Detectie van TL Nanoparticle Interacties met Primary Immune celtypes door flowcytometrie

1Center for Micro-BioRobotics @SSSA, Istituto Italiano di Tecnologia, 2Department of Biology, University of Pisa, 3Center for Biomolecular Nanotechnologies @UniLe, Istituto Italiano di Tecnologia
Immunology and Infection
 

Summary

Analyse van nanodeeltjes interactie met gedefinieerde subpopulaties van immune cellen door flowcytometrie.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Gamucci, O., Bertero, A., Malvindi, M. A., Sabella, S., Pompa, P. P., Mazzolai, B., et al. Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (85), e51345, doi:10.3791/51345 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Nanodeeltjes zijn begiftigd met veelbelovende eigenschappen voor therapeutische en diagnostische doeleinden. Dit werk beschrijft een snelle en betrouwbare analysemethode door middel van flowcytometrie om nanodeeltjes interactiestudie met immuuncellen. Primaire immune cellen kunnen gemakkelijk worden gezuiverd uit humane of muizen weefsels door antilichaam gemedieerde magnetische isolatie. In eerste instantie kunnen de verschillende celpopulaties die in een flowcytometer worden onderscheiden door de forward-strooilicht (FSC), die evenredig is celgrootte en de zijde verstrooide licht (SSC), om interne complexiteit cel. Bovendien, fluorescent gelabelde antilichamen tegen specifieke celoppervlak receptoren mogelijk de identificatie van verschillende subpopulaties binnen hetzelfde monster. Vaak, al deze functies variëren wanneer de cellen worden gestimuleerd door externe stimuli die hun fysiologische en morfologische toestand veranderen. Hier, 50 nm FITC-SiO 2 nanodeeltjes worden gebruikt als model om e identificerene internalisering van nano-gestructureerde materialen in het menselijk bloed immuuncellen. De cel fluorescentie en-side strooilicht verhoging na incubatie met nanodeeltjes liet ons toe om de tijd en de concentratie afhankelijkheid van nanodeeltjes-cel interactie te definiëren. Bovendien kan een dergelijke protocol worden uitgebreid tot Rhodamine-SiO2 nanodeeltjes interactie onderzoeken met primaire microglia, het centrale zenuwstelsel bewoner immuuncellen geïsoleerd van mutante muizen die specifiek tot expressie Green Fluorescent Protein (GFP) in de monocyt / macrofaaglijn. Tenslotte flowcytometrie gegevens over nanodeeltjes internalisatie in de cellen zijn bevestigd door confocale microscopie.

Introduction

Nanomaterialen zijn tegenwoordig inspirerend het belang van het leven wetenschappers voor potentiële toepassingen medische biologie 1. Een grote verscheidenheid van anorganische en organische materialen kunnen worden gebruikt om nanostructuren te produceren met verschillende vormen, fysische en chemische eigenschappen. Onder deze structuren, synthetische nanodeeltjes van bolvorm aangetoond groot potentieel voor diagnostische en translationele geneeskunde 2. Hun kern en surface design worden aangedreven door een mogelijke toepassing en het impliceert een grondige studie van target cel responsen volgende nanodeeltjes contact en interactie. Nanodeeltjes die worden verondersteld om doelbewust worden toegediend aan menselijke patiënten zal in direct contact komen met verschillende soorten immuuncellen. Hun verantwoordelijkheid om het lichaam integriteit te behouden maakt ze een cruciaal onderwerp van onderzoek in nanomedicine 3.

De cellulaire deel van het aangeboren immuunsysteem wordt voornamelijk vertegenwoordigd door phagocyten. Onder hen, de monocyt / macrofaag lijn afgeleide cellen, waaronder het centrale zenuwstelsel resident microglia een belangrijke rol spelen in het immuunsysteem 4,5. Ze zijn in staat om beschermende reacties binnen enkele uren leiden na het ontmoeten van vreemde voorwerpen. Bovendien is de monocytcellen coördineren en instrueren de adaptieve immuunrespons door het vrijkomen van cytokines. Al deze gebeurtenissen plaatsvinden, zelfs in aanwezigheid van synthetische materialen, die grotendeels worden beschouwd als "niet-zelf" door het immuunsysteem 6.

