस तरह के प्रोटोकॉल प्राथमिक microglia, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं, विशेष रूप से monocyte / बृहतभक्षककोशिका वंश में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्यक्त कि उत्परिवर्ती चूहों से अलग साथ rhodamine-2 Sio nanoparticle बातचीत की जांच के लिए बढ़ाया जा सकता है. कोशिकाओं में nanoparticle internalization से संबंधित डेटा confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा पुष्टि की गई है cytometry अंत में, प्रवाह.

Introduction

इंजीनियर nanomaterials आजकल biomedicine 1 के लिए संभावित अनुप्रयोगों के लिए जीवन वैज्ञानिकों के हित प्रेरणादायक हैं. अकार्बनिक और कार्बनिक पदार्थों की एक विस्तृत विविधता शारीरिक अलग अलग आकार, और रासायनिक विशेषताओं के साथ nanostructures के उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इन इमारतों में से, गोलाकार आकृति के इंजीनियर नैनोकणों नैदानिक ​​और translational चिकित्सा 2 के लिए महान क्षमता का प्रदर्शन किया. अपने मूल और सतह डिजाइन एक संभव आवेदन के द्वारा संचालित कर रहे हैं और यह nanoparticle संपर्क और बातचीत निम्नलिखित लक्ष्य सेल प्रतिक्रिया का एक गहरा अध्ययन निकलता है. जानबूझकर मानव विषयों को दिलाई माना जाता है कि नैनोकणों प्रतिरक्षा कोशिकाओं के कई प्रकार के साथ सीधे संपर्क में आ जाएगा. शरीर अखंडता बनाए रखने के लिए उनकी जिम्मेदारी उन्हें nanomedicine 3 में जांच का एक महत्वपूर्ण विषय बना देता है.

सहज प्रतिरक्षा प्रणाली के सेलुलर हिस्सा मुख्य रूप से फागो द्वारा प्रतिनिधित्व किया हैcytes. उनमें से, monocyte / बृहतभक्षककोशिका वंश केंद्रीय तंत्रिका तंत्र निवासी microglia सहित निकाली गई कोशिकाओं, प्रतिरक्षा रक्षा 4,5 में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. वे विदेशी निकायों के साथ सामना करने के बाद कुछ ही घंटों के भीतर सुरक्षा प्रतिक्रियाओं को गति प्रदान करने में सक्षम हैं. इसके अलावा, monocytic कोशिकाओं समन्वय और साइटोकिन्स की रिहाई के माध्यम से अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया हिदायत. इन सभी घटनाओं के भी काफी हद तक प्रतिरक्षा प्रणाली 6 से "nonself" के रूप में माना जाता है जो माल इंजीनियर, की उपस्थिति में होते हैं.

ऐतिहासिक रूप से सेल विश्लेषण के लिए इम्यूनोलॉजी में इस्तेमाल किया तरीकों के अलावा, सबसे शक्तिशाली उपकरणों में से एक का प्रतिनिधित्व करता है प्रवाह cytometry. इसके अलावा, (अक्सर अपवर्जन या एक ही झिल्ली प्रोटीन की उपस्थिति का शोषण) एक विशिष्ट प्रतिरक्षा subpopulation की पहचान या शोधन के लिए प्रौद्योगिकी की उपलब्धता की अनुमति देता है कि विशेष रूप से प्राथमिक CE पर एक निश्चित nanoparticle के प्रभाव का एक सटीक जांचडालूँगा प्रकार 7. हालांकि, कोशिकाओं नैनोकणों के लिए जोखिम के बाद शारीरिक और रूपात्मक परिवर्तन उपस्थित हो सकता है. साथ ही, नैनोकणों प्राप्त परिणामों 8 को प्रभावित करने, परिभाषित तरंग दैर्ध्य में इस तरह के प्रकाश का अवशोषण या उत्सर्जन के रूप में विशिष्ट ऑप्टिकल मापदंडों के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं. तो, उपयोग और उपन्यास सामग्री का अध्ययन करने के लिए शास्त्रीय प्रतिरक्षाविज्ञानी assays के अंतिम रूपांतरों की सीमा पर विचार किया जाना चाहिए.

इस काम के प्रवाह cytometry द्वारा प्राथमिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ nanoparticle बातचीत का पता लगाने का सवाल है. इस मुद्दे के समाधान के लिए, 50 एनएम FITC-2 Sio नैनोकणों विधि का वर्णन करने के लिए एक मॉडल nanomaterial के रूप में कार्यरत थे. सिलिका कणों नैनो मीट्रिक पैमाने में एक बहुत ही सटीक तरीके से उत्पादन किया जा सकता है. इस तरह के आरोप या hydrophobicity के रूप में आकार, आकार, और सतह गुण,, सूक्ष्मता उनके biocompatibility 9 बढ़ाने के लिए देखते जा सकता है. 2 नैनोकणों उन्हें एक के रूप में इस्तेमाल करने की अनुमति दे SiO की कई विशेषताएंदवा वितरण के लिए मॉडल 10 कण. इसके अलावा, फ्लोरोसेंट रंगों या क्वांटम डॉट्स फँस या इमेजिंग प्रयोजनों के लिए 11 उपयोगी नैनो उपकरणों की पेशकश इन कणों से जोड़ा जा सकता है.

Protocol

नैतिकता वक्तव्य

मानव और पशुओं के नमूने स्वास्थ्य इतालवी मंत्रालय के दिशा निर्देशों का पालन प्रोसेस किया गया, कानून 116/92 और यूरोपीय समुदाय परिषद निर्देशक 86/609/EEC.

1. Monocyte सेल संस्कृतियों

  1. 10% मानव सीरम, 50 यू / एमएल पेनिसिलिन और 50 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.05 मिमी β-mercaptoethanol के साथ पूरक RPMI 1640 मध्यम युक्त टी 75 बोतल में संस्कृति मानव THP-1 कोशिकाओं.
  2. स्प्लिट संस्कृतियों जब मिला हुआ (हर 3-5 दिन).

2. बफी कोट से परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMCs) का अलगाव

  1. अलगाव प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले, फॉस्फेट buffered खारा (पीबीएस) 7.2 पीएच की एक समाधान तैयार, 2 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA), बफर (1 Rinsing 95 मिलीलीटर 5 मिलीलीटर बीएसए स्टॉक समाधान जोड़ने 0.5% गोजातीय सीरम albumin (BSA),: 20 कमजोर पड़ने). बफर देगास और 2-8 (ठंडा रखने के लिए यहडिग्री सेल्सियस).
    महत्वपूर्ण: बुलबुले अलगाव स्तंभ (3.2 कदम देखें) ब्लॉक कर सकते हैं, क्योंकि बफर कम इष्टतम परिणामों में हो सकता है देगास करने में विफलता.
    नोट: anticoagulant साइट्रेट डेक्सट्रोज सूत्र-A (एसीडी-ए) या ​​साइट्रेट फॉस्फेट डेक्सट्रोज (सीपीडी) वैकल्पिक रूप से इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके विपरीत, अन्य प्रजातियों से अन्य एल्बुमिन प्रोटीन या सीरा बीएसए बदल सकते हैं. सीए 2 + या 2 मिलीग्राम + युक्त बफ़र्स का उपयोग न करें.
  2. (20-60 साल आयु वर्ग) स्वस्थ दाताओं से बफी कोट प्राप्त करते हैं.
  3. घनत्व ढाल centrifugation के लिए 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों तैयार. रक्त प्रोसेसिंग (प्रत्येक ट्यूब पतला रक्त की 35 मिलीलीटर की प्रक्रिया कर सकते हैं) और प्रत्येक खाली ट्यूब Ficoll-Paque के 15 मिलीलीटर जोड़ने के लिए आवश्यक ट्यूबों की संख्या निर्धारित करते हैं.
  4. पीबीएस / बीएसए / EDTA समाधान (1:04 कमजोर पड़ने) का 24 मिलीलीटर के साथ रक्त के 8 एमएल पतला.
  5. सावधानी (घनत्व = 1.077 मिलीग्राम / छ) 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों में से प्रत्येक में Ficoll-Paque के शीर्ष पर पतला समाधान परत. मिश्रण मत करोरक्त और Ficoll-Paque.
    महत्वपूर्ण: रक्त और Ficoll-Paque के मिश्रण से बचने के लिए, एक 45 डिग्री के कोण पर ट्यूब पकड़ और धीरे धीरे रक्त मिश्रण परत.
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र Mononuclear कोशिकाओं (एमएनसी) granulocytes और एरिथ्रोसाइट्स तलछट जबकि वजह Ficoll-Paque के आसमाटिक दबाव में उच्च घनत्व के लिए, प्लाज्मा Ficoll-Paque इंटरफेस में रहेगा.
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर पीबीएस / बीएसए / EDTA और अपकेंद्रित्र से भरा एक नया 50 मिलीलीटर ट्यूब को अंतरावस्था कोशिकाओं (परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear, PBMCs) स्थानांतरण
  8. प्लेटलेट्स निकालने के लिए पीबीएस / बीएसए / EDTA के साथ दो बार गोली धो लें. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 200 XG पर स्पिन
  9. 10% मानव सीरम और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ या monocytes शुद्धि के लिए आगे बढ़ना पूरा RPMI 1640 में संस्कृति कोशिकाओं.

3. PBMCs से प्राथमिक monocytes के शोधन

  1. हम का उपयोग चुंबकीय मनका जुदाई से PBMCs से monocytes पृथकएक पैन एककेंद्रकश्वेतकोशिका अलगाव किट:
    1. संभव सेल clumps को दूर करने के लिए एक 30 माइक्रोन नायलॉन जाल (preseparation फिल्टर, 30 माइक्रोन) के माध्यम से कोशिकाओं से गुजरती हैं.
    2. एक hemocytometer का उपयोग सेल संख्या निर्धारित करते हैं.
    3. कमरे के तापमान (आर टी) पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र. महाप्राण पूरी तरह से सतह पर तैरनेवाला.
    4. 10 7 कुल कोशिकाओं प्रति पीबीएस / EDTA / बीएसए बफर के 30 μl में resuspend सेल गोली.
    5. 10 7 कुल कोशिकाओं प्रति अभिकर्मक ब्लॉकिंग 10 μl FCR जोड़ें.
    6. 10 7 कुल कोशिकाओं प्रति बायोटिन एंटीबॉडी कॉकटेल के 10 μl जोड़ें.
    7. अच्छी तरह मिक्स और 2-8 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेते
    8. 10 7 कुल कोशिकाओं प्रति बफर के 30 μl जोड़ें.
    9. 10 7 कुल कोशिकाओं प्रति विरोधी बायोटिन microbeads की 20 μl जोड़ें.
    10. अच्छी तरह मिक्स और 2-8 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेते
    11. पीबीएस / EDTA / बीएसए बफर के 500 μl में 10 8 कोशिकाओं के लिए ऊपर Resuspend.
  2. चुंबकीय separसमझना
    1. तदनुसार कुल सेल नंबर करने के लिए, एक उपयुक्त एमएसीएस स्तंभ और एमएसीएस विभाजक (एमएसीएस स्तंभ डेटा पत्रक देखें) का चयन करें.
    2. एमएसीएस विभाजक के चुंबकीय क्षेत्र में स्तंभ रखें.
    3. पीबीएस / EDTA / बीएसए बफर की उचित राशि के साथ rinsing द्वारा स्तंभ तैयार (एमएस कॉलम: 500 μl, रास कॉलम: 3 मिलीग्राम).
      नोट: कॉलम "प्रवाह बंद 'कर रहे हैं और सूखी नहीं चला है.
    4. स्तंभ पर सेल निलंबन लागू करें. समृद्ध एककेंद्रकश्वेतकोशिका अंश का प्रतिनिधित्व unlabeled कोशिकाओं से युक्त प्रवाह के माध्यम से ले लीजिए.
    5. पीबीएस / EDTA / बीएसए बफर (एमएस के लिए 500 μl और धोने के प्रति लोकसभा के लिए 3 मिलीग्राम) के साथ स्तंभ 3x धो लें.
    6. समृद्ध monocyte कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करने के माध्यम से गुजरती हैं कि unlabeled कोशिकाओं लीजिए, और खंड 3.2.4 से प्रवाह के माध्यम से जोड़ने के लिए.
      नोट: स्तंभ जलाशय खाली होने पर ही पीबीएस / EDTA / बीएसए बफर aliquots जोड़कर स्तंभ धो लें.
    7. (वैकल्पिक) से स्तंभ निकालेंविभाजक और एक उपयुक्त संग्रह ट्यूब पर जगह है. स्तंभ पर बफर पिपेट (: 1 मिलीलीटर, रास कॉलम: एमएस कॉलम 5 एमएल). तुरंत मजबूती स्तंभ में सवार धक्का द्वारा चुंबकीय लेबल nonmonocyte कोशिकाओं को बाहर निकलवाने.
    8. संस्कृति 10% मानव सीरम और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरा RPMI 1640 में monocytes शुद्ध किया.

4. पूरे रक्त से प्राथमिक monocytes के शोधन

  1. निर्माता के निर्देशों का पालन पूरे रक्त monocyte अलगाव किट का उपयोग पूरे खून से monocytes शुद्ध.

5. रक्त leukocytes और शुद्ध Monocytes में nanoparticle internalization

  1. 12 अच्छी तरह से थाली में पृथक PBMCs या शुद्ध CD14 सकारात्मक monocytes की प्लेट 5 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल (1 मिलीग्राम / अच्छी तरह से).
  2. 100 एनएम के एक काम एकाग्रता को पूरा मध्यम में भंवर FITC-2 Sio nanoparticle शेयर समाधान और resuspend.
  3. काम करने nanop के 10 μl जोड़ें1 एनएम के एक nanoparticle अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने के लिए इलाज के नमूने के लिए लेख निलंबन (100 एनएम). प्रत्येक अच्छी तरह से अनुपचारित नियंत्रण के लिए पूरा मध्यम के समान मात्रा में जोड़ें.
  4. 1 घंटा internalization एक 1.5 मिलीलीटर polypropylene ट्यूब में नमूने लेने और आरटी पर 6000 XG पर 3 मिनट के लिए उन्हें अपकेंद्रित्र के बाद.
  5. आरटी पर 6000 XG पर बफर 3 मिनट चलाने का 1 मिलीलीटर के साथ गोली धोने.
  6. चल बफर के 200 μl में गोली Resuspend. कोशिकाओं को अब फ्लो से पढ़ने के लिए तैयार हैं.

6. प्राथमिक मिश्रित Glial संस्कृतियों का अलगाव (Bertero देखें एट अल. 7)

7. एक मिश्रित Glial मिला हुआ सेल संस्कृति Replating

  1. फिर Versene के 10 एमएल जोड़ें और 5-7 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं, (डब्ल्यू / सीए 2 + / 2 मिलीग्राम + O) पीबीएस के 10 एमएल के साथ एक बार एक टी -75 फ्लास्क धो लें.
  2. टी -75 सतह से कोशिकाओं को अलग और भंग करने के क्रम में ऊपर और नीचे कई बार सतह पर तैरनेवाला पिपेटसेल समुच्चय.
  3. एक 15 मिलीलीटर polypropylene ट्यूब में सेल निलंबन स्थानांतरण. एक hemocytometer साथ कोशिकाओं गिनती करने के लिए सेलुलर निलंबन की एक छोटी राशि ले लीजिए.
  4. आरटी पर 300 XG पर 5 मिनट के लिए सेल निलंबन अपकेंद्रित्र.
  5. सतह पर तैरनेवाला निकालें और glial पूरी संस्कृति के माध्यम में 5 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में गोली resuspend.
  6. 24 अच्छी तरह से थाली में 0.5 मिलीग्राम / अच्छी तरह से थाली और कोशिकाओं nanoparticle उपचार से पहले 2-4 घंटे के लिए समझौता करते हैं.

8. Microglia में nanoparticle internalization

  1. प्रत्येक अच्छी तरह से (अनुपचारित नियंत्रण के लिए) पूरा glial संस्कृति के माध्यम से 500 μl या (इलाज के नमूने के लिए) पूरा glial संस्कृति के माध्यम में एक 2x rhodamine-2 Sio nanoparticle निलंबन के 500 μl जोड़ें.
  2. चुने हुए समय बिंदुओं पर nonrapid पालन कोशिकाओं की टुकड़ी की अनुमति है और 2 मिलीलीटर polypropylene ट्यूब में उन्हें इकट्ठा करने के लिए कोशिकाओं पिपेट.
  3. 500 μl जोड़ेंVersene की अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं, तो शेष सेल अंश अलग और पिछले चरण की इसी nonadhering कोशिकाओं के साथ प्रत्येक नमूने इकट्ठा.
  4. आरटी पर 300 XG पर 3 मिनट के लिए नमूने अपकेंद्रित्र.
  5. चल बफर autoMACS के 100 μl में गोली Resuspend.

9. CD11b-VioBlue साथ धुंधला हो जाना

  1. बफर चलाने में सेल निलंबन (1:11 अनुपात) के 100 μl को VioBlue-CD11b मानव / माउस एंटीबॉडी के 10 μl जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट सेते
  2. चल बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ें और सेल निलंबन मिश्रण.
  3. 300 x जी पर 3 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र प्रत्येक नमूना.
  4. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और बफर चलाने का 100-150 μl में गोली resuspend.
  5. Cytometer के लिए नमूने पढ़ें (पिछले दो चरणों के बीच 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की दुकान).
    महत्वपूर्ण: नमूनों का विश्लेषण करने से पहले, अतिव्यापी संकेतों के मुआवजे के लिए आगे बढ़ना मैंn उत्सर्जन स्पेक्ट्रा अलग fluorochromes (fluorochrome संयुग्मित नैनोकणों या एंटीबॉडी) के बीच मनाया.

10. मुआवजा पर स्पेक्ट्रल बिखेर

  1. "साधन सेटिंग्स" बॉक्स (सभी साधन सॉफ्टवेयर प्रोग्राम में उपस्थित) खोलें.
    नोट: सामग्री तालिका में रिपोर्ट एक से एक अलग साधन का उपयोग करते हैं, तो अधिग्रहण विवरण के लिए साधन विशिष्ट मैनुअल को देखें.
  2. कम fluidic गति (साधन के द्वारा की अनुमति हो तो) पर (नैनोकणों के बिना) अनुपचारित नमूना मोल. अधिग्रहण के दौरान, मैन्युअल वोल्टेज चैनलों के विनियमन के द्वारा आगे को समायोजित करने और पक्ष बिखरने (क्रमशः FSC और एसएससी,).
    नोट: सबसे अच्छा साजिश में पूरी सेल की आबादी कल्पना करने के क्रम में एसएससी और FSC अक्ष तराजू संशोधित करें. ब्याज की प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए टेम्पलेट स्थापित करने के एक साधन बनाया बचाया और भविष्य के अधिग्रहण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  3. विशिष्ट खोलेंसॉफ्टवेयर में "क्षेत्र" टैब. वांछित आबादी के आस - पास एक उपयुक्त बड़े क्षेत्र ("गेट") आकर्षित.
    नोट: नैनोकणों के internalization कोशिकाओं की एक एसएससी बदलाव लाती है. गेट भी बारीकी से ब्याज की सेल की आबादी के आसपास ही सीमित है, तो हासिल कर ली डेटा शायद पता लगाया जा करने के लिए कोशिकाओं का हिस्सा याद करेंगे.
  4. दो बेदाग नमूने, रिक्त नमूने के रूप में उपयोग के लिए एक और गड़बड़ी धुंधला (वैकल्पिक) के खिलाफ मुआवजे के लिए एक, मुआवजा दिया जाना प्रत्येक प्रतिदीप्ति चैनल के लिए उपयुक्त fluorochrome साथ एक एकल दाग नमूना प्रयोग करें.
    नोट: प्रयोग लेबलिंग में प्रयोग की जाने वाली प्रत्येक fluorochrome संयुग्मित एंटीबॉडी के लिए एक अलग 1.5 एमएल नमूना ट्यूब का प्रयोग करें.
  5. "साधन सेटिंग्स" बॉक्स में "मुआवजा टैब" खोलें. बढ़ाएँ या spillover चैनल में प्रतिदीप्ति तीव्रता fluorochrome स्थिति के लिए लगभग एक ही है जब तक अधिग्रहण के दौरान मुआवजा कारक कमीitive और नकारात्मक आबादी.
  6. मुआवजा समायोजित किया गया है के बाद nanoparticle में इलाज के नमूने मोल.

Representative Results

Cytometry विभिन्न कोशिकाओं की पहचान और चिह्नित करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है और यह इस तरह के monocytes, granulocytes, टी कोशिकाओं बी कोशिकाओं, प्राकृतिक हत्यारा (एन.के. सेल), वृक्ष के समान कोशिकाओं (DCs) के रूप में विशिष्ट प्रतिरक्षा कोशिकाओं की पहचान के लिए पसंद की तकनीक है, प्रवाह और leukocytes के अन्य subpopulations.

बेहतर नैनोकणों के जवाब में सफेद रक्त कोशिकाओं के व्यवहार को चिह्नित करने के प्रयास में, हम (THP-1 कोशिकाओं, चित्रा 3) स्वस्थ दाताओं की रक्त (आंकड़े 1 और 2) से और मानव monocyte सेल लाइन के साथ अलग प्राथमिक leukocytes साथ internalization assays प्रदर्शन किया .

चित्रा 1 ए में सूचना दी, तीन प्रमुख रक्त ल्युकोसैट subpopulations स्पष्ट रूप से PBMCs अलगाव के बाद आगे और पक्ष बिखरने से पहचान की गई. इसके अलावा, FITC-2 Sio उपचार के बाद, लिम्फोसाइटों (ग्रे), monocytes (नीला) और granulocytes (लाल) एक अलग n हैके रूप में हरी प्रतिदीप्ति तीव्रता (चित्रा 1 बी) के द्वारा दिखाया anoparticle internalization दर. वर्णित प्रोटोकॉल PBMCs से प्राथमिक CD14 सकारात्मक monocytes की शुद्धि. चित्रा 2A FITC-2 Sio की उपस्थिति में CD14 + monocytes के डॉट साजिश प्रवाह cytometry रिपोर्ट की अनुमति देता है. चित्रा 2B से पता चलता है कि एक ही कोशिकाओं में मात्रा और में व्यक्त FITC-2 Sio internalization लघुगणक स्केल हिस्टोग्राम.

इसी प्रकार internalization प्रयोगों FITC-2 Sio नैनोकणों की बढ़ती सांद्रता के साथ इलाज THP-1 monocytes पर प्रदर्शन किया गया. अनुपचारित कोशिकाओं नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया. चित्रा 3A THP-1 सेल लाइन में बिखरने एक अपरिवर्तित के साथ आगे की ओर बिखरने में एक खुराक पर निर्भर वृद्धि दर्शाता है. चित्रा 3 बी में एक साथ परीक्षण किया गया प्रत्येक FITC-2 Sio nanoparticle एकाग्रता में एसएससी और FSC की histograms के साथ, प्रतिदीप्ति तीव्रता मतलब (एमएफआई) मात्रा का ठहराव प्रस्तुत किया है. इस डेटा FITC-2 Sio नैनोकणों के साथ इलाज intracellular विघटन की वृद्धि (पक्ष बिखरने) और प्रतिदीप्ति (ग्रीन चैनल) से प्रकाश डाला monocytes में एक खुराक पर निर्भर internalization लाती है सुझाव देते हैं.

प्रतिरक्षा कोशिकाओं और नैनोकणों के बीच बातचीत के प्रकार में आगे अंतर्दृष्टि लाभ, प्राथमिक मिश्रित glial संस्कृतियों अलग थे और microglia, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं, शुद्ध किया गया था. हरी फ्लोरोसेंट microglia व्यक्त एक ट्रांसजेनिक माउस मॉडल का उपयोग विभिन्न न्यूरो भड़काऊ तंत्र के दृश्य परमिट. इस काम में इस्तेमाल ट्रांसजेनिक माउस B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / जम्मू CX3CR1 प्रमोटर 12 के नियंत्रण में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्यक्त करता है. इन विट्रो (DIV) में 7 दिनों के बाद, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी astrocytes की एक बड़ी संख्या (GFP नकारात्मक पक्षपाती सेल के साथ एक मिश्रित प्राथमिक glial संस्कृति से पता चलता हैएस) और कुछ हरे कोशिकाओं (GFP सकारात्मक, चित्रा 5A). GFP - - (astrocytes और अन्य glial कोशिकाओं), microglial CD11b + + GFP कोशिकाओं का एक दूसरा विशिष्ट समूह है, और पहली बार एक CD11b: इस माउस मॉडल में, तीन glial subpopulations एक एकल CD11b एंटीबॉडी धुंधला के साथ प्रवाह cytometry द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता तीसरे CD11b + GFP - subpopulation (चित्रा -4 ए). विश्लेषण (चित्रा 4 बी) प्रवाह cytometry द्वारा दिखाया के रूप में इन दोनों के बाद के subpopulations, दोनों (CX3CR1 प्रमोटर के प्रतिलेखन द्वारा गश्त अपरिपक्व microglia प्रतिनिधित्व) + GFP आबादी द्वारा एक मामूली वृद्धि की दक्षता के साथ नैनोकणों internalize करने में सक्षम हैं. हुआ internalization आगे चित्रा 5B में दिखाया गया है rhodamine-2 Sio नैनोकणों के एक ही अंतिम एकाग्रता का उपयोग कर confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा सत्यापित किया जा सकता है.


चित्रा 1. तीन प्रमुख रक्त ल्युकोसैट के अलग रक्त leukocytes ओर बिखरने बनाम (एफएससी) बिखरने. ए) प्रतिनिधि आगे में FITC-2 Sio nanoparticle internalization (एसएससी) Ficoll-Paque अलग रक्त leukocytes के डॉट साजिश प्रवाह cytometry. बी) हरी प्रतिदीप्ति ओवरले हिस्टोग्राम साजिश 1 घंटे के लिए 1 एनएम FITC-2 Sio नैनोकणों (45 एम वी) की उपस्थिति में सेल subpopulations. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
बनाम (एफएससी) बिखरने FITC-2 Sio nanoparticle CD14 में internalization + शुद्ध monocytes. ए) प्रतिनिधि आगे (एसएससी) शुद्ध किया CD14 सकारात्मक monocytes के डॉट साजिश प्रवाह cytometry. बी) हरी प्रतिदीप्ति हिस्टोग्राम साजिश 1Nm FITC-SiO 1 घंटे के लिए 2 नैनोकणों (45 एम वी). इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3. THP-1 कोशिकाओं पक्ष scatterin बनाम (एफएससी) बिखरने. ए) प्रतिनिधि आगे पर FITC-2 Sio nanoparticle internalization का प्रभावजी (एसएससी) आगे (एफएससी) और हरे रंग बिखरने ओर बिखरने की एकाग्रता. बी) एकाग्रता पर निर्भर भिन्नता (एसएससी) में वृद्धि FITC-2 Sio नैनोकणों के 1 घंटा प्रदर्शन के बाद, THP-1 एककेंद्रकश्वेतकोशिका सेल लाइन की डॉट साजिश प्रवाह cytometry FITC-SiO 1 घंटे के लिए 2 नैनोकणों (45 एम वी) की उपस्थिति में प्रतिदीप्ति. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
चित्रा 4. जनसंपर्क के डॉट साजिश cytometry CD11b-VioBlue प्रवाह बनाम rhodamine-SiO B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / जम्मू चूहों से अलग प्राथमिक microglia में 2 nanoparticle internalization. ए) हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP)B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / जम्मू चूहों से अलग imary मिश्रित glia. CD11b + + GFP और CD11b + GFP -. आबादी 30 के लिए क्रमश: ऊपरी सही और कम सही quadrants, बी) 1 एनएम rhodamine-2 Sio नैनोकणों (45 एम वी) की उपस्थिति में microglia subpopulations की लाल प्रतिदीप्ति ओवरले हिस्टोग्राम साजिश में दिखाए जाते हैं मिनट नियंत्रण (ग्रे हिस्टोग्राम) बनाम (लाल हिस्टोग्राम). इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
चित्रा 5. 7 DIV और (बी) Confocal माइक्रोस्कोपी पर + GFP-microglia के दृश्य. (ए) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपीrhodamine-2 Sio nanoparticle internalization + GFP-microglia में (लाल तीर) के. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Discussion

प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल ध्यान में रखा जाना करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण बिंदुओं को प्रस्तुत करता है. यह उच्च तापमान और रोशनी नकारात्मक धुंधला उपज को प्रभावित कर सकता है, क्योंकि सब धुंधला चरणों के दौरान (बर्फ पर) 4 डिग्री सेल्सियस और संभवतः अंधेरे में काम करने के लिए वास्तव में महत्वपूर्ण है. नैनोकणों बेहतर बस का उपयोग करने से पहले resuspended होने के लिए sonicated जा सकता है.

Cytometry विश्लेषण एक सही प्रवाह विभिन्न चैनलों में एक सही अंशांकन की आवश्यकता है. साधन की कैलिब्रेशन हर प्रयोगात्मक सत्र से पहले किया जाना चाहिए. इंस्ट्रूमेंटेशन के साथ तकनीकी मुद्दों के अलावा, यह भी एंटीबॉडी लेबलिंग के साथ समस्या हो सकती है. यह एक उपयुक्त एकाग्रता में एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए अनिवार्य है. एकाग्रता बहुत अधिक या बहुत कम है, तो dissatisfying संकेत तीव्रता परिणाम हो सकते हैं.

इस तकनीक चिंता का नुकसान monodisperse नमूनों के साथ काम करने की जरूरत है, असमर्थता स्थानीय बनानासंकेत (यानी विभिन्न सेलुलर डिब्बों) की उत्पत्ति की साइट. संयोजन में इस्तेमाल किया जा fluorochromes के चुनाव में कुछ सीमाएं भी हैं: उत्तेजना और उत्सर्जन बैंड की तरंग दैर्ध्य पर्याप्त उनके उचित माप अनुमति देने के लिए अलग किया जाना चाहिए. इस्तेमाल किया एंटीबॉडी स्पेक्ट्रा ओवरलैप करते हैं, तो एक सही मुआवजा की आवश्यकता है.

प्रवाह cytometry उपस्थिति या नैनोकणों के अभाव में सेल के विश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली तरीका है. इस तकनीक में एक सेल का एक multiparametric अध्ययन, जांच की घटनाओं का एक उच्च संख्या परमिट, विश्लेषण (1,000 से अधिक कोशिकाओं / सेक), reproducibility और सांख्यिकीय रीडिंग की तीव्रता. नमूने सेल व्यवहार्यता को खोने के बिना संसाधित किया जा सकता है.

Fluorescently लेबल नैनोकणों का उपयोग करके यह कोशिका झिल्ली पर उजागर विशिष्ट मार्करों से पहचाना जाता है जो सेल subpopulations, में उनके internalization अर्हता प्राप्त करने और यों के लिए संभव है. सेल मानकों एस की उपस्थिति में बदल सकते हैं pecific नैनोकणों. अनुसंधान के उद्देश्य पर निर्भर करता है, इन बदलावों ऐसे आनुपातिक बढ़ती nanoparticle internalization दर के साथ बढ़ जाती है कि कोशिकाओं की ओर बिखरने के रूप में, एक विशिष्ट घटना की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

कोशिका की सतह के nanoparticle प्रेरित संशोधनों भी तकनीक की एक सीमा का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं. इस कारण से, कोशिका झिल्ली रिसेप्टर्स कारोबार हमेशा ध्यान में रखा जाना चाहिए और संभवतः ठीक ब्याज की सेल की आबादी को चिह्नित करने के लिए अग्रिम में जाना जाता है. Nanoparticle अतिभारित नमूनों में झिल्ली असमस की चरम impairments सेल मौत का कारण हो सकता है.

Nanomaterial खुराक पर निर्भर विषाक्तता अनुभव से प्रत्येक सेल की आबादी के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए. स्पष्ट रूप से परिभाषित मृत कोशिकाओं प्रतिदीप्ति मात्रा का ठहराव से बाहर रखा जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, Annexin वी / पीआई धुंधला आमतौर पर परिगलित और apoptotic दोनों कोशिकाओं का पता लगाने के लिए इस्तेमाल कई तरीकों में से एक है.

"> GFP-व्यक्त प्राथमिक कोशिकाओं को भी एक निश्चित सेल subpopulation का चयन करें और prelabeling बिना डेटा एकत्र करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है. पूरक फ्लोरोसेंट नैनोकणों के साथ संयोजन सेल nanoparticle बातचीत का एक बहुत तेजी से और सटीक मात्रा का ठहराव. दवा या जीन डिलीवरी के लिए सोचा है की अनुमति देता है चयनित ऊतकों में एक विशेष दवा भार जारी करने में सक्षम नैनोकणों के आवेदन के द्वारा भविष्य में सुधार किया.

नैनोकणों औषधी के रूप में वितरण वाहक विशिष्ट और / या प्रतिरक्षा modulators के रोजगार सेल nanoparticle बातचीत का अध्ययन करने के लिए जैविक पर्यावरण का ज्ञान (यानी फ्लो के माध्यम से) की आवश्यकता है.

Disclosures

लेखकों Miltenyi बायोटेक GmbH इस पांडुलिपि प्रस्तुत करने प्रायोजित किया है कि घोषणा. HIQ नैनो कंपनी ( http://www.hiq-nano.com/index.html ) एक नैनो आईआईटी से पैदा हुई कंपनी बंद स्पिन है.

Acknowledgements

इस काम Fondazione Istituto इतालवी di Tecnologia द्वारा समर्थित किया गया.
लेखक इस पांडुलिपि के प्रायोजन के लिए Miltenyi बायोटेक GmbH (Bergisch Gladbach, जर्मनी) स्वीकार करना चाहते हैं, डा. पाओलो Petrucciani मानव Buffy कोट प्रदान करने के लिए (इम्यूनो रुधिर विज्ञान और आधान सेवा, अस्पताल Lotti Pontedera, पीसा, इटली विभाग) और प्रो मास्सिमो Pasqualetti (जीवविज्ञान विभाग - सेलुलर की यूनिट और विकास जीवविज्ञान, पीसा, पीसा, इटली के विश्वविद्यालय) के आवास के लिए माउस कॉलोनी.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HBSS Gibco 14170-088 Warm in 37 °C water bath before use
RPMI-1640 (ATCC Modified) Gibco A10491-01 Warm in 37 °C water bath before use
DMEM, High Glucose, phenol red Gibco 41966-029
Penicillin-Streptomycin, Liquid Gibco 15140-122
Gentamycin Gibco 15710-049
Horse Serum (lot n° 1131917) Gibco 16050-122
β-mercaptoethanol Gibco 21985-023
Trypsin 2.5% Gibco 15090-046
Human Pooled Serum Invitrogen 34005100
Versene Invitrogen 15040-033
DNAse I Sigma Aldrich D5025-150KU
CD11b-VioBlue human & mouse Miltenyi Biotec 130-097-336
MACS BSA Stock Solution  Miltenyi Biotec 130-091-376
autoMACS Rinsing Solution  Miltenyi Biotec 130-091-222
Running buffer Miltenyi Biotec 130-092-747
autoMACS Running Buffer Miltenyi Biotec 130-091-221
Human Pan monocyte isolation kit  Miltenyi Biotec 130-096-537
Whole Blood Column Kit Miltenyi Biotec 130-093-545
Whole Blood CD14 MicroBeads, human Miltenyi Biotec 130-090-879
MS Column Miltenyi Biotec 130-042-201
LS Column Miltenyi Biotec 130-042-401
MidiMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-302
MiniMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-102
Red Blood Cell Lysis Solution  Miltenyi Biotec 130-094-183
Preseparation Filters 30 µm Miltenyi Biotec 130-041-407
MACSQuant Analyzer flow cytometer Miltenyi Biotec 130-092-197
MACSQuant Calibration Beads Miltenyi Biotec 130-093-607
Ficoll-Paque Premium GE Healthcare GEH17544202
FITC-SiO2 nanoparticles (50 nm, +45 mV) HiQ-Nano Company
Rhodamine-SiO2 nanoparticles (50 nm, +45 mV) HiQ-Nano Company
12-well plate Falcon Becton Dickinson 353043

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References

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