Стратегия для чувствительной, крупномасштабного Количественные Metabolomics

1Division of Nutritional Sciences, Cornell University, 2Field of Biochemistry, and Molecular Cell Biology, Cornell University
Published 5/27/2014
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Метаболита профилирования был ценным активом в изучении обмена веществ в норме и патологии. Используя обычный поэтапное жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрии высокого разрешения с переключением полярности и быстрым рабочим циклом, мы опишем протокол для анализа полярный метаболический состав биологического материала с высокой чувствительностью, точностью и разрешением.

Cite this Article

Copy Citation

Liu, X., Ser, Z., Cluntun, A. A., Mentch, S. J., Locasale, J. W. A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics. J. Vis. Exp. (87), e51358, doi:10.3791/51358 (2014).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Метаболита профилирования был ценным активом в изучении обмена веществ в норме и патологии. Тем не менее, современные платформы имеют различные лимитирующие факторы, такие как трудоемких образцов препаратов, низких пределов обнаружения, медленных скоростях сканирования, интенсивной оптимизации метода для каждого метаболита, и возможность измерения как положительно, так и отрицательно заряженных ионов в отдельных экспериментах. Таким образом, роман протокол метаболомика могли продвинуться Метаболомика исследования. Амид основе гидрофильные хроматографии позволяет полярный анализ метаболита без какой-либо химической производных. Высокое разрешение MS помощью Q-Exactive (QE-MS) улучшилась ионной оптики, увеличить скорость сканирования (256 мс при разрешении 70000), и имеет возможность проведения положительный / отрицательный переключение. Использование холодного стратегию извлечения метанола, и муфта столбец амидной с QE-МС позволяет надежное обнаружение 168 целевых полярных метаболитов и тысячами дополнительных особенностей одновременно. Датобработка осуществляется с помощью коммерчески доступного программного обеспечения в весьма эффективным способом, и неизвестные характеристики, извлеченные из масс-спектров, может быть получен в базах данных.

Introduction

Метаболомика, определенные в качестве эксперимента, который измеряет несколько метаболитов одновременно, был в районе интенсивных интерес. Метаболомика обеспечивает прямое считывание молекулярной физиологии и обеспечила понимание развития и заболевания, такие как рак 1-4. Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) и газовой хроматографии-масс-спектрометрии (ГХ-МС) являются одними из наиболее часто используемых инструментов 5-9. ЯМР, особенно был использован для потока экспериментов с тяжелым изотопом меченых соединений, таких как 13 C меченых метаболитов, являются ЯМР-активных 10,11. Однако, эта стратегия требует относительно высокой чистоты образца и большое количество образцов, что ограничивает ее применение в метаболомики. Между тем, данные, полученные от ЯМР необходим интенсивный анализ и соединение назначение сложных спектров ЯМР трудно. ГХ-МС широко используется для полярных метаболитов и липидов исследований, но она требует летучих compounспуск и поэтому часто дериватизация метаболитов, которая иногда включает сложную химию, что может занять много времени и вводит экспериментальную шум.

Жидкостной хроматографии (LC), соединенный с тройной квадрупольный масс-спектрометрии использует первый квадрупольные для выбора неповрежденные родительские ионы, которые затем фрагментированные во втором квадруполе, а третий квадрупольного используется для выбора характерные фрагменты или ионы дочь. Этот метод, который записывает переход от родительских ионов к конкретным дочерних ионов, называется несколько мониторинг реакции (MRM). MRM является очень чувствительным, специфической и надежный метод как для малых молекул и белков количественного 12-15,21. Тем не менее, MRM имеет свои ограничения. Для достижения высокой специфичностью метод МРМ должна быть построена для каждого метаболита. Этот метод состоит в идентификации конкретного фрагмента и соответствующая оптимизированная энергию удара, которая требует предварительной знание Недвижимrties из метаболитов, представляющих интерес, таких, как информация химической структуры. Таким образом, с некоторыми исключениями, связанных с нейтральной потерю общих фрагментов, это не возможно идентифицировать неизвестные метаболиты с этим методом.

В последние годы, масс-спектрометрия высокого разрешения (HRMS) инструменты были освобождены, таких как LTQ-Orbitrap и Exactive серии, в QuanTof и TripleTOF 5600 16-18,22. HRMS может обеспечить массы к заряду (m / z) интактных ионов с точностью в несколько частей на миллион. Поэтому HRMS инструмент работает путем обнаружения все ионы-предшественники (т.е. полный режим сканирования) могут получить прямой структурной информации из точной массы и, как следствие элементного состава анализируемого вещества, и эта информация может быть использована для выявления потенциальных метаболитов. В самом деле, вся информация о соединения могут быть получены с точной массе, до уровня структурных изомеров. Кроме того, полныйметод сканирования не требует предварительных знаний о метаболитов и не требует оптимизации метода. Более того, так как все ионы с м / з попадания в диапазоне сканирования могут быть проанализированы, HRMS имеет почти неограниченные возможности в плане количества метаболитов, которые могут быть количественно за один проход по сравнению с методом MRM. HRMS также сопоставимы с тройной квадруполь MRM в количественном мощности из-за короткого рабочего цикла, что приводит к сопоставимым количество точек данных, которые можно получить в полном MS сканирования. Поэтому HRMS предоставляет альтернативный подход для количественных метаболомики. Недавно улучшенная версия СУЛР называется Q-Exactive масс-спектрометрии (QE-МС) может работать под переключения между положительными и отрицательными мод с раз достаточно быстро циклов из одного метода, который расширяет диапазон обнаружения 19. Здесь мы опишем нашу стратегию метаболомики помощью QE-МС.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка LC-MS Реагенты, учреждении метод хроматографии, и создание инструмента оперативных процедур