Onder de werkwijzen historisch gebruikt immunologie voor celanalyse, flowcytometrie is een van de meest krachtige gereedschappen. Bovendien is de beschikbaarheid van technieken voor de identificatie of zuivering van een specifieke immune subpopulatie (vaak benutten uitsluiting of de aanwezigheid van een enkel membraan eiwit) kan nauwkeurig onderzoek naar de effecten van een bepaalde nanodeeltjes op die primaire cell type 7. Echter kunnen cellen fysiologische en morfologische veranderingen presenteren na blootstelling aan nanodeeltjes. Ook, kunnen nanodeeltjes afbreuk doen aan optische parameters, bijvoorbeeld absorptie of emissie van licht bij bepaalde golflengten, beïnvloeden de verkregen resultaten 8. Dus moet bruikbaarheidsgrenzen en eventuele aanpassing van de klassieke immunologische assays voor de studie van nieuwe materialen worden overwogen.

In dit onderzoek detectie van nanodeeltjes interactie met primaire immune cellen door flowcytometrie. Om dit probleem aan te pakken, 50 nm FITC-SiO 2 nanodeeltjes werden gebruikt als model nanomateriaal om de methode te beschrijven. Silica deeltjes kunnen op een zeer nauwkeurige wijze de nanoschaal worden geproduceerd. Grootte, vorm en oppervlakte-eigenschappen zoals lading of hydrofobiciteit, kunnen fijn worden afgestemd op hun biocompatibiliteit 9 verhogen. Vele eigenschappen van SiO2 nanodeeltjes kunnen ze worden gebruikt alsmodel voor drug delivery deeltjes 10. Bovendien kunnen fluorescerende kleurstoffen of quantum dots worden ingesloten of gekoppeld aan deze deeltjes het aanbieden van nuttige nano-instrumenten voor imaging doeleinden 11.

Protocol

ETHIEK VERKLARING

Menselijke en dierlijke monsters werden verwerkt volgens de richtlijnen van het Italiaanse Ministerie van Volksgezondheid, de wet 116/92 en de Richtlijn Europese Gemeenschappen 86/609/EEG van de Raad.

1. Monocyten Cell Cultures

  1. Cultuur humane THP-1-cellen in T-75 kolven met RPMI-1640 medium aangevuld met 10% humaan serum, 50 U / ml penicilline en 50 mg / ml streptomycine, 0,05 mM β-mercaptoethanol bij 37 ° C in 5% CO2.
  2. Split culturen wanneer samenvloeiing (elke 3-5 dagen).

2. Isolatie van perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) uit Buffy Coats

  1. Voordat de isolatieprotocol, een oplossing van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) pH 7,2, 2 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA), 0,5% runderserumalbumine (BSA), toevoeging van 5 ml BSA stockoplossing aan 95 ml spoelbuffer (1: 20 verdunning). Ontgassen de buffer en houdt het koud (2-8° C).
    BELANGRIJK: Het niet ontgast de buffer kan resulteren in minder dan optimale resultaten, omdat bubbels de kolom isolatie (zie stap 3.2) kan blokkeren.
    Opmerking: anticoagulerende citrate dextrose formule-A (ACD-A) of fosfaat citraat dextrose (CPD) kan alternatief worden gebruikt. Omgekeerd kunnen andere albumine eiwitten of sera van andere soorten BSA vervangen. Niet buffers met Ca 2 + of Mg 2 + gebruiken.
  2. Verkrijgen buffycoats van gezonde donoren (20-60 jaar oud).
  3. Bereid 50 ml conische buizen voor dichtheidsgradiënt centrifugatie. Bepaal het aantal buizen die nodig is voor de verwerking van het bloed (elke buis kan 35 ml verdund bloed te verwerken) en voeg 15 ml Ficoll-Paque aan elke lege buis.
  4. Verdun 8 ml bloed met 24 ml PBS / BSA / EDTA-oplossing (1:04 verdunning).
  5. Laag het verdunde oplossing bovenop Ficoll-Paque (dichtheid = 1,077 g / ml) in elk van de 50 ml conische buizen voorzichtig. Gaan niet samenhet bloed en Ficoll-Paque.
    BELANGRIJK: Het mengen van het bloed en Ficoll-Paque vermijden, houdt u de buis in een hoek van 45 ° en laag langzaam het bloed mengsel.
  6. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 30 min bij 4 ° C. Mononucleaire cellen (MNC) wordt bij het plasma-Ficoll-Paque-interface blijven terwijl granulocyten en erytrocyten sediment door hogere dichtheid bij de osmotische druk van Ficoll-Paque.
  7. Breng de interfase cellen (perifeer bloed mononucleaire cellen, PBMC) een nieuwe 50 ml buis gevuld met PBS / BSA / EDTA en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
  8. Was de pellet twee keer met PBS / BSA / EDTA bloedplaatjes te verwijderen. Spin bij 200 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
  9. Kweek van de cellen in compleet RPMI-1640 met 10% humaan serum en antibiotica of zich naar monocyten zuivering.

3. Zuivering van primaire monocyten uit PBMC

  1. Isoleer monocyten uit PBMC door magnetische kraal scheiding met behulp van Humeen Pan monocyten isolatie kit:
    1. Passeren cellen door een 30 um Nylon mesh (voorafscheider filters, 30 pm) om mogelijke celklonten verwijderen.
    2. Bepaal het aantal cellen met behulp van een hemocytometer.
    3. Centrifugeer celsuspensie bij 300 xg gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT). Aspireren supernatans volledig.
    4. Resuspendeer cel pellet in 30 ul PBS / EDTA / BSA buffer per 10 7 totaal cellen.
    5. Voeg 10 ul FcR Blocking Reagent per 10 7 totaal cellen.
    6. Voeg 10 ul van biotine-antilichaam cocktail per 10 7 totaal cellen.
    7. Meng goed en incubeer gedurende 5 minuten bij 2-8 ° C.
    8. Voeg 30 ul van buffer per 10 7 totaal cellen.
    9. Voeg 20 ul van anti-biotine microbolletjes per 10 7 totaal cellen.
    10. Meng goed en incubeer gedurende 10 minuten bij 2-8 ° C.
    11. Resuspendeer tot 10 8 cellen in 500 pi PBS / EDTA / BSA buffer.
  2. Magnetische gescheidenatie
    1. Dienovereenkomstig aan het totale aantal cellen, kiest u een geschikte MACS kolom en MACS Separator (zie MACS kolom datasheet).
    2. Plaats de kolom in het magnetisch veld van de MACS Separator.
    3. Kolom Bereid door spoelen met de juiste hoeveelheid PBS / EDTA / BSA buffer (MS kolommen: 500 pl; LS kolommen 3 ml).
      Opmerking: De kolommen zijn "flow stop" en niet drooglopen.
    4. Breng celsuspensie op de kolom. Verzamel doorstroom met ongelabelde cellen, die de verrijkte monocyten fractie.
    5. Kolom 3x wassen met PBS / EDTA / BSA buffer (500 ul voor MS en 3 ml voor LS per wasbeurt).
    6. Verzamel ongelabelde cellen die passeren, die de verrijkte monocytcellen, en toe te voegen aan de doorstroming van paragraaf 3.2.4.
      Opmerking: Was de kolom door het toevoegen van PBS / EDTA / BSA buffer porties alleen wanneer de kolom reservoir leeg is.
    7. (Optioneel) verwijder kolom uit deafscheider en plaats deze op een geschikte collectie buis. Pipetteer de buffer op de kolom (MS kolommen: 1 ml; LS kolommen: 5 ml). Onmiddellijk spoelen van de magnetisch gelabelde nonmonocyte cellen door stevig de zuiger in de kolom.
    8. Cultuur gezuiverde monocyten in volledige RPMI-1640 met 10% humaan serum en antibiotica.

4. Zuivering van primaire monocyten uit volbloed

  1. Zuiver monocyten uit volbloed gebruik volbloed monocyten isolatiekit volgende instructies van de fabrikant.

5. Nanodeeltjes Internalisatie in bloedleukocyten en Gezuiverd Monocyten

  1. Plate 5 x 10 5 cellen / ml (1 ml / putje) van het geïsoleerde PBMCs of gezuiverde CD14 positieve monocyten in een 12-wells plaat.
  2. Vortex FITC-SiO 2 nanodeeltjes stockoplossing en resuspendeer in compleet medium om een werkende concentratie van 100 nM.
  3. Voeg 10 ul van werken nanopartikel suspensie (100 nM) voor behandelde monsters een nanodeeltje eindconcentratie van 1 nM bereiken. Voeg hetzelfde volume compleet medium voor onbehandelde controles aan elk putje.
  4. Na 1 uur internalisatie verzamelen van de monsters in een 1,5 ml polypropyleen buis en centrifugeer ze gedurende 3 min bij 6000 xg bij kamertemperatuur.
  5. Was de pellet met 1 ml loopbuffer 3 min bij 6000 xg bij kamertemperatuur.
  6. Resuspendeer de pellet in 200 gl loopbuffer. De cellen zijn nu klaar voor het lezen door flowcytometrie.

6. Isolatie van Primaire Mixed glialculturen (Zie Bertero et al.. 7)

7. Opnieuw platen een Mixed Glial Confluent Cell Culture

  1. Was een T-75 kolf eenmaal met 10 ml PBS (w / o Ca2 + / Mg2 +), voeg dan 10 ml Versene en incubeer bij 37 ° C gedurende 5-7 minuten.
  2. Pipetteer de supernatant en neer meerdere malen om de cellen los van de T-75 oppervlak en loscelaggregaten.
  3. Breng de celsuspensie in een 15 ml polypropyleen buis. Verzamel een kleine hoeveelheid celsuspensie om de cellen te tellen met een hemocytometer.
  4. Centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 minuten bij 300 x g bij kamertemperatuur.
  5. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in een eindconcentratie van 5 x 10 5 cellen / ml in gliale compleet cultuurmedium.
  6. Plaat 0,5 ml / putje in een 24-wells plaat en laat de cellen regelen voor 2-4 uur voor nanodeeltjes behandeling.

8. Nanodeeltjes Internalisatie in Microglia

  1. Voeg 500 ul volledig gliale cultuurmedium (voor onbehandelde controles) of 500 ui 2x Rhodamine-SiO2 nanodeeltjes suspensie volledig gliale kweekmedium (voor behandelde monsters) aan elk putje.
  2. Pipetteer de cellen om het detachement van nonrapid-hechtende cellen op de gekozen tijdstippen toe te staan ​​en ze te verzamelen in 2 ml polypropyleen buizen.
  3. Voeg 500 ulvan Versene aan elk putje en incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 5 minuten, vervolgens verwijder de overgebleven celfractie en laat elk monster met de overeenkomstige nonadhering cellen van de vorige stap.
  4. Centrifugeer de monsters gedurende 3 min bij 300 x g bij kamertemperatuur.
  5. Resuspendeer de pellet in 100 pl AutoMACS loopbuffer.

9. Kleuring met CD11b-VioBlue

  1. Voeg 10 ul van VioBlue-CD11b humaan / muizenantilichaam 100 ui celsuspensie (01:11 verhouding) in loopbuffer en incubeer 10 min bij 4 ° C.
  2. Voeg 1 ml loopbuffer en meng de celsuspensie.
  3. Centrifugeer elk monster gedurende 3 min bij 300 x g.
  4. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 100-150 ul van lopende buffer.
  5. Lees de monsters naar de cytometer (monsters worden bij 4 ° C tussen de laatste twee stappen).
    BELANGRIJK: voor het analyseren van de monsters, overgaan tot vergoeding van overlappende signalen in emissiespectra waargenomen tussen verschillende fluorochromen (fluorochroom-geconjugeerde nanodeeltjes of antilichamen).

10. Spectrale Spill overcompensatie

  1. Open de doos "Instrument instellingen" (aanwezig in alle instrument softwareprogramma's).
    Opmerking: Als u een ander instrument van de ene gerapporteerd in de Material Table, verwijzen wij u naar het instrument specifieke handleiding voor de verwerving details.
  2. Acquire onbehandelde monster (zonder nanodeeltjes) bij lage vloeibare snelheid (indien toegestaan ​​door het instrument). Tijdens de overname, met de hand naar voren te passen en kant verstrooiing (FSC en SSC, respectievelijk) door de spanning kanalen.
    Opmerking: Wijzig de as schalen SSC en FSC om optimaal te visualiseren de volledige celpopulatie in de plot. Een instrument waarin sjabloon voor elk celtype van belang kan worden gemaakt, opgeslagen en gebruikt voor toekomstige acquisities.
  3. Open de specifieke"Regio" tab in de software. Teken een geschikte groot gebied ("gate") rond de gewenste populatie.
    Opmerking: internalisatie van nanodeeltjes induceert een SSC verschuiving van de cellen. Als het hek te dicht wordt beperkt in de celpopulatie, de verkregen gegevens waarschijnlijk missen een deel van de cellen te detecteren.
  4. Gebruik twee ongekleurde monsters, een voor gebruik als blanco monster en een vergoeding tegen PI kleuring (optioneel), een enkel gekleurd monster met de juiste fluorochroom fluorescentie voor elk kanaal te compenseren.
    Opmerking: Gebruik een andere 1,5 ml monsterbuis voor elk fluorochroom-geconjugeerd antilichaam voor gebruik in het experiment etiket.
  5. Open het tabblad "Compensatie" in het vak "Instrument instellingen". Verhogen of de compensatie factor tijdens de overname te verlagen totdat de fluorescentie-intensiteit in de spill-kanaal is ongeveer hetzelfde voor de fluorchroom postieve en negatieve bevolking.
  6. Acquire-nanodeeltjes behandelde monsters na de compensatie is aangepast.

Representative Results

Flowcytometrie is een nuttig instrument op verschillende cellen te identificeren en te karakteriseren en het is de techniek van keuze om specifieke immuuncellen, zoals monocyten, granulocyten, T-cellen, B-cellen, natuurlijke killer (NK)-cellen, dendritische cellen (DCs) identificeren en andere subpopulaties van de leukocyten.

In de poging om beter te karakteriseren witte bloedcellen gedrag in reactie op nanodeeltjes, voerden we internalisatie testen met primaire leukocyten geïsoleerd uit het bloed van gezonde donoren (figuren 1 en 2) en menselijke monocyt cellijn (THP-1-cellen, figuur 3) .

Zoals gemeld in figuur 1A, werden de drie grote bloed leukocytsubpopulaties duidelijk geïdentificeerd door voorwaartse en zijwaartse verstrooiing na PBMC isolatie. Bovendien, na FITC-SiO 2 behandeling, lymfocyten (grijs), monocyten (blauw) en granulocyten (rood) hebben een andere nanoparticle internalisatie tarief zoals aangegeven door groene fluorescentie-intensiteit (Figuur 1B). De beschreven protocol maakt het mogelijk de zuivering van primaire CD14 positieve monocyten uit PBMC. Figuur 2A meldt de flowcytometrie dot plot van CD14 + monocyten in aanwezigheid van FITC-SiO 2. Figuur 2B toont FITC-SiO 2 internalisatie gekwantificeerd in dezelfde cellen en uitgedrukt in logaritmische schaal histogram.

Soortgelijke internalisatie-experimenten werden uitgevoerd op THP-1 monocyten behandeld met toenemende concentraties van FITC-SiO2 nanodeeltjes. Onbehandelde cellen werden gebruikt als negatieve controle. Figuur 3A toont een dosis-afhankelijke toename in zijaanzicht verstrooiing bij ongewijzigd voorwaartse verstrooiing in THP-1 cellijn. In figuur 3B, alsmede de histogrammen van SSC en FSC bij elke FITC-SiO2 nanodeeltjes geteste concentratie, gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) kwantificering wordt gepresenteerd. Deze gegevens suggereren dat behandeling met FITC-SiO2 nanodeeltjes induceert een dosis-afhankelijke internalisering monocyten benadrukt door de verhoging van intracellulaire granulariteit (kant verstrooiing) en fluorescentie (groen kanaal).

Om verder inzicht in de aard van de interactie tussen immuuncellen en nanodeeltjes te verkrijgen, werden primaire gemengde gliale kweken geïsoleerd en microglia, het centrale zenuwstelsel bewoner immuuncellen, werd gezuiverd. Het gebruik van een transgeen muismodel expressie groen fluorescerend microglia maakt het visualiseren van verschillende neuro-inflammatoire mechanismen. De transgene muis B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / J in dit werk geeft het green fluorescent protein (GFP) onder de controle van promoter CX3CR1 12. Na 7 dagen in vitro (DIV), fluorescentiemicroscopie een gemengd primaire gliale cultuur met een groot aantal astrocyten (GFP negatieve hechtende cels) en een aantal groene cellen (GFP positieve, figuur 5A). In dit muismodel kunnen drie gliale subpopulaties onderscheiden door flowcytometrie met een CD11b antilichaam kleuring: de eerste CD11b - GFP - (astrocyten en andere gliacellen), een tweede aparte groep microgliale CD11b + GFP + cellen, en een derde CD11b + GFP - subpopulatie (Figuur 4A). Deze laatste twee subpopulaties kunnen beide nanodeeltjes internaliseren met een lichte verhoogde efficiëntie van de GFP + populatie (die de patrouilleren onvolwassen microglia de transcriptie van CX3CR1 promoter), zoals getoond door flowcytometrie-analyse (Figuur 4B). De opgetreden internalisatie kan verder worden geverifieerd door confocale microscopie met dezelfde eindconcentratie van Rhodamine-SiO2 nanodeeltjes zoals getoond in figuur 5B.


Figuur 1. FITC-SiO 2 nanodeeltjes internalisatie in geïsoleerde bloedleukocyten. A) Vertegenwoordiger vooruit verstrooiing (FSC) versus zijwaartse verstrooiing (SSC) flowcytometrie dot plot van Ficoll-Paque geïsoleerde bloedleukocyten. B) Groen fluorescentie overlay histogram plot van de drie grote bloed leukocyten cel subpopulaties in aanwezigheid van 1 nM FITC-SiO 2 nanodeeltjes (45 mV) gedurende 1 uur. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2
2 nanodeeltjes internalisatie in CD14 + gezuiverde monocyten. A) Vertegenwoordiger vooruit verstrooiing (FSC) versus zijwaartse verstrooiing (SSC) flowcytometrie dot plot van gezuiverd CD14 positieve monocyten. B) Groen fluorescentie histogram plot van het gezuiverde monocyten subpopulatie in aanwezigheid van 1 nM FITC-SiO 2 nanodeeltjes (45 mV) gedurende 1 uur. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3. Effecten van FITC-SiO 2 nanodeeltjes internalisatie op THP-1-cellen. A) Vertegenwoordiger vooruit verstrooiing (FSC) versus zijkant scattering (SSC) flowcytometrie dot plot van THP-1 monocyten cellijn, na 1 uur blootstelling van FITC-SiO 2 nanodeeltjes toenemende concentratie. B) Concentratie-afhankelijke variatie van de kant verstrooiing (SSC), voorwaartse verstrooiing (FSC) en groen fluorescentie in aanwezigheid van FITC-SiO 2 nanodeeltjes (45 mV) gedurende 1 uur. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4. Rhodamine-SiO 2 nanodeeltje internalisatie in primaire microglia geïsoleerd van B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / J muizen. A) Green Fluorescent Protein (GFP) versus CD11b-VioBlue flowcytometrie dot plot van primary gemengde glia geïsoleerd van B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / J muizen. CD11b + GFP + en CD11b + GFP - populaties worden getoond in de rechterbovenhoek en rechtsonder kwadranten, respectievelijk B) Rode fluorescentie overlay histogram plot van microglia subpopulaties in aanwezigheid van 1 nM Rhodamine-SiO 2 nanodeeltjes (45 mV) voor 30. min (rood histogram) versus controle (grijs histogram). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 5
Figuur 5. Visualisatie van GFP +-microglia. (A) Fluorescentie microscopie 7 DIV en (B) Confocale microscopieRhodamine-SiO 2 nanodeeltjes internalisatie (rode pijlen) in GFP +-microglia. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussion

Het experimentele protocol presenteert zeer cruciale punten in aanmerking moeten worden genomen. Het is echt belangrijk om te werken bij 4 ° C (op ijs) en mogelijk in het donker tijdens alle stappen van de kleuring, omdat hogere temperaturen en verlichting kunnen een negatieve invloed hebben op de kleuring opbrengst. Nanodeeltjes kunnen worden gesonificeerd beter worden geresuspendeerd vlak voor gebruik.

Een juiste flowcytometrie analyse vereist een correcte kalibratie in de verschillende kanalen. Kalibratie van het instrument moet worden uitgevoerd voor elke experimentele sessie. Naast technische problemen met de apparatuur, kunnen er ook problemen met het antilichaam labeling. Het is verplicht om het antilichaam in een passende concentratie. Als de concentratie te hoog of te laag is, kan onbevredigend signaalintensiteiten het gevolg zijn.

De nadelen van deze techniek hebben betrekking op de noodzaak van het werken met monodisperse monsters, het onvermogen om het lokaliserenplaats van oorsprong van het signaal (dwz verschillende cellulaire compartimenten). Er zijn ook een aantal beperkingen in de keuze van fluorochromen te gebruiken in combinatie: de golflengte van het excitatie en emissiebanden moeten voldoende gescheiden om hun juiste meting mogelijk. Indien de gebruikte antilichaam spectra overlappen, wordt een correcte compensatie vereist.

Flowcytometrie is een krachtige methode voor cellulaire analyse of afwezigheid van nanodeeltjes. Deze techniek maakt een Multiparametrische studie van een cel, een groot aantal gebeurtenissen onderzocht snelheid analyse (meer dan 1000 cellen / sec), reproduceerbaarheid en statistische metingen. Monsters kunnen worden verwerkt zonder verlies van levensvatbaarheid van de cellen.

Door fluorescent gelabelde nanodeeltjes is het mogelijk te kwalificeren en kwantificeren van de internalisering cel subpopulaties, die worden gekenmerkt door specifieke markers belicht op de celmembraan. Cel parameters kunnen in aanwezigheid van s wijzigen SPECIFIEKE nanodeeltjes. Afhankelijk van het doel van het onderzoek, kunnen deze variaties worden gebruikt om een ​​specifiek fenomeen identificeren, zoals side verstrooiing van cellen die proportioneel toeneemt met de toenemende nanodeeltjes internalisatie tarief.

Nanodeeltje-geïnduceerde modificaties van celoppervlak vertegenwoordigen ook een beperking van de techniek. Om deze reden, moet celmembraanreceptoren omzet altijd rekening gehouden worden en eventueel van tevoren bekend aan de betrokken celpopulatie nauwkeurig te karakteriseren. Extreme waardeverminderingen van membraan osmose in nanodeeltje overladen monsters kan leiden tot celdood.

Nanomateriaal dosisafhankelijke toxiciteit moet empirisch worden getest elke celpopulatie. Duidelijk omschreven dode cellen moeten uit de fluorescentie kwantificering worden uitgesloten. Zo Annexine V / PI kleuring is een van de verschillende methoden meestal gebruikt om zowel necrotische en apoptotische cellen te detecteren.

"> GFP-expressie primaire cellen zijn ook een krachtig instrument om een ​​bepaalde cel subpopulatie selecteren en gegevens te verzamelen zonder voormerkend. De combinatie met complementaire fluorescerende nanodeeltjes maakt een zeer snelle en nauwkeurige kwantificering van cel-nanodeeltjes interactie. Drug of genafgifte wordt gedacht aan worden in de toekomst verbeterd door toepassing van nanodeeltjes kunnen een specifiek geneesmiddel lading vrij in geselecteerde weefsels.

Tewerkstelling van nanodeeltjes als specifieke levering dragers en / of immuun modulatoren, Farmaceutica vereist de kennis van de biologische omgeving (dwz via flowcytometrie) naar cel-nanodeeltjes interacties te bestuderen.

Disclosures

De auteurs verklaren dat Miltenyi Biotech GmbH de indiening van dit manuscript heeft gesponsord. HiQ-Nano Company ( http://www.hiq-nano.com/index.html ) is een nanotechnologie spin-off bedrijf ontstaan ​​uit IIT.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door Fondazione Istituto Italiano di Tecnologia.
De auteurs willen graag Miltenyi Biotec GmbH (Bergisch Gladbach, Duitsland) erkennen voor de sponsoring van dit manuscript, Dr Paolo Petrucciani (Department of Immuno-hematologie en Transfusion Service Hospital Lotti Pontedera, Pisa, Italië) voor het verstrekken van de menselijke buffycoats en Prof Massimo Pasqualetti (Departement Biologie - Unit van Cellulaire en Developmental Biology, Universiteit van Pisa, Pisa, Italië) voor de behuizing van de muis kolonie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HBSS Gibco 14170-088 Warm in 37 °C water bath before use
RPMI-1640 (ATCC Modified) Gibco A10491-01 Warm in 37 °C water bath before use
DMEM, High Glucose, phenol red Gibco 41966-029
Penicillin-Streptomycin, Liquid Gibco 15140-122
Gentamycin Gibco 15710-049
Horse Serum (lot n° 1131917) Gibco 16050-122
β-mercaptoethanol Gibco 21985-023
Trypsin 2.5% Gibco 15090-046
Human Pooled Serum Invitrogen 34005100
Versene Invitrogen 15040-033
DNAse I Sigma Aldrich D5025-150KU
CD11b-VioBlue human & mouse Miltenyi Biotec 130-097-336
MACS BSA Stock Solution  Miltenyi Biotec 130-091-376
autoMACS Rinsing Solution  Miltenyi Biotec 130-091-222
Running buffer Miltenyi Biotec 130-092-747
autoMACS Running Buffer Miltenyi Biotec 130-091-221
Human Pan monocyte isolation kit  Miltenyi Biotec 130-096-537
Whole Blood Column Kit Miltenyi Biotec 130-093-545
Whole Blood CD14 MicroBeads, human Miltenyi Biotec 130-090-879
MS Column Miltenyi Biotec 130-042-201
LS Column Miltenyi Biotec 130-042-401
MidiMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-302
MiniMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-102
Red Blood Cell Lysis Solution  Miltenyi Biotec 130-094-183
Preseparation Filters 30 µm Miltenyi Biotec 130-041-407
MACSQuant Analyzer flow cytometer Miltenyi Biotec 130-092-197
MACSQuant Calibration Beads Miltenyi Biotec 130-093-607
Ficoll-Paque Premium GE Healthcare GEH17544202
FITC-SiO2 nanoparticles (50 nm, +45 mV) HiQ-Nano Company
Rhodamine-SiO2 nanoparticles (50 nm, +45 mV) HiQ-Nano Company
12-well plate Falcon Becton Dickinson 353043

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhang, X. Q., et al. Interactions of nanomaterials and biological systems: Implications to personalized nanomedicine. Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 1363-1384 (2012).
  2. Radad, K., Al-Shraim, M., Moldzio, R., Rausch, W. D. Recent advances in benefits and hazards of engineered nanoparticles. Environ. Toxicol. Pharmacol. 34, 661-672 (2012).
  3. Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. Immunological properties of engineered nanomaterials. Nat. Nanotechnol. 2, 469-478 (2007).
  4. Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nat. Rev. Immunol. 11, 762-774 (2011).
  5. Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. J. Clin. Invest. 122, 787-795 (2012).
  6. Hubbell, J. A., Thomas, S. N., Swartz, M. A. Materials engineering for immunomodulation. Nature. 462, 449-460 (2009).
  7. Bertero, A., et al. Surface functionalisation regulates polyamidoamine dendrimer toxicity on blood-brain barrier cells and the modulation of key inflammatory receptors on microglia. Nanotoxicology. 8, 158-168 (2013).
  8. Kroll, A., Pillukat, M. H., Hahn, D., Schnekenburger, J. Interference of engineered nanoparticles with in vitro toxicity assays. Arch. Toxicol. 86, 1123-1136 (2012).
  9. Malvindi, M. A., et al. SiO2 nanoparticles biocompatibility and their potential for gene delivery and silencing. Nanoscale. 4, 486-495 (2012).
  10. Bardi, G. SiO2 NPs: Promising Candidates for Drug and Gene Delivery. Drug Deliv. Lett. 1, 9-12 (2011).
  11. Bardi, G., et al. The biocompatibility of amino functionalized CdSe/ZnS quantum-dot-Doped SiO2 nanoparticles with primary neural cells and their gene carrying performance. Biomaterials. 31, 6555-6566 (2010).
  12. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion andgreen fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell Biol. 20, 4106-4114 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics