संवेदनशील, बड़े पैमाने पर मात्रात्मक Metabolomics के लिए एक रणनीति

1Division of Nutritional Sciences, Cornell University, 2Field of Biochemistry, and Molecular Cell Biology, Cornell University
Published 5/27/2014
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Biology

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Summary

Metabolite रूपरेखा स्वास्थ्य और रोग में चयापचय के अध्ययन में एक महत्वपूर्ण परिसंपत्ति किया गया है. ध्रुवता स्विचिंग और एक तेजी से शुल्क साइकिल के साथ उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए युग्मित सामान्य चरणबद्ध तरल क्रोमैटोग्राफी का उपयोग, हम उच्च संवेदनशीलता, सटीकता, और संकल्प के साथ जैविक सामग्री के ध्रुवीय चयापचय संरचना का विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन.

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Liu, X., Ser, Z., Cluntun, A. A., Mentch, S. J., Locasale, J. W. A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics. J. Vis. Exp. (87), e51358, doi:10.3791/51358 (2014).

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Abstract

Metabolite रूपरेखा स्वास्थ्य और रोग में चयापचय के अध्ययन में एक महत्वपूर्ण परिसंपत्ति किया गया है. हालांकि, मौजूदा प्लेटफार्मों ऐसे श्रम गहन नमूना तैयारी, कम सीमा का पता लगाने, धीमी स्कैन गति, प्रत्येक metabolite के लिए गहन विधि अनुकूलन, और सकारात्मक दोनों को मापने के लिए अक्षमता और एकल प्रयोगों में नकारात्मक आरोप लगाया आयनों के रूप में विभिन्न सीमित कारकों, है. इसलिए, एक उपन्यास metabolomics प्रोटोकॉल metabolomics अध्ययन अग्रिम सकता है. एमाइड आधारित हाइड्रोफिलिक क्रोमैटोग्राफी किसी भी रासायनिक derivatization बिना ध्रुवीय metabolite विश्लेषण में सक्षम बनाता है. क्यू Exactive (QE एमएस) का उपयोग उच्च संकल्प एमएस, आयन प्रकाशिकी सुधार स्कैन गति (संकल्प 70,000 से कम 256 मिसे) में वृद्धि हुई है, और सकारात्मक / नकारात्मक स्विचिंग बाहर ले जाने की क्षमता है गया है. एक ठंड मेथनॉल निकासी रणनीति का उपयोग करना, और QE-एमएस के साथ एक एमाइड स्तंभ युग्मन एक साथ अतिरिक्त सुविधाओं की 168 लक्षित ध्रुवीय चयापचयों और हजारों की मजबूत पता लगाने में सक्षम बनाता है. Datएक प्रसंस्करण एक बेहद कारगर तरीका में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर के साथ किया जाता है, और जन स्पेक्ट्रा से निकाले अज्ञात सुविधाओं डेटाबेस में पूछे जा सकते हैं.

Introduction

एक साथ कई मेटाबोलाइट्स उपाय है कि एक प्रयोग के रूप में परिभाषित किया Metabolomics, गहन रुचि का क्षेत्र रहा है. Metabolomics आण्विक फिजियोलॉजी का एक सीधा readout प्रदान करता है और इस तरह के कैंसर 1-4 के रूप में विकास और रोग में अंतर्दृष्टि प्रदान की है. परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) और गैस क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसी एमएस) सबसे अधिक इस्तेमाल किया उपकरणों 5-9 के बीच में हैं. एनएमआर, विशेष रूप से इस तरह के 13 सी लेबल मेटाबोलाइट्स के रूप में भारी आइसोटोप लेबल यौगिकों, क्योंकि प्रवाह प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया है, 10,11 एनएमआर सक्रिय हैं. हालांकि, इस रणनीति metabolomics में उसके आवेदन की सीमा है, जो अपेक्षाकृत उच्च नमूना पवित्रता और बड़ा नमूना मात्रा की आवश्यकता है. इस बीच, एनएमआर से एकत्र आंकड़ों का गहन विश्लेषण और जटिल एनएमआर स्पेक्ट्रा के परिसर असाइनमेंट मुश्किल है की जरूरत है. जीसी एमएस व्यापक रूप से ध्रुवीय चयापचयों और लिपिड अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया है, लेकिन यह अस्थिर compoun की आवश्यकताडी एस और कभी कभी समय लगता हो सकता है कि जटिल रसायन विज्ञान शामिल है और प्रयोगात्मक शोर जो परिचय मेटाबोलाइट्स की इसलिए अक्सर derivatization,.

तीसरे quadrupole विशेषता टुकड़े या बेटी आयनों का चयन करने के लिए प्रयोग किया जाता है, जबकि ट्रिपल quadrupole मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए युग्मित तरल क्रोमैटोग्राफी (नियंत्रण रेखा), तो दूसरा quadrupole में खंडित कर रहे हैं, जो बरकरार माता पिता के आयनों को चुनने के लिए पहली quadrupole का उपयोग करता है. विशिष्ट बेटी आयनों के लिए माता - पिता आयनों से संक्रमण जो रिकॉर्ड इस विधि, एकाधिक प्रतिक्रिया की निगरानी (एम आर एम) करार दिया है. एम आर एम छोटे अणु और प्रोटीन quantitation 12-15,21 दोनों के लिए एक बहुत ही संवेदनशील विशिष्ट, और मजबूत विधि है. हालांकि, MRM अपनी सीमाएं हैं. उच्च विशिष्टता प्राप्त करने के लिए एक एम आर एम विधि प्रत्येक metabolite के लिए बनाया जाना चाहिए. इस पद्धति का एक विशिष्ट टुकड़ा की पहचान करने और prope के पूर्व ज्ञान की आवश्यकता है जो अनुकूलित टक्कर ऊर्जा, इसी के होते हैंइस तरह के रासायनिक संरचना जानकारी के रूप में ब्याज की मेटाबोलाइट्स के rties. इसलिए, आम के टुकड़े का तटस्थ नुकसान शामिल कुछ अपवादों के साथ, यह इस विधि के साथ अज्ञात मेटाबोलाइट्स की पहचान करना संभव नहीं है.

हाल के वर्षों में, उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमेट्री (HRMS) उपकरणों ऐसे LTQ-Orbitrap और Exactive श्रृंखला, QuanTof के रूप में, जारी है, और TripleTOF 5600 16-18,22 किया गया है. HRMS कुछ पीपीएम के एक त्रुटि के भीतर बरकरार आयनों के अनुपात (मी / z) चार्ज करने के लिए एक बड़े पैमाने पर प्रदान कर सकते हैं. इसलिए, सभी अग्रदूत आयनों (यानी पूर्ण स्कैन मोड) का पता लगाने के द्वारा संचालित एक HRMS साधन सटीक जन और analyte के परिणामस्वरूप मौलिक रचना से सीधा संरचनात्मक जानकारी प्राप्त कर सकते हैं, और इस जानकारी को संभावित मेटाबोलाइट्स की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. दरअसल, एक यौगिक के बारे में सभी जानकारी संरचनात्मक isomers के स्तर तक, एक सटीक जन के साथ प्राप्त किया जा सकता है. इसके अलावा, एक पूर्णस्कैन विधि मेटाबोलाइट्स के पिछले ज्ञान की आवश्यकता नहीं है और विधि अनुकूलन की आवश्यकता नहीं है. मी / z स्कैन सीमा में पड़ने वाले सभी आयनों का विश्लेषण किया जा सकता है, क्योंकि इसके अलावा, HRMS MRM विधि की तुलना में एक ही समय में मात्रा निर्धारित किया जा सकता है कि मेटाबोलाइट्स की संख्या के मामले में एक लगभग असीमित क्षमता है. HRMS कारण स्कैन एक पूर्ण एमएस में प्राप्त किया जा सकता है कि डेटा बिंदुओं की एक तुलनीय संख्या में जिसके परिणामस्वरूप कम शुल्क साइकिल को भी मात्रात्मक क्षमता में एक ट्रिपल quadrupole एम आर एम के बराबर है. इसलिए, HRMS मात्रात्मक metabolomics के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रदान करता है. हाल ही में, HRMS के एक उन्नत संस्करण (QE एमएस) पता लगाने रेंज 19 फैलता है जो एक ही तरीका है, में पर्याप्त तेजी से समय चक्र के साथ सकारात्मक और नकारात्मक मोड के बीच स्विच के तहत संचालित किया जा सकता क्यू Exactive मास स्पेक्ट्रोमेट्री करार दिया. यहाँ हम QE एमएस का उपयोग हमारी metabolomics रणनीति का वर्णन.

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Protocol

1. नियंत्रण रेखा एमएस अभिकर्मकों, एक क्रोमैटोग्राफी विधि की स्थापना की तैयारी, और साधन संचालन प्रक्रिया की स्थापना

  1. नियंत्रण रेखा सॉल्वैंट्स की तैयारी
    1. 500 मिलीलीटर मोबाइल चरणों तैयार करें. एक 20 मिमी अमोनियम एसीटेट और 3% acetonitrile / पानी में 15 मिमी अमोनियम हाइड्रॉक्साइड, अंतिम पीएच 9.0 है; और बी 100% acetonitrile है.
    2. शिथिल, बोतल टोपी एक पानी के स्नान sonicator में यह जगह है, और अतिरिक्त हीटिंग के बिना 10 मिनट के लिए sonicate (यह कदम अमोनियम लवण के सभी पूरी तरह से भंग है कि और कोई अवशिष्ट हवा बुलबुले हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए है.)
    3. नियंत्रण रेखा एमएस उपयोग के लिए एक 250 मिलीलीटर कांच की बोतल के लिए विलायक, और 4 डिग्री सेल्सियस पर शेष रखने का स्थानांतरण 250 मिलीलीटर
  2. कम द्रव्यमान सीमा अंशांकन समाधान तैयार करें. यह सही है कि आम जनता कम आणविक भार में पता चला रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए metabolomics अनुप्रयोगों के लिए एक स्वनिर्धारित कम द्रव्यमान सीमा अंशांकन मिश्रण का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है.
    1. सोढ़ी दोनों की 5 मिलीग्राम वजनउम fluoroacetate और homovanillic एसिड और 1 मिलीग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए 5 मिलीलीटर पानी में उन्हें भंग. 10 मिलीग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए मेथनॉल में diazinon भंग.
    2. नकारात्मक कम द्रव्यमान अंशांकन समाधान के 1 एमएल तैयार करते हैं, सोडियम fluoroaceate और homovanillic एसिड समाधान के 20 मिलीलीटर के साथ थर्मो नकारात्मक अंशांकन समाधान की 960 मिलीलीटर मिश्रण. सकारात्मक कम द्रव्यमान अंशांकन समाधान के 1 मिलीलीटर बनाने के लिये, थर्मो सकारात्मक अंशांकन समाधान के 990 मिलीग्राम और 10 मिलीग्राम diazinon समाधान मिश्रण. (कम द्रव्यमान अंशांकन समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए और हर 2 महीने नए सिरे से तैयार किया.)
  3. एक कम द्रव्यमान सीमा पर QE एमएस की कैलिब्रेशन
    1. कम द्रव्यमान सीमा अंशांकन प्रदर्शन से पहले, निर्माता के निर्देशों के आधार पर सकारात्मक और नकारात्मक दोनों मोड में एक मानक जन अंशांकन (मी / z, 150-2,000) ले.
    2. एक नियमित रूप से बड़े पैमाने पर अंशांकन गुजरता है एक बार, साधन नियंत्रण कक्ष में 60-900 मीटर / Z करने के लिए स्कैन सीमा समायोजितऔर सकारात्मक मोड और नकारात्मक मोड के लिए 35 EV के लिए 25 eV की एक स्रोत सीआईडी ​​लागू किया जाता है. (यह कैफीन टुकड़ा आयन और सल्फेट आयन के मजबूत संकेत दे देंगे. यहां स्कैन सीमा तय हो गई है, जो पिछले मी / z शुरू कर रहा हूँ / Z के 15x से बड़ा नहीं होना चाहिए क्योंकि)
    3. आयन स्रोत स्थिर है एक बार, तो अनुकूलित अंशांकन प्रदर्शन करते हैं. नोट: एक स्थिर स्रोत सकारात्मक मोड में कुल आयन वर्तमान भिन्नता के कम से कम 10% के रूप में परिभाषित किया गया है, और नकारात्मक मोड में कम से कम 15% है. अनुकूलित अंशांकन आयनों और इसी मी / z 1 टेबल में सूचीबद्ध हैं.
  4. ध्रुवीय metabolite विश्लेषण के लिए नियंत्रण रेखा एमएस इंस्ट्रूमेंटेशन स्थापित करना. नियंत्रण रेखा metabolite जुदाई और पता लगाने के लिए एक QE एमएस के लिए युग्मित है.
    1. एक गरम electrospray आयनीकरण जांच (एच ईएसआई) के साथ QE एमएस लैस. सूचीबद्ध के रूप में जांच के लिए प्रासंगिक ट्यूनिंग पैरामीटर सेट: हीटर तापमान 120 डिग्री सेल्सियस; म्यान गैस, 30; सहायक गैस, 10; गैस, 3 स्वीप; वोल्टेज, के लिए 3.6 केवी स्प्रेसकारात्मक मोड और नकारात्मक मोड के लिए 2.5 केवी. 55 में 320 डिग्री सेल्सियस पर केशिका तापमान, और एस लेंस सेट.
    2. पूर्ण स्कैन रेंज: इस प्रकार है: एक पूर्ण स्कैन विधि बनाएँ 60-900 (मी / z); संकल्प: 70,000; अधिकतम इंजेक्शन समय: 50 मिसे के आसपास ठेठ इंजेक्शन समय के साथ 200 मिसे; स्वत: प्राप्त नियंत्रण (AGC): 3000000 आयनों. ये सेटिंग्स सकारात्मक और नकारात्मक दोनों मोड में स्कैन से बाहर ले जाने के लिए लगभग 550 मिसे के एक कर्तव्य चक्र में परिणाम.
    3. क्रोमैटोग्राफी विधि स्थापित करना. कमरे के तापमान 13,15 में मिश्रित अलग होने के लिए एक एमाइड स्तंभ (100 x 2.1 मिमी आईडी, 3.5 मिमी) से मिलने. जैसा कि ऊपर वर्णित मोबाइल चरण एक है, और मोबाइल चरण बी acetonitrile है. के रूप में निम्नानुसार एक रैखिक ढाल का प्रयोग: 0 मिनट, 85% बी; 1.5 मिनट, 85% बी, 5.5 मिनट, 35% बी; 10min, 35% बी, 10.5 मिनट, 35% बी, 14.5 मिनट, 35% बी, 15 मिनट, 85% बी, और 20 मिनट, 85% बी प्रवाह की दर 0.15 मिलीग्राम / मिनट 0-10 मिनट और 15 है 20 मिनट, और 10.5 से 14.5 मिनट के लिए 0.3 मिलीग्राम / मिनट के लिए.

2. पीआरmetabolite नमूने की eparation

  1. एक निष्कर्षण विलायक तैयार करें. एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में 40 एमएल मेथनॉल (नियंत्रण रेखा एमएस ग्रेड) और 10 मिलीलीटर पानी (नियंत्रण रेखा एमएस ग्रेड) मिक्स, और उपयोग करने से पहले कम से कम 1 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखें. नोट: यह प्रक्रिया और नीचे कदम जैविक ऊतक और तरल पदार्थ के नमूनों की निकासी के लिए संशोधित किया जा सकता है.
    1. पूर्ण मध्यम विकास के साथ तीन से 10 सेमी बर्तन या 6 अच्छी तरह प्लेटें में संस्कृति पेट के कैंसर HCT 8 कोशिकाओं, 1640 RPMI 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम और 100,000 इकाइयों / एल पेनिसिलिन और 100 मिलीग्राम / एल स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक.
    2. कोशिकाओं 80% संगम तक पहुँचते हैं, जल्दी से मध्यम हटाने, और सूखी बर्फ 13,15 के शीर्ष पर पकवान या प्लेट रखें. तुरंत (80% मेथनॉल / जल) विलायक 1 मिलीलीटर निकासी जोड़ें, और -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में थाली हस्तांतरण. एक 10 सेमी पकवान के लिए, प्रत्येक अच्छी तरह से विलायक निष्कर्षण के 3 मिलीलीटर जोड़ें. (मध्यम मध्यम से अवशिष्ट लवण की वजह से आयन दमन प्रभाव से बचने के लिए जितना संभव हो उतना दूर करने के लिए प्रयास करें.)
    3. 15 मिनट के लिए थाली छोड़ दें. फ्रीजर से निकाल दें, और सूखी बर्फ पर विलायक में कोशिकाओं परिमार्जन. 1.7 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूबों के लिए समाधान स्थानांतरण, और 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 20,000 XG की गति के साथ अपकेंद्रित्र. (तीन दोहराने के नमूने बनाने के लिए तीन अलग व्यंजन से सेल मेटाबोलाइट्स तैयार करें. दो ट्यूबों रखने के उद्देश्य के लिए एक बैकअप के रूप में एक है.)
    4. दो नए Eppendorf ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला, और एक गति शून्य में उन्हें सूखी. यह प्रयोग किया जाता गति निर्वात पर निर्भर करता है के बारे में 3-6 घंटे लगते हैं. (नमूने भी नाइट्रोजन गैस के तहत रात भर सूख जा सकता है.)
    5. -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में प्रत्येक नमूने के सूखने, दुकान ट्यूबों के बाद. जब तैयार, 20 मिलीलीटर पानी (नियंत्रण रेखा एमएस ग्रेड) में एक नमूना पुनर्गठन, और विश्लेषण के लिए नियंत्रण रेखा के QE एमएस करने के लिए 5 एमएल इंजेक्षन.

नमूना अनुक्रम के 3. सेटअप

  1. अंशांकन ठीक से QE एमएस पर बाहर किया गया है एक बार, एक प्रवाह में 85% एक साथ 5 मिनट के लिए नियंत्रण रेखा स्तंभ संतुलित करनानियंत्रण रेखा ढाल की प्रारंभिक स्थिति है जो 0.15 मिलीग्राम / मिनट की दर.
  2. यादृच्छिक क्रम में नमूना अनुक्रम सेट करें. नोट: इस तरह, यह प्रत्येक नमूने के लिए नियंत्रण रेखा एमएस द्वारा शुरू की उतार चढ़ाव वितरित और विभिन्न नमूनों के बीच और अधिक सटीक तुलना सुनिश्चित करता है. नियंत्रण रेखा ढाल 10 मिनट के लिए 95% और 0.15 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह की दर के साथ 85% पर एक 5 मिनट स्तंभ संतुलन द्वारा पीछा छोड़कर हर 6 नमूने, एक ही एमएस विधि जो शेयर एक धोने रन जोड़. प्रणाली पृष्ठभूमि का आकलन और स्तरों पर ले जाने के लिए प्रत्येक धोने चलाने के बाद रिक्त नमूने (100% पानी) जोड़ें.
  3. अनुक्रम सहेजें और नियंत्रण रेखा स्तंभ 400 साई के आसपास स्थिर दबाव को दिखाती है, एक बार अनुक्रम रन शुरू करते हैं. कोई अन्य नमूना इस क्रम के बाद चलाने के लिए है, यदि खत्म करने के बाद, फिर ढाल के अंत में 0 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह दर है जो अनुक्रम, के अंत में एक बंद रन जोड़ और "स्टैंडबाय" चयन अनुक्रम.
  4. फिर से चलाने का ही नमूना अंशांकन के बाद 12 घंटे निर्धारित किया है. (यह मैंअंशांकन के बाद बड़े पैमाने पर त्रुटि उतार - चढ़ाव का आकलन करने के लिए है.)

4. पोस्ट विश्लेषण उपकरण साफ सफाई और रखरखाव

  1. अनुक्रम के अंत में, 0.2 2 घंटे के लिए मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह दर पर 95% के साथ स्तंभ धो लें और यदि आवश्यक हो तो, धोने से पहले स्तंभ रिवर्स.
  2. नियंत्रण रेखा स्तंभ निकालें और सीधे एक संघ द्वारा आयन स्रोत के लिए नियंत्रण रेखा कनेक्ट. विलायक, पानी / मेथनॉल / फार्मिक एसिड की सफाई की तैयारी (वी: वी: वी, 90:10:0.2), स्टैंडबाय मोड पर एमएस सेट, और 0.1 का एक प्रवाह दर पर धोने नियंत्रण रेखा एमएस प्रणाली मिलीग्राम / मिनट 1 घंटे के लिए दूर करने के लिए अवशिष्ट लवण या अन्य अशुद्धियों उपजी. बहुत ज्यादा प्रणाली दबाव है अगर प्रवाह दर को कम.
  3. 50 डिग्री सेल्सियस पर केशिका तापमान सेट, और आयन पिंजरे हटा दें. केशिका तापमान 50 डिग्री सेल्सियस तक चला जाता है के बाद सावधानी आयन झाडू कोन और आयन हस्तांतरण ट्यूब बाहर ले आयन झाडू शंकु की सतह पर छोड़ दिया अशुद्धियों को दूर करने के लिए, ऐसे sandpaper के रूप में, किसी न किसी जाल का प्रयोग करें.
  4. आयन हस्तांतरण जगह0.1% चींटी एसिड के साथ 10 मिलीलीटर 90% पानी / मेथनॉल युक्त एक 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में ट्यूब. 20 मिनट के लिए एक पानी के स्नान sonicator में ट्यूब sonicating के बाद, अंदर विलायक छानना 10 मिलीलीटर शुद्ध मेथनॉल के साथ बदलें और एक और 20 मिनट के लिए sonicate. (यदि आवश्यक हो, sonication के 40 डिग्री सेल्सियस या बेहतर सफाई परिणाम प्राप्त करने के लिए एक भी उच्च तापमान पर किया जा सकता है.)

नियंत्रण रेखा एमएस डेटा के 5. विश्लेषण

  1. नमूना अनुक्रम यह सुनिश्चित करने के क्रम में पहले दो नमूने खत्म करने के बाद, अज्ञात मेटाबोलाइट्स के लिए चोटियों की जांच सुचारू रूप से चलता है. Metabolite नाम, तटस्थ रासायनिक सूत्र और पहचान मोड (सकारात्मक या नकारात्मक), इनपुट फ़ाइल के रूप में, और आउटपुट फाइल निकाली चोटियों और पीपीएम में बड़े पैमाने पर त्रुटि है लिस्टिंग के एक सीएसवी फाइल का प्रयोग करें. शिखर आकार असामान्य है या जन त्रुटि अधिक से अधिक 5 पीपीएम से बंद है, तो अनुक्रम के बाकी बंद कर दिया और निवारण किया जाना चाहिए किया जाना चाहिए.
  2. "शिखर संरेखण की विधि चुनेंऔर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर पर फ्रेम निकासी ". नियंत्रण रेखा एमएस और उन्हें समूह से कच्चे डेटा का चयन करें. शिखर संरेखण के लिए क्रोमैटोग्राफी संदर्भ नमूना के रूप में चलाने के अनुक्रम के बीच में नमूने उठाओ. एकत्र आंकड़ों के साथ लक्षित मेटाबोलाइट्स विश्लेषण और इसी फ्रेम बीज के लिए जाना जाता मेटाबोलाइट्स सहित एक फ्रेम बीज अपलोड करें.
  3. अलग सकारात्मक और नकारात्मक मोड में डेटा विश्लेषण करते हैं. अन्य मानकों के लिए डिफ़ॉल्ट सेटिंग का उपयोग करें. डेटाबेस खोज समारोह बंद करें और कार्यप्रवाह चलाते हैं. हर फ्रेम के शिखर क्षेत्र युक्त एक एक्सेल शीट के रूप में संसाधित डेटा निर्यात करें. फ्रेम के पहले सेट लक्षित सूची में मेटाबोलाइट्स के अनुरूप हैं. नोट: एक लक्षित metabolite विश्लेषण के लिए, मेटाबोलाइट्स जानकारी पिछले अध्ययनों 13,15 के आधार पर प्राप्त किया जाता है.
  4. एक अलक्षित metabolite विश्लेषण के लिए, "घटक निष्कर्षण" की विधि का चयन. पृष्ठभूमि घटाव के लिए रिक्त नमूने लेता है. सेट शिखर तीव्रता सीमा एकटी 10 5, 3 के शोर अनुपात करने के लिए 10 पीपीएम और संकेत के एम / Z चौड़ाई.
  5. अज्ञात यौगिकों की पहचान के लिए मानव metabolome डेटाबेस का उपयोग करें. दोहराने के नमूनों के भीतर बड़ी सीवी साथ घटकों को दूर करने के लिए एक CV फिल्टर का प्रयोग करें. स्वयं प्रत्येक घटक के माध्यम से जाने के लिए और अच्छी तरह से परिभाषित शिखर या डेटाबेस खोज के लिए विभिन्न नमूनों प्रकार में अपेक्षाकृत बड़े अंतर के साथ उन उठाओ. डेटाबेस में हिट के साथ निर्यात डेटा. (शिखर संरेखण स्कोर बहुत कम है पीक संरेखण नजरअंदाज किया जा सकता है.)

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Representative Results

metabolomics डेटा की सटीकता अत्यधिक नियंत्रण रेखा-QE-एमएस साधन के प्रदर्शन पर निर्भर करता है. साधन अच्छी हालत में काम कर रही है कि क्या आकलन करने के लिए, और चित्र 1 में दिखाया के रूप में लागू विधि उचित है या नहीं, कई ज्ञात metabolite नियंत्रण रेखा चोटियों, कुल आयन क्रोमैटोग्राफी (घरेलू) से निकाले जाते हैं. अमीनो एसिड सहित ध्रुवीय मेटाबोलाइट्स, ग्लाइकोलाइसिस मध्यवर्ती , टीसीए मध्यवर्ती, nucleotides, विटामिन, इतने पर एटीपी, NADP + और ​​वर्तमान नियंत्रण रेखा परिस्थितियों में एमाइड स्तंभ में स्तंभ और अच्छे पीक आकार पर अच्छा प्रतिधारण है. इस बीच, एक बड़े पैमाने पर त्रुटि परीक्षण तीन प्रतियों में नमूनों की 6 विभिन्न सांद्रता अंशांकन के बाद दो बार चलाए जा रहे हैं. चित्रा 2 में सचित्र के रूप में, कम द्रव्यमान अंशांकन के बाद 24 घंटे के भीतर किया, और पूरे समय सीमा लगभग 24 घंटा शामिल किया गया है. बड़े पैमाने पर त्रुटि लक्षित मेटाबोलाइट्स की सैद्धांतिक मी / z को पता चला मी / z तुलना द्वारा मूल्यांकन किया है. यहाँ लक्षित मेटाबोलाइट्स एक मी / z है74 (ग्लाइसिन) से (NADP +) 744 से लेकर. यहां वाई अक्ष कुछ बड़े पैमाने पर त्रुटि सीमा के भीतर मेटाबोलाइट्स की संचयी प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करता है. लाल रंग की अवस्था 12-24 घंटे से एकत्र किए गए आंकड़ों से पता चलता है, जबकि नीले वक्र, 0-12 घंटे से परिणाम से पता चलता है. 2 स्पष्ट रूप से कम द्रव्यमान है, जिसका अर्थ मेटाबोलाइट्स के 90% से अधिक 5 पीपीएम जन त्रुटि के भीतर हैं इंगित करता है कि चित्रा यहाँ विकसित रेंज अंशांकन विधि कम द्रव्यमान सीमा का पता लगाने के लिए 5 पीपीएम जन त्रुटि को बनाए रखने के लिए पर्याप्त है.

संबोधित करने की एक और मुद्दा वर्तमान पद्धति और साधन स्थापना के साथ साधन की संवेदनशीलता है. 10 सेमी पेट्री डिश से तीन प्रतियों के नमूने के एक धारावाहिक कमजोर पड़ने के नमूनों की 6 विभिन्न सांद्रता के साथ समाप्त, 6 की एक कमजोर पड़ने कारक के साथ 5 बार किया गया था. इन नमूनों 10 7 से निकाले मेटाबोलाइट्स की राशि, 1.67 x 10 6, x 10 5 2.78, 10 x 4 4.63, एक्स 10 3 7.72, और 1.29 प्रतिनिधित्वएक्स 10 कोशिकाओं के 3, क्रमशः. नमूने के प्रत्येक एकाग्रता तीन प्रतियों में तैयार किया जाता है के बाद से, 18 नमूनों की कुल नियंत्रण रेखा-QE-एमएस में विश्लेषण कर रहे हैं. एक लक्षित सूची नमूना की एकाग्रता भिन्न करने के लिए पर पता चला मेटाबोलाइट्स की संख्या का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. चित्रा 3 में परिणाम 1 10 x 7 कोशिकाओं आयन दमन प्रभाव की वजह से है जो पता चला मेटाबोलाइट्स की कम संख्या, दे, जबकि पता चला लक्षित मेटाबोलाइट्स के इष्टतम संख्या, 10 एक्स 5 10 एक्स 2.78 के बीच और 1.67 6 कोशिकाओं है कि इंगित करता है. इस परिणाम इस विश्लेषण के लिए निकालने के लिए कोशिकाओं के इष्टतम राशि 6 ​​अच्छी तरह से थाली में मोटे तौर पर इस बात का एक अच्छी तरह से है कि इंगित करता है.

अलक्षित metabolite विश्लेषण के लिए, 20% की एक CV कटऑफ और 10 7 के एक औसत तीव्रता मूल्य घटक तालिका फिल्टर करने के लिए उपयोग किया जाता है. इन कठोर CV और औसत तीव्रता दहलीज मूल्यों इस प्रदर्शन के उद्देश्य के लिए उपयोग किया जाता है. Reproducibility में सुधार, सीवी कटऑफ मूल्यों हो सकता हैऔसत तीव्रता मूल्यों अधिक चोटियों शामिल करने के लिए (उदाहरण के लिए, 10 5) कम किया जा करने की जरूरत है, जबकि (उदाहरण के लिए, 30%) की वृद्धि हुई. बाद मैन्युअल चोटियों जाँच, अच्छा आकार के साथ घटकों चयनित और मानव metabolome डेटाबेस में खोजा जाता है. परिणाम तालिका 2 बी नकारात्मक मोड से परिणाम से पता चलता है. टेबल 2A, सकारात्मक मोड में एकत्र आंकड़ों से परिणामों की सूची तालिका 2 में दिखाया गया. यहां पहचान मेटाबोलाइट्स के कुछ ऐसे ग्लाइकोलाइसिस से प्राप्त किया जा सकता है जो methyglyoxal,, और 1 के रूप में इस तरह के Glutathione, प्रोलाइन और इतने पर है, लेकिन इस बीच, लक्षित सूची से अनुपस्थित अतिरिक्त मेटाबोलाइट्स तलाश रहे हैं के रूप में लक्षित सूची में मेटाबोलाइट्स, साथ ओवरलैप एक एमाइड स्तंभ पर phospholipids के लिए एक उचित अवधारण है जो 3.2 मिनट की एक अवधारण समय के साथ सकारात्मक में पता चला है जो palmitoyl-2-oleoyl-एस.एन. ग्लिसरो-3-phosphocholine,. अलक्षित metabolite डेटाबेस खोज पर एक प्रोटोकॉल जनसंपर्क किया गया हैeviously 20 की सूचना दी.

चित्रा 1
चित्रा 1. नियंत्रण रेखा एमएस क्रोमैटोग्राफी चोटियों के उदाहरण हैं. यहाँ खंगाला क्रोमैटोग्राफी 10 पीपीएम के एक जन खिड़की (मी / z ± 5 पीपीएम) के साथ उत्पन्न होता है. बी नकारात्मक मोड से चोटियों से पता चलता है, जबकि एक्स अक्ष वाई अक्ष रिश्तेदार तीव्रता से पता चलता है, जबकि अवधारण समय से पता चलता है, और चोटी तीव्रता हर metabolite ऊपर सूचीबद्ध है. एक सकारात्मक मोड से पता चला चोटियों से पता चलता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. 60;. कम द्रव्यमान सीमा अंशांकन का मूल्यांकन वाई अक्ष 5 पीपीएम के भीतर बड़े पैमाने पर पता लगाने त्रुटि के साथ मेटाबोलाइट्स का संचयी प्रतिशत है. एक्स अक्ष पीपीएम में बड़े पैमाने पर त्रुटि सीमा है. नीले और लाल घटता क्रमशः, 0-12 घंटा और 12-24 घंटे का प्रतिनिधित्व करते हैं. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
. नमूना राशि का आंकड़ा 3 मूल्यांकन -. HCT की संख्या 8 कोशिकाओं की तुलना में पता चला लक्षित मेटाबोलाइट्स की संख्या लाल वर्गों सकारात्मक मोड में पाया चयापचयों का प्रतिनिधित्व करते हैं, नीले हलकों नकारात्मक मोड में मापा मेटाबोलाइट्स मतलब है, और काले त्रिकोण दोनों से मेटाबोलाइट्स की कुल संख्या हैं सकारात्मक और नकारात्मक मोड. एक्स अक्ष HCT 8 कोशिकाओं की संख्या से पता चलता है.upload/51358/51358fig3highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

<टीडी> एनए
मानक मी / z, सकारात्मक मोड मी / z, नकारात्मक मोड तटस्थ सूत्र तटस्थ जन
N-Butylamine 74.096425 एनए सी 4 एच 11 एन 73.089149
कैफीन टुकड़ा 138.066188 एनए सी 6 एच 8 3 एन ओ 137.058912
कैफीन 195.087652 एनए सी 8 एच 11 एन 42 194.080376
Diazinon 305.108329 एनए सी 12 एच 20 एन 23 पी एस 304.101053
MRFA पेप्टाइड 524.264966 सी 23 घंटे 37 उत्तर 7 हे 5 एस 523.25769
Fluoroacetate N / A 77.004432 सी 2 एच 3 एफओ 2 78.011708
सल्फेट N / A 96.960106 एच 2 एसओ 4 97.967382
Homovanillic एसिड N / A 181.050634 सी 9 घंटे 10 हे 4 182.05791
Dodecyl सल्फेट N / A 265.147906 सी 12 घंटे 26 अतः 4 266.155182
Taurocholate N / A 514.2844 सी 26 एच 45 7 नहीं एस 515.291676

तालिका 1. कम द्रव्यमान सीमा अंशांकन मानकों और उनकी सटीक मी / z.

<टीडी> 131.05901
सेन्टर फार स्टडी नाम सूत्र Monoisotopic मास मास खोज त्रुटि (पीपीएम) आर टी (मिनट)
234 बीटा alanine 3 सी एच 7 सं 2 89.04800 89.04805 0.62 8.08
1057 Sarcosine 3 सी एच 7 सं 2 89.04768 89.04805 4.22 8.08
5735 alanine 3 सी एच 7 सं 2 89.04768 89.04805 4.22 8.08
568 क्रिएटिनिन सी 4 एच 7 एन 3 हे 113.05900 113.05889 1.00 4.41
128,566 प्रोलाइन सी 5 घंटे 9 सं 2 115.06333 115.06338 0.41 7.54
6050 एल (+)-Valine सी 5 घंटे 11 सं 2 117.07898 117.07896 0.18 7.42
7762 Amyl नाइट्राट मैं सी 5 घंटे 11 सं 2 117.07898 117.07896 0.18 7.42
135 5 अमीनो मुल एसिड सी 5 घंटे 11 सं 2 117.07900 117.07896 0.38 7.42
242 trimethylglycine सी 5 घंटे 11 सं 2 117.07900 117.07896 0.38 7.42
911 Niacinamide C6H6N2O 122.04800 122.04793 0.55 2.60
1091 Taurin सी 2 एच 7 सं 3 एस 125.01466 125.01469 0.20 7.61
1030 Pyrroline hydroxycarboxylic एसिड सी 5 घंटे 7 सं 3 129.04259 129.04259 0.02 8.51
7127 पीसीए सी 5 घंटे 7 सं 3 129.04259 129.04259 0.02 8.51
90,657 एन Acryloylglycine सी 5 घंटे 7 सं 3 129.04259 129.04259 0.02 8.51
388,752 5-oxo-D-Prolin सी 5 घंटे 7 सं 3 129.04259 129.04259 0.02 8.51
389,257 3-hydroxy-3 ,4-Dihydro-2H-pyrrole-5-कार्बोक्जिलिक एसिड सी 5 घंटे 7 सं 3 129.04259 129.04259 0.02 8.51
8031176 Pyrrolidonecarboxylic एसिड सी 5 घंटे 7 सं 3 129.04259 129.04259 0.03 8.51
5605 Hydroxyproline सी 5 घंटे 9 सं 3 131.05824 131.05901 5.83 8.08
7068 एन Acetylalanin सी 5 घंटे 9 सं 3 131.05824 5.83 8.08
79,449 एसी आला ओह सी 5 घंटे 9 सं 3 131.05824 131.05901 5.83 8.08
89122 Ethylformylglycine सी 5 घंटे 9 सं 3 131.05824 131.05901 5.83 8.08
167,744 एल glutamic-गामा semialdehyde सी 5 घंटे 9 सं 3 131.05824 131.05901 5.83 8.08
388,519 5 अमीनो 2 oxopentanoic एसिड सी 5 घंटे 9 सं 3 131.05824 131.05901 5.83 8.08
134 Aminolevulinic एसिड सी 5 घंटे 9 सं 3 131.05800 131.05901 </ P> 7.70 8.08
9312313 3-hydroxy-एल प्रोलाइन सी 5 घंटे 9 सं 3 131.05800 131.05901 7.70 8.08
566 Creatine सी 4 एच 9 एन 32 131.06900 131.06905 0.36 8.08
5880 एल (+)-Leucine सी 6 एच 13 सं 2 131.09464 131.09455 0.68 6.96
6067 एल (+)-Isoleucine सी 6 एच 13 सं 2 131.09464 131.09455 0.68 6.96
19,964 एल Norleucine सी 6 एच 13 सं 2 131.09464 131.09455 0.68 6.96 </ P>
388,796 बीटा Leucine सी 6 एच 13 सं 2 131.09464 131.09455 0.68 6.96
548 Aminocaproic एसिड सी 6 एच 13 सं 2 131.09500 131.09455 3.48 6.96
6031 एल (-)-asparagine सी 4 एच 8 एन 23 132.05350 132.05348 0.10 8.31
109 Ureidopropionic एसिड सी 4 एच 8 एन 23 132.05299 132.05348 3.71 8.31
6026 एल ओर्निथिन सी 5 घंटे 12 एन 22 132.08987 132.08988 0.02 10.37
64,236 डी ओर्निथिन सी 5 घंटे 12 एन 22 132.08987 132.08988 0.02 10.37
5746 Glutamine सी 5 घंटे 10 एन 23 146.06914 146.06900 0.93 8.25
128,633 D-Glutamine सी 5 घंटे 10 एन 23 146.06914 146.06900 0.93 8.25
141,172 Ureidoisobutyric एसिड सी 5 घंटे 10 एन 23 146.06914 146.06900 0.93 8.25
21436 एन मिथाइल-<scp> डी </ एससीपी>-एसपारटिक एसिड सी 5 घंटे 9 किसी 4 147.05316 147.05300 1.13 8.06
21,814 डी (-) glutamic एसिड सी 5 घंटे 9 किसी 4 147.05316 147.05300 1.13 8.06
30572 एल (+) glutamic एसिड सी 5 घंटे 9 किसी 4 147.05316 147.05300 1.13 8.06
58,744 एन Acetyl-एल सेरीन सी 5 घंटे 9 किसी 4 147.05316 147.05300 1.13 8.06
5907 एल (-)-methionine सी 5 घंटे 11 सं 2 एस 149.05106 149.05095 0.70 7.39
6038 हिस्टडीन सी 6 एच 9 एन 32 155.06947 155.06940 0.48 8.33
5910 एल (-) फेनिलएलनिन सी 9 घंटे 11 सं 2 165.07898 165.07887 0.63 6.60
1025 Pyridoxine सी 8 एच 11 सं 3 169.07390 169.07376 0.80 3.24
4463 Oxidopamine [USAN: सराय] सी 8 एच 11 सं 3 169.07390 169.07376 0.80 3.24
102,750 5 - (2 aminoethyl) Pyrogallol सी 8 एच 11 सं 3 169.07390 169.07376 0.80 3.24
388,394 Norepinephrine सी 8 एच 11 सं 3 169.07390 169.07376 0.80 3.24
6082 एल (+)-arginine सी 6 एच 14 एन 42 174.11168 174.11144 1.39 10.77
64,224 D-Arg सी 6 एच 14 एन 42 174.11168 174.11144 1.39 10.77
780 heteroauxin सी 10 एच 9 सं 2 175.06300 175.06304 0.18 2.32
67,261 इण्डोल-3-एसीटैल्डिहाइड, 5-हाइड्रोक्सी सी 10 एच 9 सं 2 175.06332 175.06304 1.65 2.32
3574185 इण्डोल-2-एसिटिक एसिड सी 10 एच 9 सं 2 175.06332 175.06304 1.65 2.32
5833 एल (-)-Tyrosine सी 9 घंटे 11 सं 3 181.07390 181.07378 0.66 7.48
389,285 3 अमीनो 3 (4 hydroxyphenyl) propanoic एसिड सी 9 घंटे 11 सं 3 181.07390 181.07378 0.66 7.48
13628311 एल threo-3-phenylserine सी 9 घंटे 11 सं 3 181.07390 181.07378 0.66 7.48
425 4-hydroxy-4-(3 pyridyl) butanoic एसिड सी 9 घंटे 11 सं 3 181.07401 181.07378 1.25 7.48
13899 3 - (1H-आँतों की पीब का एक उत्पाद-3-YL) एक्रिलिक एसिड सी 11 एच 9 सं 2 187.06332 187.06330 0.15 6.44
10607876 Indoleacrylic एसिड सी 11 एच 9 सं 2 187.06332 187.06330 0.15 6.44
389,120 N6, N6, N6-Trimethyl एल lysine सी 9 घंटे 20 एन 22 188.15248 188.15221 1.45 10.87
388,321 5 "-S-मिथाइल-5"-thioadenosine सी 11 एच 15 एन 53 एस 297.08957 297.08898 2.00 2.56
144 9 - (5-S-मिथाइल-5-thiopentofuranosyl) 9h के-Purin-6-amine सी 11 एच 15 एन 53 एस 297.09000 297.08898 3.43 2.56
111,188 Glutathione सी 10एच 17 एन 3 हे 6 307.08380 307.08345 1.14 8.02

टेबल 2A.

5 घंटे 9 सं 3 11 एच 19 नहीं 9
सेन्टर फार स्टडी नाम सूत्र Monoisotopic मास मास खोज त्रुटि (पीपीएम) आर टी (मिनट)
857 Methylglyoxal 3 सी एच 4 हे 2 72.02100 72.02108 1.03 7.70
1057 Sarcosine 3 सी एच 7 सं 2 89.04768 89.04747 2.33 8.19
5735 alanine 3 सी एच 7 सं 2 89.04768 89.04747 2.33 8.19
234 बीटा alanine 3 सी एच 7 सं 2 89.04800 89.04747 5.93 8.19
55423 आर लैक्टिक एसिड 3 सी एच 6 हे 3 90.03169 90.03143 2.91 5.12
61,460 Hydroxypropionic एसिड 3 सी एच 6 हे 3 90.03169 90.03143 2.91 5.12
96,860 एल (+) लैक्टिक एसिड 3 सी एच 6 हे 3 90.03169 90.03143 2.91 5.12
592 लैक्टिक एसिड 3 सी एच 6 हे 3 90.03200 90.03143 6.29 5.12
650 Dihydroxyacetone 3 सी एच 6 हे 3 90.03200 90.03143 6.29 5.12
731 Glyceraldehyde 3 सी एच 6 हे 3 90.03200 90.03143 6.29 5.12
1086 गंधक का तेजाब एच 24 एस 97.96738 97.96683 5.63 8.13
128,566 प्रोलाइन सी 5 घंटे 9 सं 2 115.06333 115.06302 2.67 7.78
1078 Succinic एसिड सी 4 एच 6 हे 4 118.02661 118.02630 2.66 7.72
466,979 Erythrono -1 ,4-लैक्टोन सी4 एच 6 हे 4 118.02661 118.02630 2.66 7.72
4483398 डी Erythronic जी लैक्टोन सी 4 एच 6 हे 4 118.02661 118.02630 2.66 7.72
473 Methylmalonic एसिड सी 4 एच 6 हे 4 118.02700 118.02630 5.96 7.72
8527138 (3S, 4 आर) -3,4-Dihydroxydihydrofuran -2 (3H) एक सी 4 एच 6 हे 4 118.02700 118.02630 5.96 7.72
140,384 2 ketocaproic एसिड सी 6 एच 103 130.06299 130.06270 2.24 2.35
164,251 Methyloxovaleric एसिड सी 6 एच 103 130.06299 130.06270 2.24 2.35
388,419 (3S) -3 मिथाइल-2-oxopentanoic एसिड सी 6 एच 103 130.06299 130.06270 2.24 2.35
15642233 Ketoleucine सी 6 एच 103 130.06299 130.06270 2.24 2.35
46 एक-oxo-B-methylvaleric एसिड सी 6 एच 103 130.06300 130.06270 2.36 2.35
69 अल्फा ketoisocaproic एसिड सी 6 एच 103 130.06300 130.06270 2.36 2.35
134 Aminolevulinic एसिड 131.05800 131.05795 0.36 8.19
9312313 3-hydroxy-एल प्रोलाइन सी 5 घंटे 9 सं 3 131.05800 131.05795 0.36 8.19
5605 Hydroxyproline सी 5 घंटे 9 सं 3 131.05824 131.05795 2.23 8.19
7068 एन Acetylalanin सी 5 घंटे 9 सं 3 131.05824 131.05795 2.23 8.19
79,449 एसी आला ओह सी 5 घंटे 9 सं 3 131.05824 131.05795 2.23 8.19
89122 Ethylformylglycine सी 5 घंटे 9 सं 3 131.05824 131.05795 2.23 8.19
167,744 एल glutamic-गामा semialdehyde सी 5 घंटे 9 सं 3 131.05824 131.05795 2.23 8.19
388,519 5 अमीनो 2 oxopentanoic एसिड सी 5 घंटे 9 सं 3 131.05824 131.05795 2.23 8.19
5880 एल (+)-Leucine सी 6 एच 13 सं 2 131.09464 131.09419 3.39 7.09
6067 एल (+)-Isoleucine सी 6 एच 13 सं 2 131.09464 131.09419 3.39 7.09
19,964 एल Norleucine सी 6 एच 13 सं 2 131.09464 131.09419 3.39 7.09
388,796 बीटा Leucine सी 6 एच 13 सं 2 131.09464 131.09419 3.39 7.09
548 Aminocaproic एसिड सी 6 एच 13 सं 2 131.09500 131.09419 6.18 7.09
109 Ureidopropionic एसिड सी 4 एच 8 एन 23 132.05299 132.05321 1.60 8.28
6031 एल (-)-asparagine सी 4 एच 8 एन 23 132.05350 132.05321 2.21 8.28
6026 एल ओर्निथिन सी 5 घंटे 12 एन 22 132.08987 132.08961 1.98 10.36
64,236 डी ओर्निथिन सी 5 घंटे 12 एन 22 132.08987 132.08961 1.98 10.36
193,317 एल (-) सेब का तेज़ाब सी 4 एच 6 हे 5 134.02153 134.02130 1.72 7.95
510 (±) सेब का तेज़ाब सी 4 एच 6 हे 5 134.02200 134.02130 5.25 7.95
133,224 threonic एसिड सी 4 एच 8 हे 5 136.03717 136.03688 2.14 7.70
388,628 2,3,4-Trihydroxybutanoic एसिड सी 4 एच 8 हे 5 136.03717 136.03688 2.14 7.70
2061231 डीएल erythronic एसिड सी 4 एच 8 हे 5 136.03717 136.03688 2.14 7.70
21436 एन मिथाइल-<scp> डी </ एससीपी>-एसपारटिक एसिड सी 5 घंटे 9 किसी 4 147.05316 147.05299 1.16 8.05
21,814 डी (-) glutamic एसिड सी 5 घंटे 9 किसी 4 147.05316 147.05299 1.16 8.05
30572 एल (+) glutamic एसिड सी 5 घंटे 9 किसी 4 147.05316 147.05299 1.16 8.05
58,744 एन Acetyl-एल सेरीन सी 5 घंटे 9 किसी 4 147.05316 147.05299 1.16 8.05
6038 हिस्टडीन सी 6 एच 9 एन 32 155.06947 155.06930 1.09 8.36
199 Allantoin सी 4 एच 6 4 एन ओ 3 158.04401 158.04387 0.88 4.76
6082 एल (+)-arginine सी 6 एच 14 एन 42 174.11168 174.11154 0.80 10.76
64,224 D-Arg सी 6 एच 14 एन 42 174.11168 174.11154 0.80 10.76
58,576 एन Acetyl-एल Aspartic एसिड सी 6 एच 9 5 नहीं 175.04807 175.04803 0.18 7.87
996 Pyrophosphoric एसिड एच 4 हे 7 पी 2 177.94299 177.94331 1.79 8.42
5589 ग्लूकोज सी 6 एच 12 हे 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
17,893 Mannose सी 6 एच 12 हे 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
58,238 . Beta.-D-Glucopyranose सी 6 एच 12 हे 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
71,358 . Alpha.-D-Glucopyranose सी 6 एच 12 हे 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
134,838 3 डिओक्सी arabino-hexonic एसिड सी 6 एच 12 हे 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
388,332 एल Sorbopyranose सी 6 एच 12 हे 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
388,476 बीटा-D-galactopyranose सी 6 एच 12 हे 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
388,480 . Alpha.-D-Galactopyranose सी 6 एच 12 हे 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
388,775 बीटा-D-Fructofuranose सी 6 एच 12 हे 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
10239179 Inositol सी 6 एच 12 हे 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
16736992 सीआईएस inositol सी 6 एच 12 हे 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
17216070 allose सी 6 एच 12 हे 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
17216093 एल Sorbose सी 6 एच 12 हे 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
201 hexopyranose सी 6 एच 12 हे 6 180.06300 180.06346 2.53 7.53
868 1,2,3,4,5,6-Cyclohexanhexol सी 6 एच 12 हे 6 180.06300 180.06346 2.53 7.53
2068 Theophylline सी 7 एच 8 4 एन ओ 2 180.06473 180.06346 7.04 7.53
4525 1,7-डाइमिथाइल-xanthine सी 7 एच 8 4 एन ओ 2 180.06473 180.06346 7.04 7.53
5236 थियोब्रोमाइन सी 7 एच 8 4 एन ओ 2 180.06473 180.06346 7.04 7.53
1161 isocitric एसिड सी 6 एच 8 हे 7 192.02701 192.02704 0.15 8.18
305 सीआईtric एसिड सी 6 एच 8 हे 7 192.02699 192.02704 0.23 8.18
963 विटामीन बी कम्पलैक्स का एक सदस्य सी 9 घंटे 17 5 नहीं 219.11067 219.11049 0.84 6.72
6361 डी pantothenic एसिड सी 9 घंटे 17 5 नहीं 219.11067 219.11049 0.84 6.72
960 palmitic एसिड सी 16 घंटे 322 256.23999 256.24000 0.05 1.73
111,188 Glutathione सी 10 एच 17 एन 3 हे 6 307.08380 307.08339 1.35 8.03
388,337 एन Acetylneuraminic एसिड 309.10599 309.10585 0.45 7.43
392,681 एन Acetyl-अल्फा neuraminic एसिड सी 11 एच 19 नहीं 9 309.10599 309.10585 0.45 7.43
392,810 सियालिक एसिड Neu5Ac सी 11 एच 19 नहीं 9 309.10599 309.10585 0.45 7.43

तालिका 2 बी.

. तालिका 2 HCT में पता चला अलक्षित मेटाबोलाइट्स की सूची 8 कोशिकाओं (2.78 x 10 5 कोशिकाओं तुल्यता) टेबल 2A और 2B घटकों निकासी जानकारी शामिल हैं:. अवधारण समय, एम / Z और बड़े पैमाने पर त्रुटि है, और इस बीच, डेटाबेस खोज के परिणाम: ChemSpider आईडी ( सेन्टर फार स्टडी), नाम, सूत्र, और इतने पर. यहाँ का विश्लेषण नमूने equa हैं2.78 x 10 5 कोशिकाओं से निकाले मेटाबोलाइट्स एल, और तीव्रता दहलीज प्रदर्शन उद्देश्य के लिए थकाऊ परिणाम से बचने के लिए 1 एक्स 10 7 है.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल का उपयोग कोशिकाओं में सफल metabolite रूपरेखा के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं: 1) मध्यम विकास और कोशिकाओं से सावधान निकासी को नियंत्रित; 2) quantitation के लिए एक शिखर भर में पर्याप्त (आमतौर पर कम से कम 10) डेटा अंक हैं सुनिश्चित करने के लिए एमएस विधि सेटअप के आधार पर नियंत्रण रेखा विधि एडजस्ट; 3) नमूने को चलाने से पहले एक कम द्रव्यमान अंशांकन कर; 4) स्थानांतरण अवधारण समय से बचने के लिए अधिक से अधिक 5 मिलीलीटर इंजेक्शन लगाने और शिखर व्यापक बनाने के पानी की वजह से; और 5) बैच प्रभाव को कम करने के लिए एक ही बैच में तुलना के लिए नमूने तैयार करने और चल रहा है.

मानकों कम द्रव्यमान सीमा अंशांकन के लिए यहाँ चुना (1 टेबल) विनिमेय हैं. जन रेंज स्कैन में गिर जाता है कि एक मी / z साथ किसी भी ज्ञात परिसर, अच्छी तरह से एक एच ईएसआई स्रोत में व्यवहार किया है, और अंशांकन मानकों के लिए उचित उम्मीदवार हैं पानी, मेथनॉल, या acetonitrile में घुलनशील है. यह अत्यधिक सभी अंशांकन समाधान एक दुकान में सिफारिश की हैटी 4 डिग्री सेल्सियस कैफीन को स्थिर करने के लिए और भी अंशांकन प्रदर्शन अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हो सकता है कि इतना अंशांकन समाधान में मेथनॉल या acetonitrile के वाष्पीकरण को कम करने के लिए. 2,000 150 से एक नियमित रूप से बड़े पैमाने पर सीमा, मी / z की तुलना में, कम द्रव्यमान सीमा अंशांकन हर दो दिन में कम से कम एक बार, अधिक बार किया जाना चाहिए.

निष्कर्षण विलायक, पुनर्गठन विलायक, नियंत्रण रेखा मोबाइल चरण, कम द्रव्यमान सीमा अंशांकन और एमएस करने के लिए स्कैन से यह कार्यप्रवाह, सीमा ध्रुवीय चयापचयों को मापने के लिए अनुकूलित किया गया है. यह इतने पर अमीनो एसिड एसिटाइल अमीनो एसिड, ग्लाइकोलाइसिस मार्ग मध्यवर्ती, nucleosides, TCA चक्र मध्यवर्ती, कुछ एक कार्बन चयापचय मार्ग मध्यवर्ती और भी शामिल है. हालांकि, इस तरह coenzyme एक (सीओए) प्रजाति के रूप में मेटाबोलाइट्स के अन्य वर्गों के लिए इस प्रोटोकॉल के संशोधन, folates, phospholipids संभव हो रहे हैं. उदाहरण के लिए, थलसेनाध्यक्ष अम्लीय परिस्थितियों में अधिक स्थिर हैं, तो 80% मेथनॉल / पानी के लिए एक एसिड के अलावा छोटा सा भूत के लिए मददगार होगाघूमना कोए संवेदनशीलता. इसके अलावा, थलसेनाध्यक्ष और लिपिड इस प्रकार मी / z स्कैन रेंज 60-900 उन मेटाबोलाइट्स को कवर किया जाएगा जो उचित सीमा को समायोजित करने की आवश्यकता है, बहुत बड़ी आणविक भार हो जाते हैं.

अलक्षित घटक डेटाबेस खोज परिणामों में से कुछ लक्षित सूची के साथ ओवरलैप हालांकि, यह अनुसंधान प्राथमिकता के आधार पर इस लक्षित सूची का निर्माण करने के महत्व का भी है. लक्षित सूची में मेटाबोलाइट्स औसत तीव्रता सीमा से कम कर रहे हैं, इन मेटाबोलाइट्स पर जानकारी प्रसंस्करण के दौरान हटा दिया जाएगा. लक्षित सूची हमें metabolite पहचान और quantitation के लिए उच्च आत्मविश्वास देता है जो अवधारण समय की जानकारी भी शामिल है. QE एमएस स्थापना के साथ एक और फायदा मिलकर जन स्पेक्ट्रोमेट्री मेटाबोलाइट्स के आगे पहचान के लिए अनुमति दे सकते हैं.

इस कार्यप्रवाह के साथ जुड़ा एक मुद्दा है कि एच ईएसआई सुई INSEगैर अस्थिर लवण की उच्च मात्रा में होते हैं, तो संवेदनशीलता बहुत समझौता हो जाएगा के रूप में आर टी, नमूने के नमक सामग्री के प्रति संवेदनशील है. इसलिए, नमूने, और स्तंभ और एच ईएसआई सुई डालने की नियमित सफाई से कम से कम नमक सामग्री अच्छी गुणवत्ता वाले डेटा को सुनिश्चित करने के लिए और स्तंभ का जीवनकाल बढ़ाने के लिए उपयोगी हो जाएगा.

संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल न्यूनतम नमूना तैयार कदम और तेजी से डाटा अधिग्रहण के साथ सफलतापूर्वक संवर्धित कोशिकाओं से ध्रुवीय चयापचयों का विश्लेषण करने के लिए नियंत्रण रेखा के QE एमएस कार्यरत हैं. नमूना तैयार करने में छोटे संशोधनों ऐसे सीरम और ऊतकों के रूप में अन्य जैविक स्रोतों से डेटा प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, शुद्ध मेथनॉल तरल सीरम में जोड़ा जा सकता है के बाद से ध्रुवीय मेटाबोलाइट्स निकासी के लिए 80% करने के लिए एक अंतिम मेथनॉल एकाग्रता बनाने के लिए कहा. ऊतक के नमूने लिए, कठोर सरगर्मी और मिश्रण बेहतर निकासी दक्षता प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. 10 मिलीलीटर सीरम या आमतौर पर1 मिलीग्राम ऊतक मेटाबोलाइट्स विश्लेषण के लिए पर्याप्त है. कच्चे डेटा, लक्षित मोड में दोनों का विश्लेषण किया जा सकता है वहाँ जाना जाता मेटाबोलाइट्स नमूनों में हैं, और अगर HRMS डेटाबेस खोज के द्वारा पीछा किया एक संयुक्त राष्ट्र लक्षित रास्ते में. HRMS आधारित metabolomics अपनी प्रारंभिक अवस्था में है. भविष्य अग्रिमों के लिए, प्रयोगात्मक तकनीकों आगे, अनुकूलित अतिरिक्त metabolite HRMS जानकारी और एमएस / एमएस विखंडन पैटर्न जैसे चोटी संरेखण, शिखर एकीकरण, आइसोटोप क्लस्टरिंग और इतने पर, की क्षमता और सटीकता में सुधार कर सकते हैं के रूप में उपयोगी और प्रासंगिक एल्गोरिदम, हो जाएगा किया जा सकता है डाटा प्रोसेसिंग. अंत में, हालांकि, चयापचय में हमारी प्रयोगशाला पतों प्रसंस्करण के बाद डेटा के सावधान व्याख्या द्वारा सीमित कर रहे हैं कि कई सवालों का. इन बड़े पैमाने पर metabolomics तकनीक के साथ, हम अक्सर उत्पन्न परिकल्पना के डेटा और मूल्यांकन की हमारी व्याख्या द्वारा सीमित हैं. इसलिए, सभी metabolomics प्रयोगों विशिष्ट सवालों के चारों ओर से तैयार की जरूरत है.

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Disclosures

लेखक ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा.

Acknowledgements

लेखकों जन अंशांकन और डाटा प्रोसेसिंग पर बहुमूल्य विचार विमर्श के लिए Detlef शुमान, जेनिफर सटन (थर्मो फिशर साइंटिफिक) और नथानिएल स्नाइडर (पेन्सिलवेनिया विश्वविद्यालय) स्वीकार करना चाहते हैं. इस प्रकाशन में सूचना दी अनुसंधान पुरस्कार संख्या R00CA168997 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के राष्ट्रीय कैंसर संस्थान द्वारा समर्थित किया गया. सामग्री केवल लेखकों की ज़िम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Positive calibration mix Thermo Scientific #88323 It is light sensitive. Store at 4 °C
Negative calibration mix Thermo Scientific #88324 Store at 4 °C
Diazinon Sant Cruz Biotechnology #C0413 It causes eyes irritation, so work in hood. Store at 4 °C
H-ESI needle insert Fisher Scientific #1303200 This could be replaced or cleaned with 5% formic acid/water (remove rubber ring) if clogged.
Xbridge amide column Waters #186004860 Guard column is recommend to increase column lifetime.

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References

  1. Fiehn, O. Combining genomics, metabolome analysis, and biochemical modelling to understand metabolic networks. Comparative and Functional Genomics. 2, (3), 155-168 (2001).
  2. Mulleder, M., et al. A prototrophic deletion mutant collection for yeast metabolomics and systems biology. Nature Biotechnology. 30, (12), 1176-1178 (2012).
  3. Patel, V. R., Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P., Baldi, P. CircadiOmics: Integrating circadian genomics, transcriptomics, proteomics and metabolomics. Nature Methods. 9, (8), 772-773 (2012).
  4. Ideker, T., et al. Integrated genomic and proteomic analyses of a systematically perturbed metabolic network. Science. 292, (5518), 929-934 (2001).
  5. Jonsson, P., et al. A strategy for identifying differences in large series of metabolomic samples analyzed by GC/MS. Analytical Chemistry. 76, (6), 1738-1745 (2004).
  6. Jonsson, P., et al. High-throughput data analysis for detecting and identifying differences between samples in GC/MS-based metabolomic analyses. Analytical Chemistry. 77, (17), 5635-5642 (2005).
  7. Weljie, A. M., Newton, J., Mercier, P., Carlson, E., Slupsky, C. M. Targeted profiling: Quantitative analysis of 1H NMR metabolomics data. Analytical Chemistry. 78, (13), 4430-4442 (2006).
  8. Wiklund, S., et al. Visualization of GC/TOF-MS-based metabolomics data for identification of biochemically interesting compounds using OPLS class models. Analytical Chemistry. 80, (1), 115-122 (2008).
  9. Xia, J., Bjorndahl, T. C., Tang, P., Wishart, D. S. MetaboMiner--semi-automated identification of metabolites from 2D NMR spectra of complex biofluids. BMC Bioinformatics. 9, 507 (2008).
  10. Lu, D., et al. 13C NMR isotopomer analysis reveals a connection between pyruvate cycling and glucose-stimulated insulin secretion (GSIS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, (5), 2708-2713 (2002).
  11. Shen, J., et al. Determination of the rate of the glutamate/glutamine cycle in the human brain b. in vivo 13C NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, (14), 8235-8240 (1999).
  12. Kitteringham, N. R., Jenkins, R. E., Lane, C. S., Elliott, V. L., Park, B. K. Multiple reaction monitoring for quantitative biomarker analysis in proteomics and metabolomics. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877, (13), 1229-1239 (2009).
  13. Locasale, J. W., et al. Metabolomics of human cerebrospinal fluid identifies signatures of malignant glioma. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11, (6), 10-1074 (2012).
  14. Wolf-Yadlin, A., Hautaniemi, S., Lauffenburger, D. A., White, F. M. Multiple reaction monitoring for robust quantitative proteomic analysis of cellular signaling networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, (14), 5860-5865 (2007).
  15. Yuan, M., Breitkopf, S. B., Yang, X., Asara, J. M. A positive/negative ion-switching, targeted mass spectrometry-based metabolomics platform for bodily fluids, cells, and fresh and fixed tissue. Nature Protocols. 7, (5), 872-881 (2012).
  16. Ramanathan, R., et al. It is time for a paradigm shift in drug discovery bioanalysis: From SRM to HRMS. Journal of Mass Spectrometry : JM. 46, (6), 595-601 (2011).
  17. Lu, W., Clasquin, M. F., Melamud, E., Amador-Noguez, D., Caudy, A. A., Rabinowitz, J. D. Metabolomic analysis via reversed-phase ion-pairing liquid chromatography coupled to a stand alone orbitrap mass spectrometer. Analytical Chemistry. 82, (8), 3212-3221 (2010).
  18. Michalski, A., et al. Ultra high resolution linear ion trap orbitrap mass spectrometer (orbitrap elite) facilitates top down LC MS/MS and versatile peptide fragmentation modes. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11, (3), 10-1074 (2012).
  19. Michalski, A., et al. Mass spectrometry-based proteomics using Q exactive, a high-performance benchtop quadrupole orbitrap mass spectrometer. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 10, (9), (2011).
  20. Snyder, N. W., Khezam, M., Mesaros, C. A., Worth, A., Blair, I. A. Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry. UPLC-HRMS). J. Vis. Exp. (75), (2013).
  21. Gika, H. G., Theodoridis, G. A., Wingate, J. E., Wilson, I. D. Within-day reproducibility of an HPLC-MS-based method for metabonomic analysis: Application to human urine. Journal of Proteome Research. 6, (8), 3291-3303 (2007).
  22. Want, E. J., et al. Global metabolic profiling procedures for urine using UPLC-MS. Nature Protocols. 5, (6), 1005-1018 (2010).

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