  1. Подготовка LC растворителей
    1. Приготовления 500 мл подвижных фаз. 20 мМ ацетата аммония и 15 мМ гидроксида аммония в 3% ацетонитрил / вода, конечный рН 9,0; и B составляет 100% ацетонитрила.
    2. Свободно Закройте бутылку и поместите его на водяной бане ультразвуком, и разрушать ультразвуком в течение 10 мин без дополнительной системы отопления. (Этот шаг, чтобы гарантировать, что все аммонийные соли полностью растворить и что нет пузырьков остаточного воздуха.)
    3. Передача 250 мл растворителя на 250 мл стеклянной бутылке для ЖХ-МС использования, и держать остаток при 4 ° С.
  2. Приготовьте раствор калибровки низкого диапазона массы. Важно использовать индивидуальные области низких масса калибровочной смеси для применения метаболомики чтобы гарантировать, что точные массы обнаружены при низких молекулярных масс.
    1. Взвесьте 5 мг и Sodiфторацетатом мкм и гомованилиновой кислоты и растворить их в 5 мл воды, чтобы получить конечную концентрацию 1 мг / мл. Растворить диазинон в метаноле, чтобы получить конечную концентрацию 10 мг / мл.
    2. Для подготовки 1 мл отрицательной низкой калибровочного раствора масса, смешать 960 мл термо отрицательной калибровочного раствора с 20 мл fluoroaceate натрия и раствором гомованилиновой кислоты. Чтобы 1 мл положительной низкой калибровочного раствора масса, смешать 990 мл термо положительного решения калибровки и 10 мл диазинон решение. (Калибровочный раствор низкая масса должна храниться при температуре 4 ° С и быть готовым свежим каждые 2 месяца.)
  3. Калибровка QE-МС по низкой диапазон масс
    1. Перед выполнением калибровки низкий диапазон масс, проводить стандартный массовый калибровку (м / з, 150-2,000) в положительные и отрицательные режимов, основанных на инструкциями изготовителя.
    2. После того, как регулярная калибровка масса проходит, настроить диапазон сканирования для 60-900 т / г в панели управления прибороми источником CID 25 эВ для положительного режиме и 35 эВ для режима отрицательной применяется. (Это даст устойчивых сигналов иона фрагмента кофеина и сульфат-иона. Диапазон сканирования здесь фиксировано, потому что последний м / з не должно быть больше, чем 15x исходного м / з)
    3. После того, как источник ионов стабильно, то выполнить индивидуальную калибровку. Примечание: стабильный источник определяется как менее 10% от общего ионного тока вариации в положительном режиме, и менее 15% в отрицательном режиме. В индивидуальные ионы калибровки и соответствующий м / з приведены в таблице 1.
  4. Установите приборы LC-MS для полярной анализа метаболита. LC соединен с QE-МС для разделения метаболита и обнаружения.
    1. Оборудуйте QE-МС с подогревом электрораспылительной ионизационного электрода (H-ESI). Установите соответствующие параметры настройки для зонда, как указано: температуры нагревателя, 120 ° С; оболочка газа, 30; вспомогательный газ, 10; продувочного газа, 3; спрей напряжения, 3,6 кВ дляположительн. и 2,5 кВ для режима отрицательной. Установите температуру капилляров на 320 ° С и S-объектив на 55.
    2. Построить метод полной проверки следующим образом: Полный диапазон сканирования: от 60 до 900 (м / г); разрешение: 70000; Максимальное время впрыска: 200 мс с типичными времени впрыска вокруг 50 мс; автоматическая регулировка усиления (AGC): 3000000 ионы. Эти настройки привести к рабочим циклом около 550 мс для выполнения сканирования в обоих положительной и отрицательной режиме.
    3. Создание метода хроматографии. Применять столбец кислоты (100 х 2,1 мм ID, 3,5 мм) для разделения соединения при комнатной температуре 13,15. В качестве подвижной фазы, как описано выше, и мобильная фаза В является ацетонитрил. Используйте линейный градиент следующим образом: 0 мин, 85% Б; 1,5 мин, 85% В, 5,5 мин, 35% В; 10 мин, 35% B, 10,5 мин, 35% B, 14,5 мин, 35% В, 15 мин, 85% В и 20 мин, 85% B. расход 0,15 мл / мин от 0 до 10 мин и 15 до 20 мин и 0,3 мл / мин с 10,5 до 14,5 мин.

2. Preparation метаболита образцов

  1. Подготовка экстракции растворителем. Смешайте 40 мл метанола (ЖХ-МС класса) и 10 мл воды (ЖХ-МС класс) в 50 мл трубки, и держать его в -80 ° C морозильнике в течение по крайней мере 1 часа перед использованием. Примечание: Эта процедура и следующие шаги могут быть изменены по добыче биологической ткани и жидких образцах.
    1. Рак толстой кишки НСТ Культура 8 клеток в трех 10 см чашки или 6-луночных планшетах с полной среде для роста, RPMI 1640, дополненной 10% тепла инактивированной фетальной бычьей сыворотки и 100 000 единиц / л пенициллина и 100 мг / л стрептомицина.
    2. Когда клетки достигают 80% слияния, быстро удалить среды, и поместите блюдо или тарелку сверху сухим льдом 13,15. Добавить 1 мл экстракционного растворителя немедленно (80% метанол / вода), а также передавать пластину к -80 ° C морозильник. Для 10-см чашку, добавляют 3 мл экстракционного растворителя в каждую лунку. (Попробуйте снять среды как можно больше, чтобы избежать эффекта ионного подавления из-за остаточных солей из среды.)
    3. Оставьте пластину в течение 15 мин. Удалите ее из морозильника, и очистить клетки в растворителе на сухом льду. Передача раствора до 1,7 мл пробирки Эппендорфа и центрифуге со скоростью 20000 мкг при 4 ° С в течение 10 мин. (Подготовка клеток метаболиты из трех отдельных блюд, чтобы сделать три дублирующие образцы. Цель сохраняя две трубы, чтобы иметь один в качестве резервного.)
    4. Передача супернатант в двух новых Эппендорф, и высушите их в скорости вакууме. Это занимает около 3-6 ч в зависимости от скорости вакууме используется. (Образцы можно также сушили в течение ночи в атмосфере газообразного азота.)
    5. После сушки, хранения труб каждого образца в -80 ° C морозильник. Когда все готово, восстановить один образец в 20 мл воды (ЖХ-МС класса), и вводят в 5 мл LC-QE-МС для анализа.

3. Настройка Sample последовательности

  1. После калибровки образом осуществляется на QE-MS, уравновесить колонку LC в течение 5 мин с 85% A при скорости потокаСкорость 0,15 мл / мин, которая является исходным условием LC градиента.
  2. Настройте последовательности выборок в случайном порядке. Примечание: В этом смысле, это распределяет колебаний вносимые ЖХ-МС для каждого образца и обеспечивает более точное сравнение между различными образцами. Каждые 6 образцов, добавьте стирки серию, которая разделяет тот же метод MS, за исключением LC градиент 95% в течение 10 мин и затем колоночной уравновешивания 5 мин при 85% А с расходом 0,15 мл / мин. Добавить пустые образцы (100% воды) после каждого мытья перспективе оценить фон системы и перенести уровнях.
  3. Сохранить последовательность и как только колонна LC показывает стабильное давление около 400 фунтов на квадратный дюйм, начать работать последовательности. Если нет другой образец для запуска после этой последовательности, а затем добавить стоп перспективе в конце последовательности, имеющей скорость потока 0 мл / мин в конце градиента и выбрать "Standby" после окончания последовательность.
  4. Повторно запустить тот же набор образцов 12 ч после калибровки. (Это яс целью оценки колебания ошибке масса после калибровки.)

4. Сообщение Анализ Инструмент Очистка и обслуживание

  1. В конце последовательности, колонку промывают 95% A при скорости потока 0,2 мл / мин в течение 2 часов, а при необходимости, обратный колонку перед стиркой.
  2. Удалите столбец LC и непосредственно подключить LC для ионного источника с помощью союза. Подготовка очистки растворитель, вода / метанол / муравьиная кислота (об.: об: об 90:10:0.2), установленный MS в режиме ожидания, и система мыть ЖХ-МС при скорости потока 0,1 мл / мин в течение 1 ч, чтобы удалить остаточный осадок солей или других примесей. Опустите расход, если есть слишком много давления в системе.
  3. Установите температуру капилляров при 50 ° С, и снимите ионный клетку. Осторожно вынуть конус ионный развертки и ионный передачи трубку после того как температура капиллярной падает до 50 ° С. Использование грубую сетку, например, наждачной бумагой, чтобы удалить примеси, оставшиеся на поверхности конуса ион развертки.
  4. Поместите переноса ионовтрубка в 15 мл пробирку, содержащую Фалькон 10 мл 90% вода / метанол с 0,1% муравьиной кислоты. После обработки ультразвуком трубку на водяной бане для обработки ультразвуком в течение 20 мин, декантируют растворитель внутри, заменить его 10 мл чистого метанола и разрушать ультразвуком течение еще 20 мин. (При необходимости обработку ультразвуком может быть сделано при 40 ° С или даже более высокой температуре, чтобы достичь лучших результатов очистки.)

5. Анализ ЖХ-МС данные

  1. Для обеспечения последовательности выборок проходит гладко, после окончания первых двух образцов в последовательности, проверьте пики для неизвестных метаболитов. Используйте файл CSV список метаболитов имена, нейтральный химическую формулу и режим детектирования (положительное или отрицательное), в качестве входного файла и выходной файл содержит извлеченные пики и массовое ошибку в промилле. Если пик формы является ненормальным или ошибка масса выключен более чем на 5 частей на миллион, то остальная часть последовательности должна быть остановлена ​​и устранение неисправностей должно быть сделано.
  2. Выберите метод «пик выравниваниеи добыча рамка "на коммерчески доступного программного обеспечения. Выберите исходные данные из LC-MS и групповой них. Возьмите образцы в середине последовательности выполнения в качестве справочного хроматографии образца для пикового выравнивания. Загрузить семя кадра, содержащую известных метаболитов для целенаправленного анализа метаболитов с данными, собранными и соответствующего кадра семени.
  3. Выполнить анализ данных в положительной и отрицательной режиме отдельно. Используйте настройки по умолчанию для других параметров. Выключите функцию поиска базы данных и запустить рабочий процесс. Экспорт обработанных данных в качестве листа первенствовать, содержащей площадь пика каждого кадра. Первые наборы кадров соответствуют метаболитов в целевой список. Примечание: Для целенаправленного анализа метаболита, информация метаболиты получается на основе предыдущих исследований 13,15.
  4. Для нецелевого анализа метаболита, выбрать метод "добычи компонента". Загрузите пустые образцы для вычитания фона. Установите пик интенсивности порогт 10 5, ширина м / з из 10 частей на миллион и отношением сигнал-шум 3.
  5. Используйте базу данных человеческого метаболом для идентификации неизвестных соединений. Используйте CV фильтр для удаления компонентов с большими резюме в образцах повторных. Вручную пройти каждого компонента и выбрать тех, с четко определенной пика или относительно большой разницы в различных типах образцов для поиска в базе данных. Экспорт данных с хитами в базе данных. (Пик выравнивание может не появиться, если оценка пик выравнивание слишком низкая.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Точность данных метаболомики сильно зависит от производительности LC-QE-MS приборов. Чтобы оценить, насколько прибор работает в хорошем состоянии, и является ли метод применяется собственное, несколько известных метаболитов LC пики извлекаются из общей ионной хроматографии (TIC), как показано на рисунке 1. Полярные метаболиты, в том числе аминокислот, гликолиз промежуточные , TCA промежуточные, нуклеотиды, витамины, АТФ, НАДФ + и так далее имеют хорошее удержание на колонке и хорошо пиковых форм в столбце амидной в современных условиях LC. Между тем, анализ ошибок масса производится в течение 24 часов после низкой калибровки массового, как показано на рисунке 2. 6 различных концентраций образцов в трех экземплярах выполняются два раза после калибровки, и весь диапазон времени охватывает почти 24 часа в сутки. Масса ошибка оценивается путем сравнения обнаруженного M / Z к теоретическому т / г целевых метаболитов. Здесь целевые метаболиты имеют M / Zот 74 (глицин) в 744 (NADP +). Y оси здесь представляет накопительную процент метаболитов в течение определенного диапазона массы ошибок. Синяя кривая показывает результат от 0-12 ч, в то время как красный цвет Кривая показывает данные, полученные от 12-24 часов. Рисунок 2 ясно показывает, что более 90% метаболитов в течение 5 частей на миллион ошибки массового, что означает низкую массу диапазон калибровки метод, разработанный здесь достаточно для поддержания ошибку массовое 5 частей на миллион для низкого обнаружения диапазоне масс.

Другой вопрос, который необходимо решить, является чувствительность прибора с текущего метода и настройку прибора. Последовательный разбавление трех образцов с 10 см чашки Петри было сделано 5 раз коэффициент разбавления 6, в конечном итоге с 6 различных концентраций образцов. Эти образцы представляют собой сумму метаболитов, выделенных из 10 7, 1,67 х 10 6, 2,78 х 10 5, 4,63 х 10 4, 7,72 х 10 3 и 1,29· 10 3 клеток, соответственно. Поскольку каждый концентрация образца получают в трех экземплярах, в общей сложности 18 образцов анализируют в LC-QE-МС. Целевая список используется для оценки количества метаболитов, обнаруженных в течение различных концентрацию образца. Результат на рисунке 3 показывает, что оптимальное количество целевых метаболитов, обнаруженных составляет от 2,78 х 10 5 и 1,67 х 10 6 клеток, в то время как 1 х 10 7 клеток дают меньшее количество обнаруженных метаболитов, что связано с последствиями подавления ионов. Этот результат показывает, что оптимальное количество клеток для извлечения для этого анализа состоит в том, что примерно в лунку в 6-луночный планшет.

Для нецелевой анализа метаболитов, CV среза 20%, а среднее значение интенсивности 10 7 используются для фильтрации таблицы компонентов. Эти жесткие CV и средней интенсивности пороговые значения используются для этого демонстрационного цели. Для улучшения воспроизводимости, значения CV отсечки может бытьувеличивается (например, 30%) в то время как средние значения интенсивности должны быть уменьшено (например, 10 5), чтобы включить больше пиков. После ручной проверки пики, компоненты с хорошими формами выбираются и искали в базе данных человека метаболом. Результаты показаны в таблице 2. Таблица 2А показывает результаты из данных, собранных в положительном режиме, а в таблице 2B показаны результаты отрицательных ионов. Некоторые из метаболитов, определенных здесь перекрываются с метаболитов в целевой список, такие как глутатион, пролина и так далее, но в то время, дополнительные метаболиты которых нет в списке целевых рассматриваются, например, methyglyoxal, который может быть получен из гликолиза и один -пальмитоил-2-олеоил-Sn-глицеро-3-фосфохолин, который обнаруживается в положительном с временем удерживания 3,2 мин, что разумный удерживания для фосфолипидов на колонке с амидной. Протокол о нецелевого поиска метаболит базы данных был пр.eviously сообщили 20.

Рисунок 1
Рисунок 1. Примеры LC-MS хроматографии пиков. Здесь восстановленное генерируется хроматографии с масс окна 10 частей на миллион (м / з ± 5 частей на миллион). Ось Х показывает время удерживания, а ось Y показывает относительную интенсивность, и пиковая интенсивность котируются выше всякого метаболита. Показывает пики, обнаруженные из положительном режиме, в то время как B показывает пики из режима отрицательной. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 2
Рисунок 2. 60;. Оценка калибровки нижнего диапазона масс Ось Y является совокупный процент метаболитов с ошибкой обнаружения масса в 5 частей на миллион. Ось Х является диапазон ошибки масса в промилле. Синий и красный кривые 0-12 ч и 12-24 ч соответственно. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 3
Рисунок 3. Оценка количества образца -. Число целевых метаболитов, обнаруженных в сравнении количества НСТ 8 клеток Красные квадраты представляют метаболиты, обнаруженные в положительном режиме, синие круги означает метаболитов, измеренные в отрицательной режиме, и черные треугольники являются общее число метаболитов от обоих положительные и отрицательные режим. Ось X показывает количество HCT 8 клеток.upload/51358/51358fig3highres.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

<TD> Н.А.
Стандарты M / Z, положительная режим M / Z, отрицательный режим Обычный формула Обычный масса
н-бутиламин 74.096425 Не Доступно C 4 H 11 N 73.089149
Кофеин фрагмент 138.066188 Не Доступно C 6 H 8 N 3 O 137.058912
Кофеин 195.087652 Не Доступно C 8 H 11 N 4 O 2 194.080376
Диазинон 305.108329 Не Доступно C 12 H 20 N 2 O 3 PS 304.101053
MRFA пептид 524.264966 C 23 H 37 N 7 O 5 S 523,25769
Фторацетат N / A 77.004432 С 2 Н 3 FO 2 78.011708
Сульфат N / A 96.960106 H 2 SO 4 97.967382
Гомованилиновой кислоты N / A 181.050634 C 9 H 10 O 4 182,05791
Додецилсульфата N / A 265.147906 C 12 H 26 SO 4 266.155182
Таурохолат N / A 514.2844 С 26 Н 45 NO 7 S 515.291676

Таблица 1. Низкий уровень калибровки диапазона масс и их точное м / з.

<TD> 131,05901
CSID Название Формула Моноизотопных Масса Поиск месса Ошибка (м.д.) RT (мин)
234 бета-аланин С 3 H 7 NO 2 89,04800 89,04805 0.62 8.08
1057 Саркозин С 3 H 7 NO 2 89,04768 89,04805 4.22 8.08
5735 аланин С 3 H 7 NO 2 89,04768 89,04805 4.22 8.08
568 Креатинин C 4 H 7 N 3 O 113,05900 113,05889 1.00 4.41
128566 Proline C 5 H 9 NO 2 115,06333 115,06338 0.41 7.54
6050 L-(+)-валин C 5 H 11 NO 2 117,07898 117,07896 0.18 7.42
7762 Амилнитрит Я C 5 H 11 NO 2 117,07898 117,07896 0.18 7.42
135 5-амино валериановой кислоты C 5 H 11 NO 2 117,07900 117,07896 0,38 7.42
242 триметилглицин C 5 H 11 NO 2 117,07900 117,07896 0,38 7.42
911 Ниацинамид C6H6N2O 122,04800 122,04793 0.55 2.60
1091 Таурин C 2 H 7 NO 3 S 125,01466 125,01469 0,20 7.61
1030 Пирролина гидроксикарбоновая кислота C 5 H 7 NO 3 129,04259 129,04259 0.02 8.51
7127 СПС C 5 H 7 NO 3 129,04259 129,04259 0.02 8.51
90657 N-Acryloylglycine C 5 H 7 NO 3 129,04259 129,04259 0.02 8.51
388752 5-оксо-D-пролин C 5 H 7 NO 3 129,04259 129,04259 0.02 8.51
389257 3-гидрокси-3 ,4-дигидро-2Н-пиррол-5-карбоновой кислоты C 5 H 7 NO 3 129,04259 129,04259 0.02 8.51
8031176 Pyrrolidonecarboxylic кислоты C 5 H 7 NO 3 129,04259 129,04259 0.03 8.51
5605 Гидроксипролин C 5 H 9 NO 3 131,05824 131,05901 5.83 8.08
7068 N-Acetylalanin C 5 H 9 NO 3 131,05824 5.83 8.08
79449 Ac-Ala-OH C 5 H 9 NO 3 131,05824 131,05901 5.83 8.08
89122 Ethylformylglycine C 5 H 9 NO 3 131,05824 131,05901 5.83 8.08
167744 л-глутаминовая-гамма-полуальдегида C 5 H 9 NO 3 131,05824 131,05901 5.83 8.08
388519 5-Амино-2-оксопентановой кислоты C 5 H 9 NO 3 131,05824 131,05901 5.83 8.08
134 Аминолевулиновой кислоты C 5 H 9 NO 3 131,05800 131,05901 </ TD> 7.70 8.08
9312313 3-гидрокси-L-пролина C 5 H 9 NO 3 131,05800 131,05901 7.70 8.08
566 Креатин C 4 H 9 N 3 O 2 131,06900 131,06905 0.36 8.08
5880 L-(+)-лейцин C 6 H 13 NO 2 131,09464 131,09455 0.68 6.96
6067 L-(+)-изолейцин C 6 H 13 NO 2 131,09464 131,09455 0.68 6.96
19964 L-норлейцин C 6 H 13 NO 2 131,09464 131,09455 0.68 6.96 </ TD>
388796 бета-лейцин C 6 H 13 NO 2 131,09464 131,09455 0.68 6.96
548 Кислота аминокапроновая C 6 H 13 NO 2 131,09500 131,09455 3.48 6.96
6031 L-(-)-аспарагин C 4 H 8 N 2 O 3 132,05350 132,05348 0.10 8.31
109 Ureidopropionic кислоты C 4 H 8 N 2 O 3 132,05299 132,05348 3.71 8.31
6026 L-орнитин C 5 H 12 N 2 O 2 132,08987 132,08988 0.02 10.37
64236 D-орнитин C 5 H 12 N 2 O 2 132,08987 132,08988 0.02 10.37
5746 Глутамин C 5 H 10 N 2 O 3 146,06914 146,06900 0.93 8.25
128633 Д-Глютамин C 5 H 10 N 2 O 3 146,06914 146,06900 0.93 8.25
141172 Ureidoisobutyric кислоты C 5 H 10 N 2 O 3 146,06914 146,06900 0.93 8.25
21436 N-метил-D <scp> </ SCP>-аспарагиновой кислоты C 5 H 9 NO 4 147,05316 147.05300 1.13 8.06
21814 D-(-)-глутаминовой кислоты C 5 H 9 NO 4 147,05316 147,05300 1.13 8.06
30572 L-(+)-глутаминовой кислоты C 5 H 9 NO 4 147,05316 147,05300 1.13 8.06
58744 N-ацетил-L-серин C 5 H 9 NO 4 147,05316 147,05300 1.13 8.06
5907 L-(-)-метионин C 5 H 11 NO 2 S 149,05106 149,05095 0,70 7.39
6038 Гистидин С 6 Н 9 N 3 O 2 155,06947 155,06940 0.48 8.33
5910 L-(-)-фенилаланин C 9 H 11 NO 2 165,07898 165,07887 0.63 6.60
1025 Пиридоксин C 8 H 11 NO 3 169,07390 169,07376 0.80 3.24
4463 Oxidopamine [USAN: ИНН] C 8 H 11 NO 3 169,07390 169,07376 0.80 3.24
102750 5 - (2-аминоэтил)-Пирогаллол C 8 H 11 NO 3 169,07390 169,07376 0.80 3.24
388394 Норадреналин C 8 H 11 NO 3 169,07390 169,07376 0.80 3.24
6082 L-(+)-аргинин C 6 H 14 N 4 O 2 174,11168 174,11144 1.39 10.77
64224 D-Arg C 6 H 14 N 4 O 2 174,11168 174,11144 1.39 10.77
780 гетероауксина C 10 H 9 NO 2 175,06300 175,06304 0.18 2.32
67261 Индол-3-ацетальдегид, 5-гидрокси- C 10 H 9 NO 2 175,06332 175,06304 1.65 2.32
3574185 Индол-2-уксусной кислоты C 10 H 9 NO 2 175,06332 175,06304 1.65 2.32
5833 L-(-)-тирозин C 9 H 11 NO 3 181,07390 181,07378 0.66 7.48
389285 3-Амино-3-(4-гидроксифенил) пропановой кислоты C 9 H 11 NO 3 181,07390 181,07378 0.66 7.48
13628311 L-трео-3-фенилсерина C 9 H 11 NO 3 181,07390 181,07378 0.66 7.48
425 4-гидрокси-4-(3-пиридил) бутановой кислоты C 9 H 11 NO 3 181,07401 181,07378 1.25 7.48
13899 3 - (1Н-индол-3-ил) акриловой кислоты C 11 H 9 NO 2 187,06332 187,06330 0.15 6.44
10607876 Индолакриловой кислоты C 11 H 9 NO 2 187,06332 187,06330 0.15 6.44
389120 N6, N6, N6-триметил-L-лизин C 9 H 20 N 2 O 2 188,15248 188,15221 1.45 10.87
388321 5 "-S-метил-5"-thioadenosine C 11 H 15 N 5 O 3 S 297,08957 297,08898 2.00 2.56
144 9 - (5-S-метил-5-thiopentofuranosyl)-9Н-пурин-6-амин C 11 H 15 N 5 O 3 S 297,09000 297,08898 3.43 2.56
111188 Глутатион С 10H 17 N 3 O 6 S 307,08380 307,08345 1.14 8.02

Таблица 2А.

5 H 9 NO 3 11 H 19 NO 9
CSID Название Формула Моноизотопных Масса Поиск месса Ошибка (м.д.) RT (мин)
857 Метилглиоксаль С 3 Н 4 О 2 72,02100 72,02108 1.03 7.70
1057 Саркозин С 3 H 7 NO 2 89,04768 89,04747 2.33 8.19
5735 аланин С 3 H 7 NO 2 89,04768 89,04747 2.33 8.19
234 бета-аланин С 3 H 7 NO 2 89,04800 89,04747 5.93 8.19
55423 R-молочной кислоты С 3 Н 6 О 3 90,03169 90,03143 2.91 5.12
61460 Гидроксипропионовой кислоты С 3 Н 6 О 3 90,03169 90,03143 2.91 5.12
96860 L-(+)-молочной кислоты С 3 Н 6 О 3 90,03169 90,03143 2.91 5.12
592 Молочная кислота С 3 Н 6 О 3 90,03200 90,03143 6.29 5.12
650 Дигидроксиацетон С 3 Н 6 О 3 90,03200 90,03143 6.29 5.12
731 Глицеральдегид С 3 Н 6 О 3 90,03200 90,03143 6.29 5.12
1086 Серная кислота H 2 O 4 S 97,96738 97,96683 5.63 8.13
128566 Proline C 5 H 9 NO 2 115,06333 115,06302 2.67 7.78
1078 Янтарная кислота C 4 H 6 O 4 118,02661 118,02630 2.66 7.72
466979 Erythrono-1 ,4-лактон С4 H 6 O 4 118,02661 118,02630 2.66 7.72
4483398 Д-Erythronic г-лактон C 4 H 6 O 4 118,02661 118,02630 2.66 7.72
473 Метилмалоновая кислота C 4 H 6 O 4 118,02700 118,02630 5.96 7.72
8527138 (3S, 4R) -3,4-Dihydroxydihydrofuran-2 (3H)-он C 4 H 6 O 4 118,02700 118,02630 5.96 7.72
140384 2-ketocaproic кислоты C 6 H 10 O 3 130,06299 130,06270 2.24 2.35
164251 Methyloxovaleric кислоты C 6 H 10 O 3 130,06299 130,06270 2.24 2.35
388419 (3S)-3-метил-2-оксопентановой кислоты C 6 H 10 O 3 130,06299 130,06270 2.24 2.35
15642233 Ketoleucine C 6 H 10 O 3 130,06299 130,06270 2.24 2.35
46 -оксо-B-метилвалериановой кислоты C 6 H 10 O 3 130,06300 130,06270 2.36 2.35
69 Альфа-ketoisocaproic кислоты C 6 H 10 O 3 130,06300 130,06270 2.36 2.35
134 Аминолевулиновой кислоты 131,05800 131,05795 0.36 8.19
9312313 3-гидрокси-L-пролина C 5 H 9 NO 3 131,05800 131,05795 0.36 8.19
5605 Гидроксипролин C 5 H 9 NO 3 131,05824 131,05795 2.23 8.19
7068 N-Acetylalanin C 5 H 9 NO 3 131,05824 131,05795 2.23 8.19
79449 Ac-Ala-OH C 5 H 9 NO 3 131,05824 131,05795 2.23 8.19
89122 Ethylformylglycine C 5 H 9 NO 3 131,05824 131,05795 2.23 8.19
167744 л-глутаминовая-гамма-полуальдегида C 5 H 9 NO 3 131,05824 131,05795 2.23 8.19
388519 5-Амино-2-оксопентановой кислоты C 5 H 9 NO 3 131,05824 131,05795 2.23 8.19
5880 L-(+)-лейцин C 6 H 13 NO 2 131,09464 131,09419 3.39 7.09
6067 L-(+)-изолейцин C 6 H 13 NO 2 131,09464 131,09419 3.39 7.09
19964 L-норлейцин C 6 H 13 NO 2 131,09464 131,09419 3.39 7.09
388796 бета-лейцин C 6 H 13 NO 2 131,09464 131,09419 3.39 7.09
548 Кислота аминокапроновая C 6 H 13 NO 2 131,09500 131,09419 6.18 7.09
109 Ureidopropionic кислоты C 4 H 8 N 2 O 3 132,05299 132,05321 1.60 8.28
6031 L-(-)-аспарагин C 4 H 8 N 2 O 3 132,05350 132,05321 2.21 8.28
6026 L-орнитин C 5 H 12 N 2 O 2 132,08987 132,08961 1.98 10.36
64236 D-орнитин C 5 H 12 N 2 O 2 132,08987 132,08961 1.98 10.36
193317 L-(-)-Яблочная кислота C 4 H 6 O 5 134,02153 134,02130 1.72 7.95
510 (±)-яблочная кислота C 4 H 6 O 5 134,02200 134,02130 5.25 7.95
133224 треониновой кислоты C 4 H 8 O 5 136,03717 136,03688 2.14 7.70
388628 2,3,4-Trihydroxybutanoic кислоты C 4 H 8 O 5 136,03717 136,03688 2.14 7.70
2061231 DL-erythronic кислоты C 4 H 8 O 5 136,03717 136,03688 2.14 7.70
21436 N-метил-D <scp> </ SCP>-аспарагиновой кислоты C 5 H 9 NO 4 147,05316 147,05299 1.16 8.05
21814 D-(-)-глутаминовой кислоты C 5 H 9 NO 4 147,05316 147,05299 1.16 8.05
30572 L-(+)-глутаминовой кислоты C 5 H 9 NO 4 147,05316 147,05299 1.16 8.05
58744 N-ацетил-L-серин C 5 H 9 NO 4 147.05316 147,05299 1.16 8.05
6038 Гистидин С 6 Н 9 N 3 O 2 155,06947 155,06930 1.09 8.36
199 Аллантоин C 4 H 6 N 4 O 3 158,04401 158,04387 0,88 4.76
6082 L-(+)-аргинин C 6 H 14 N 4 O 2 174,11168 174,11154 0.80 10.76
64224 D-Arg C 6 H 14 N 4 O 2 174,11168 174,11154 0.80 10.76
58576 N-ацетил-L-аспарагиновой кислоты С 6 Н 9 NO 5 175,04807 175,04803 0.18 7.87
996 Пирофосфорной кислоты Н 4 О 7 P 2 177,94299 177,94331 1.79 8.42
5589 Глюкоза C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0.41 7.53
17893 Манноза C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0.41 7.53
58238 . B-D-глюкопиранозы C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0.41 7.53
71358 . Альфа-D-глюкопиранозы C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0.41 7.53
134838 3-дезокси-арабино-hexonic кислота C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0.41 7.53
388332 L-Sorbopyranose C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0.41 7.53
388476 бета-D-галактопиранозы C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0.41 7.53
388480 . Альфа-D-галактопиранозы C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0.41 7.53
388775 бета-D-Fructofuranose C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0.41 7.53
10239179 Инозит C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0.41 7.53
16736992 Цис-инозитол C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0.41 7.53
17216070 аллозы C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0.41 7.53
17216093 L-сорбозы C 6 H 12 O 6 180,06339 180,06346 0.41 7.53
201 hexopyranose C 6 H 12 O 6 180,06300 180,06346 2.53 7.53
868 1,2,3,4,5,6-Cyclohexanhexol C 6 H 12 O 6 180,06300 180,06346 2.53 7.53
2068 Теофиллин С 7 Н 8 N 4 O 2 180,06473 180,06346 7.04 7.53
4525 1,7-диметил-ксантин С 7 Н 8 N 4 O 2 180,06473 180,06346 7.04 7.53
5236 Теобромин С 7 Н 8 N 4 O 2 180,06473 180,06346 7.04 7.53
1161 изолимонная кислота C 6 H 8 O 7 192,02701 192,02704 0.15 8.18
305 Ciокислов азота C 6 H 8 O 7 192,02699 192,02704 0.23 8.18
963 пантотеновая кислота C 9 H 17 NO 5 219,11067 219,11049 0.84 6.72
6361 D-пантотеновая кислота C 9 H 17 NO 5 219,11067 219,11049 0.84 6.72
960 пальмитиновая кислота C 16 H 32 O 2 256,23999 256,24000 0.05 1.73
111188 Глутатион C 10 H 17 N 3 O 6 S 307,08380 307,08339 1.35 8.03
388337 N-ацетилнейраминовую кислоту 309,10599 309,10585 0.45 7.43
392681 N-ацетил-альфа-нейраминовой кислоты C 11 H 19 NO 9 309,10599 309,10585 0.45 7.43
392810 Сиаловая кислота Neu5Ac C 11 H 19 NO 9 309,10599 309,10585 0.45 7.43

Таблица 2В.

. Таблица 2 Список нецелевых метаболитов, обнаруженных в НСТ 8 ячеек (2,78 х 10 5 клеток эквивалентности) Таблица 2А и 2В включают компоненты извлечение информации:. Время удержания, M / Z и массовое ошибку, а тем временем результаты поиска базы данных: ChemSpider ID ( CSID), имя, формула, и так далее. Вот образцы анализируемые уравнениел до метаболитов, выделенных из 2,78 х 10 5 клеток, и порог интенсивности 1 х 10 7, чтобы избежать утомительной результат для демонстрации цели.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Наиболее важные шаги для успешного профилирования метаболита в клетки, используя этот протокол, являются: 1) контроль за питательную среду и тщательного извлечение клеток; 2) доведение метод LC основана на MS установки метода чтобы у пассажиров было достаточно (обычно не менее 10) точек данных через пика для количественного; 3) делать калибровку низкую массовую перед запуском образцов; 4) введение не более 5 мл, чтобы избежать время удерживания сдвига и уширение пика под воздействием воды; и 5) подготовки и проведения образцы для сравнения в той же партии, чтобы минимизировать командные эффекты.

Стандарты (табл. 1) Здесь выбирается для калибровки низким диапазоне масс являются взаимозаменяемыми. Любое известное соединение с т / г, который попадает в диапазоне масс сканирования, хорошо ведет себя в источнике H-ESI, и растворим в воде, метаноле или ацетонитриле разумные кандидаты на калибровочных стандартов. Настоятельно рекомендуется хранить все калибровочные растворы Ат 4 ° C, чтобы стабилизировать кофеин, а также свести к минимуму испарение метанола или ацетонитрила в калибровочного раствора таким образом, что производительность калибровка может быть более воспроизводимым. По сравнению с регулярным диапазоне масс, м / г от 150 до 2000, калибровки низкий диапазон масс должно быть сделано более часто, по крайней мере, раз в два дня.

Этот рабочий процесс, из экстракционного растворителя, восстанавливающей растворителя, LC подвижной фазы, низкой калибровки диапазона массы и MS сканировать диапазон был оптимизирован для измерения полярных метаболитов. Это включает в себя аминокислоты, ацетил аминокислот, гликолизного пути промежуточные нуклеозиды, промежуточные ЦТК, некоторые один углерода метаболизм тропа промежуточных и так далее. Тем не менее, модификации этого протокола для других классов метаболитов, таких как коэнзим А (ПС) видов, фолатов, фосфолипиды возможны. Например, CoAs более стабильны в кислых условиях, так что добавление кислоты к 80% метанол / вода будет полезно импЧувствительность рыщут КоА. Кроме того, CoAs и липидов, как правило, имеют гораздо большие молекулярные массы, при этом частота сканирования м / з должна быть скорректирована с 60-900 до надлежащего диапазона, который будет охватывать те метаболиты.

Даже если некоторые из нецелевых результатах поиска базы данных компонент пересекаться с целевой список, он по-прежнему важно, чтобы построить этот целевой список, основанный на исследовании приоритетом. Так как метаболиты в целевом списке ниже, чем в среднем порога интенсивности, информация об этих метаболитов будет удален в процессе обработки. Целевая список включает в себя информацию удерживающую времени, что дает нам более высокую уверенность в идентификации метаболита и количественного. Еще одним преимуществом с установкой QE-MS является то, что тандемной масс-спектрометрии может позволить для дальнейшей идентификации метаболитов.

Один вопрос, связанный с этим рабочим процессом является то, что игла вставлены H-ESIRT чувствительна к содержанию солей в образцах, так как чувствительность этом случае будет ограничена, если есть высокие количества нелетучих солей. Таким образом, сводя к минимуму содержание соли из образцов, и обычной очистки колонны и иглы вставки H-ESI будет полезно для обеспечения данных хорошего качества и увеличить срок службы столбца.

Таким образом, этот протокол использует LC-QE-МС успешно анализировать полярные метаболиты из культивируемых клеток, с минимальными шагов пробоподготовки и быстрого сбора данных. Малые изменения в пробоподготовки может быть осуществлена, чтобы получить данные из других биологических источников, таких как сыворотке и ткани. Например, так как чистый метанол может быть добавлен к жидкой сыворотки добавлены, чтобы сделать конечную концентрацию метанола до 80% для полярного экстракции метаболитов. Для образцов ткани, строгий перемешивание и смешивание требуется для достижения большей эффективности экстракции. Обычно 10 мл сыворотки или1 мг ткани является достаточным для анализа метаболитов. Исходные данные могут быть проанализированы как в целевой режиме, если существуют известные метаболиты в образцах, и в не-целенаправленно с последующим поиска по базе данных HRMS. На основе HRMS метаболомика все еще находится на ранних стадиях. Для будущих достижений, экспериментальные методы можно дополнительно оптимизировать, дополнительная информация метаболитов HRMS и узоры фрагментации MS / MS будет полезным и соответствующие алгоритмы, такие как пик выравнивание, пик интеграции, изотопов кластеризации и так далее, может улучшить эффективность и точность обработки данных. В конечном счете, однако, многие из вопросов, которые наши лабораторные адреса в метаболизме которые ограничены осторожной интерпретации данных после обработки. С помощью этих крупномасштабных методов метаболомики, мы часто ограничены нашей интерпретации данных и оценки гипотез, порожденных. Таким образом, все метаболомики эксперименты нужно быть сформулированы вокруг конкретных вопросов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют никакого конфликта интересов.

Acknowledgements

Авторы хотели бы выразить признательность Detlef Шумана, Дженнифер Саттон (Thermo Fisher Scientific) и Натаниэль Снайдер (Университет Пенсильвании) за ценные обсуждения на массового калибровки и обработки данных. Исследования сообщили в настоящей публикации при поддержке Национального института рака из Национального института здоровья в рамках премии Количество R00CA168997. Содержание является исключительной прерогативой авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института здравоохранения.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Positive calibration mix Thermo Scientific #88323 It is light sensitive. Store at 4 °C
Negative calibration mix Thermo Scientific #88324 Store at 4 °C
Diazinon Sant Cruz Biotechnology #C0413 It causes eyes irritation, so work in hood. Store at 4 °C
H-ESI needle insert Fisher Scientific #1303200 This could be replaced or cleaned with 5% formic acid/water (remove rubber ring) if clogged.
Xbridge amide column Waters #186004860 Guard column is recommend to increase column lifetime.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fiehn, O. Combining genomics, metabolome analysis, and biochemical modelling to understand metabolic networks. Comparative and Functional Genomics. 2, (3), 155-168 (2001).
  2. Mulleder, M., et al. A prototrophic deletion mutant collection for yeast metabolomics and systems biology. Nature Biotechnology. 30, (12), 1176-1178 (2012).
  3. Patel, V. R., Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P., Baldi, P. CircadiOmics: Integrating circadian genomics, transcriptomics, proteomics and metabolomics. Nature Methods. 9, (8), 772-773 (2012).
  4. Ideker, T., et al. Integrated genomic and proteomic analyses of a systematically perturbed metabolic network. Science. 292, (5518), 929-934 (2001).
  5. Jonsson, P., et al. A strategy for identifying differences in large series of metabolomic samples analyzed by GC/MS. Analytical Chemistry. 76, (6), 1738-1745 (2004).
  6. Jonsson, P., et al. High-throughput data analysis for detecting and identifying differences between samples in GC/MS-based metabolomic analyses. Analytical Chemistry. 77, (17), 5635-5642 (2005).
  7. Weljie, A. M., Newton, J., Mercier, P., Carlson, E., Slupsky, C. M. Targeted profiling: Quantitative analysis of 1H NMR metabolomics data. Analytical Chemistry. 78, (13), 4430-4442 (2006).
  8. Wiklund, S., et al. Visualization of GC/TOF-MS-based metabolomics data for identification of biochemically interesting compounds using OPLS class models. Analytical Chemistry. 80, (1), 115-122 (2008).
  9. Xia, J., Bjorndahl, T. C., Tang, P., Wishart, D. S. MetaboMiner--semi-automated identification of metabolites from 2D NMR spectra of complex biofluids. BMC Bioinformatics. 9, 507 (2008).
  10. Lu, D., et al. 13C NMR isotopomer analysis reveals a connection between pyruvate cycling and glucose-stimulated insulin secretion (GSIS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, (5), 2708-2713 (2002).
  11. Shen, J., et al. Determination of the rate of the glutamate/glutamine cycle in the human brain b. in vivo 13C NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, (14), 8235-8240 (1999).
  12. Kitteringham, N. R., Jenkins, R. E., Lane, C. S., Elliott, V. L., Park, B. K. Multiple reaction monitoring for quantitative biomarker analysis in proteomics and metabolomics. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877, (13), 1229-1239 (2009).
  13. Locasale, J. W., et al. Metabolomics of human cerebrospinal fluid identifies signatures of malignant glioma. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11, (6), 10-1074 (2012).
  14. Wolf-Yadlin, A., Hautaniemi, S., Lauffenburger, D. A., White, F. M. Multiple reaction monitoring for robust quantitative proteomic analysis of cellular signaling networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, (14), 5860-5865 (2007).
  15. Yuan, M., Breitkopf, S. B., Yang, X., Asara, J. M. A positive/negative ion-switching, targeted mass spectrometry-based metabolomics platform for bodily fluids, cells, and fresh and fixed tissue. Nature Protocols. 7, (5), 872-881 (2012).
  16. Ramanathan, R., et al. It is time for a paradigm shift in drug discovery bioanalysis: From SRM to HRMS. Journal of Mass Spectrometry : JM. 46, (6), 595-601 (2011).
  17. Lu, W., Clasquin, M. F., Melamud, E., Amador-Noguez, D., Caudy, A. A., Rabinowitz, J. D. Metabolomic analysis via reversed-phase ion-pairing liquid chromatography coupled to a stand alone orbitrap mass spectrometer. Analytical Chemistry. 82, (8), 3212-3221 (2010).
  18. Michalski, A., et al. Ultra high resolution linear ion trap orbitrap mass spectrometer (orbitrap elite) facilitates top down LC MS/MS and versatile peptide fragmentation modes. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11, (3), 10-1074 (2012).
  19. Michalski, A., et al. Mass spectrometry-based proteomics using Q exactive, a high-performance benchtop quadrupole orbitrap mass spectrometer. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 10, (9), (2011).
  20. Snyder, N. W., Khezam, M., Mesaros, C. A., Worth, A., Blair, I. A. Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry. UPLC-HRMS). J. Vis. Exp. (75), (2013).
  21. Gika, H. G., Theodoridis, G. A., Wingate, J. E., Wilson, I. D. Within-day reproducibility of an HPLC-MS-based method for metabonomic analysis: Application to human urine. Journal of Proteome Research. 6, (8), 3291-3303 (2007).
  22. Want, E. J., et al. Global metabolic profiling procedures for urine using UPLC-MS. Nature Protocols. 5, (6), 1005-1018 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats