敏感,大规模定量代谢组学的策略

1Division of Nutritional Sciences, Cornell University, 2Field of Biochemistry, and Molecular Cell Biology, Cornell University
Published 5/27/2014
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Biology

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Summary

代谢产物分析一直是宝贵的资产在代谢在健康和疾病的研究。利用正常阶段的液相色谱和高分辨率质谱与极性切换和快速的工作周期,我们描述了一个协议分析生物材料,具有灵敏度高,准确度和分辨率的极性代谢成分。

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Liu, X., Ser, Z., Cluntun, A. A., Mentch, S. J., Locasale, J. W. A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics. J. Vis. Exp. (87), e51358, doi:10.3791/51358 (2014).

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Abstract

代谢产物分析一直是宝贵的资产在代谢在健康和疾病的研究。然而,当前的平台上有不同的限制因素,如劳动密集型样品制剂,低检测限,扫描速度很慢,对于每种代谢物密集的方法优化,以及无法积极地同时测量和在单一实验中带负电荷的离子。因此,一种新的代谢协议可以促进代谢组学研究。基于酰胺的亲水色谱法使极性代谢物的分析,而无需任何化学衍生。高分辨质谱使用Q-Exactive(QE-MS)有所改善离子光学系统,提高了扫描速度(256毫秒的分辨率70,000),并具有进行正/负切换的能力。使用冷甲醇提取策略,并与耦合QE-MS酰胺色谱柱能够稳健检测168有针对性的极性代谢物的附加功能和成千上万的同时进行。 DAT的处理是用市售的软件在一个高度有效的方法,并从质谱图中提取未知功能可以在数据库中进行查询。

Introduction

代谢组学,定义为同时测量多个代谢物的试验,一直是激烈感兴趣的领域。代谢组学提供了分子生理学的一个直接读出,并提供了见解发育和疾病如癌症1-4。核磁共振(NMR)和气相色谱-质谱(GC-MS)是最常用的工具5-9之间。 NMR,尤其是已自重同位素标记的化合物,如13 C标记的代谢物用于通量的实验中,都NMR-活性10,11。然而,这种策略要求比较高的样品纯度和大样本量,这限制了它的应用代谢组学。同时,从核磁共振收集的数据密集型需求分析和复杂的NMR谱复合赋值是困难的。 GC-MS已广泛用于极性代谢物和脂质的研究,但它需要的挥发性化合物 -ds和因此往往衍生的代谢物,这有时会涉及复杂的化学反应,可以是耗时的,并引入实验噪音。

液相色谱(LC),耦合到三重四极杆质谱法使用第一个四极杆选择的完整母离子,然后将其分段中的第二四极,而第三个四极杆被用来选择特征的片段或子离子。该方法中,其中记录了从母体离子,以特定的子离子的过渡,被称为多反应监测(MRM)。 MRM是为小分子和蛋白质定量12-15,21非常敏感,特异,可靠的方法。然而,MRM也有其局限性。为了实现高特异性的MRM方法需要为每个代谢物兴建。该方法包括确定一个特定的片段和相应的最佳碰撞能量,这就要求PROPE的预先知识感兴趣的代谢物,如化学结构信息的rties。因此,与同一片段的中性丢失一些例外,它是不可能的,以确定未知代谢物与该方法。

在最近几年,高分辨率质谱(HRMS)的仪器已被释放,如LTQ-轨道阱和Exactive系列,QuanTof技术,和的TripleTOF 5600 16-18,22。 HRMS可以提供​​质量到几个ppm的误差内充完好离子的比(m / z)表示。因此,通过检测所有的前体离子( 全扫描模式)操作的HRMS的仪器可以从精确质量和分析物所产生的元素组成直接获得的结构信息,并且该信息可用于确定潜在的代谢物。确实,可以用一个精确质量来获得关于一种化合物的所有信息,至多结构异构体的水平。此外,全扫描方法不需要的代谢产物以前的知识,也不需要方法的优化。此外,由于m / z为落入扫描范围的所有离子进行分析,HRMS具有几乎无限的容量可量化在单次运行相比,MRM方法代谢物的数量而言。人力资源管理系统也相当于定量容量的三重四极杆MRM由于短的工作周期造成的,可以在一个完整的MS将扫描获得的数据点的数量相媲美。因此,人力资源管理系统提供了定量的代谢组学的另一种方法。近日,人力资源管理系统的改进版本称为Q-Exactive质谱(QE-MS)可以足够快的周期正,负模式在一个单一的方法,扩大了检测范围19之间的切换下操作。在这里,我们将介绍使用的QE-MS代谢组学我们的策略。

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Protocol

1,准备LC-MS试剂,建立一个色谱法,并建立仪器操作规程

  1. 液相色谱溶剂的制备
    1. 制备500mL的流动相。 A为20mM的醋酸铵和15mM的氢氧化铵的3%乙腈/水,最终pH为9.0;和B为100%乙腈。
    2. 松散帽的瓶子,把它放在水浴超声仪,超声10分钟,无需额外加热。 (此步骤是为了确保所有的铵盐的完全溶解和不存在残留气泡。)
    3. 转让250毫升溶剂的250毫升玻璃瓶中用于LC-MS的使用,并保持剩余部分在4℃下的
  2. 准备低质量范围的校准解决方案。使用定制的低质量范围的校准混合物代谢组学的应用,以确保准确的群众在低分子量的检测是非常重要的。
    1. 称取5毫克两种SODI的恩氟乙酸和高香草酸和溶解它们到5ml的水中,使其为1毫克/毫升的最终浓度。二嗪磷溶解在甲醇中,制成10毫克/毫升的最终浓度。
    2. 为了准备加入1ml负低质量校准溶液,混匀960毫升用20毫升钠fluoroaceate和高香草酸溶液的热负校准解决方案。至1ml的正向低质量校准溶液,混匀990毫升热正校准溶液和10ml二嗪农的解决方案。 (低质量校准溶液应保存在4℃,将新鲜制备的每2个月。)
  3. QE-MS的校准在低质量范围
    1. 之前执行低质量范围内的校准,进行在根据制造商的指示肯定和否定模式标准的质量校准(M / Z,150-2,000)。
    2. 一旦常规质量校正通过,调整扫描范围为60-900 M / Z在仪器控制面板和25伏特为阳性模式和35伏特为负模式源的CID被应用。 (这将使咖啡因碎片离子和硫酸根离子的健壮信号,这里的扫描范围是固定的,因为最后的M / Z应不低于起始为m / z 15倍放大)
    3. 一旦离子源是稳定的,则执行自定义校准。注意:一个稳定的源被定义为总离子电流的变化在正模式的小于10%,并且在负离子模式下小于15%。定制的校准离子和相应的m / z的列于表1。
  4. 建立了LC-MS仪器的极性代谢物的分析。 LC耦合到QE-MS进行代谢物的分离和检测。
    1. 装备QE-MS具有加热电喷雾电离探头(H-ESI)。设置相关调谐参数的探头所列:加热器温度120℃;鞘气,30;辅助气体,10;扫气,3;喷涂电压,3.6千伏积极模式和2.5千伏负模式。于55设置在毛细管温度为320℃,S-透镜。
    2. 建立一个完整的扫描方法如下:全扫描范围:60〜900(M / Z);分辨率:70,000;最大注射时间:200毫秒,约50毫秒的典型注射倍;自动增益控制(AGC):3,000,000离子。这些设置导致大约550毫秒来进行扫描的正面和负面的模式占空比。
    3. 建立色谱方法。复方分离在室温13,15聘请酰胺柱(100×2.1 mm内径,3.5毫米)。流动相A为如上所述,并且流动相B为乙腈。使用线性梯度如下:0分钟,85%B; 1.5分钟,85%B,5.5分钟,35%B; 10分钟,35%B,10.5分钟,35%B,14.5分钟,35%B,15分钟,85%B和20分钟,85%B的流速为0.15毫升/分钟从0至10分钟和15至20分钟,和0.3毫升/分钟从10.5到14.5分钟。

2,镨代谢物样品的eparation

  1. 准备提取溶剂。混合40ml甲醇(LC-MS)和10毫升的水(LC-MS级)在50毫升管,并将其保存在-80℃冰箱在使用前至少1小时。注意:此过程与下面的步骤可以修改为生物组织和流体样品的提取。
    1. 培养大肠癌细胞HCT 8细胞在310厘米菜肴或6孔板具有完全生长培养基,RPMI 1640补充有10%热灭活胎牛血清和10万个单位/ L的青霉素和100mg / L的链霉素。
    2. 当细胞达到80%汇合,迅速 ​​取出介质,并将其放置在干冰13,15上方的盘或板。加入1 ml提取溶剂立即(80%甲醇/水),以及所述板转移到-80℃的冰箱中。为10cm的培养皿中,添加3毫升萃取溶剂的每个孔中。 (尝试移除介质,尽可能避免因从中残留盐的离子抑制效应。)
    3. 离开该板15分钟。从冰箱中取出,并刮去细胞到在干冰上的溶剂。将溶液转移到1.7毫升的Eppendorf管中,并以20,000×g离心速度离心在4℃下10分钟。 (准备细胞代谢物从三个不同的菜肴,使三个重复样品。保持两管的目的是有一个作为备份。)
    4. 将上清转移到两个新的Eppendorf管中,并擦干他们在一个速度真空。这大约需要3-6小时,取决于所使用的速度真空。 (样品也可以一夜之间在氮气干燥。)
    5. 后在-80℃下冷冻各试样的干燥,储存管中。准备就绪后,重新组建一个样品20毫升水(LC-MS级),注射5毫升LC-QE-MS进行分析。

采样序列的3。设置

  1. 一旦校准已妥善开展了对QE-MS,平衡液相色谱柱为5分钟,85%的流量速度为0.15毫升/分钟,这是LC梯度的起始条件。
  2. 以随机顺序设置采样序列。注意:在这种方式,分配由LC-MS引入到每个样品的波动,并确保不同的样品之间更准确的比较。每6个样品中,添加的洗涤运行,其共享相同的质谱法,除LC梯度为95%A和10分钟,然后用5分钟柱平衡在85%A为0.15毫升/分钟的流速。添加空白样品(100%水)每次清洗后运行,以评估该系统的背景和结转的水平。
  3. 保存序列,一旦液晶栏显示稳定的压力,约400磅,启动顺序运行。如果没有其他的样品这个序列后运行,然后整理后添加的序列,其中有0毫升/分钟的渐变结束的流速月底停止运行,并选择“待机”的序列。
  4. 重新运行相同的样本集校准后12小时。 (这是我秒校准后,以评估质量误差的波动。)

4。后分析仪器清洗和维护

  1. 在序列的末尾,以0.2毫升/分钟为2小时的流速用95%A洗柱,并在必要时,洗涤前的反向柱。
  2. 除去液相色谱柱,并直接通过一个联合的LC连接到离子源。准备清洗溶剂,水/甲醇/甲酸(体积:体积:V,90:10:0.2),待机模式设置MS和洗涤LC-MS系统以0.1的流量毫升/分钟1小时以除去残留沉淀的盐或其它杂质。降低流速,如果有太多的系统压力。
  3. 在50℃下将毛细管温度,并取下离子笼。小心取出离子吹扫锥和离子传输管后的毛细管的温度下降到50℃。使用粗网格,诸如砂纸,除去留下的离子吹扫锥的表面上的杂质。
  4. 将离子转移管放入含有10ml 90%水/甲醇和0.1%甲酸15毫升的Falcon管中。超声处理管在水浴超声器20分钟后,滗出溶剂内,它用10毫升纯甲醇替换和超声仪处理20分钟。 (如果需要,超声处理可以在40℃或更高的温度,以达到更好的清洁效果完成。)

LC-MS数据的5。分析

  1. 为确保采样序列运行平稳,完成序列中的前两个样品后,检查未知代谢物峰。使用csv文件列出的代谢物名称,中性化学分子式和检测模式(无论是正面的还是负面的),作为输入文件和输出文件包含提取的高峰,在ppm级的质量误差。如果峰形异常或质量误差是关闭的超过5ppm,则需要在序列的其余部分要被停止和故障诊断需要做的事情。
  2. 选择“峰对齐的方法和帧提取“的市售软件。从LC-MS和他们组原始数据。挑样品中的运行顺序为峰对齐色谱法,参照样品的中间。上传一个框架种子包括已知的代谢产物为目标代谢产物分析收集到的数据和相应的帧的种子。
  3. 在正和负模式分别执行数据分析。使用默认设置其他参数。关闭数据库的搜索功能和运行工作流。导出处理后的数据为包含每一帧的峰面积的Excel工作表。帧的第一个集合对应于在目标列表中的代谢物。注意:对于靶向代谢物的分析,基于以前的研究13,15得到的代谢信息。
  4. 对于一个不相关的代谢产物分析,选择“成分提取”的方法。加载背景扣除空白样品。设置峰值强度阈值的T 10 5,10 ppm的和信号的3信噪比M / Z宽度。
  5. 对未知化合物鉴定人使用代谢组数据库。使用简历过滤器重复样品中去除大简历的组件。手动通过每个组件,并挑选那些具有良好定义的峰值或在不同类型的样本数据库搜索比较大的差异。与点击导出数据的数据库。 (如果峰值比对分数太低峰值对准可被绕过。)

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Representative Results

代谢组数据的精度在很大程度上取决于对LC-QE-MS仪器的性能。评估状况良好仪器是否正在运行,并且应用该方法是否是正确的,几个已知代谢物的LC峰被从总离子色谱图(TIC)萃取, 如图1。极性代谢物,包括氨基酸,糖酵解中间体,三氯乙酸中间体,核苷酸,维生素,ATP,NADP +等有很好的保留在目前的LC条件下的酰胺列的列和良好的峰形。同时,大容量误差测试低质量校准后24小时内完成,如示于图2。6种不同浓度一式三份样品的被校准后运行两次,并在整个时间范围几乎覆盖了24小时。质量错误是由检测到的M / Z相比较,以靶向代谢物的理论M / Z评估。在这里,有针对性的代谢产物具有M / Z从74(甘氨酸),以744(NADP +)。这里,Y轴表示代谢物的内一定质量的误差范围的累计百分比。蓝色曲线显示了结果从0-12小时,而红色的曲线示出了从12-24小时收集的数据, 图2清楚地表明,超过90%的代谢物是在5 ppm的质量误差,表示低质量这里开发的范围校准方法足以维持5 ppm的质量误差低质量范围的检测。

还有一个问题要解决的是仪器与当前方法和仪器设置的灵敏度。甲系列稀释一式三份样品从10cm培养皿做5次为6的稀释因子,结束与6个不同浓度的样品。这些样品代表代谢物从10 7提取的1.29的量,1.67×10 6,2.78×10 5,4.63×10 4,7.72×10 3,和×10 3个细胞,分别。由于样品的各浓度制备一式三份,总共18个样品中的LC-QE-MS进行分析。有针对性的清单是用来评估在检测代谢物的数量不同样品的浓度。结果在图3中表示检测到的对象的代谢产物的最佳数量是与2.78×10 5和1.67×10 6个细胞,而1×10 7个细胞得到了一些检测的代谢物更少,这是由于离子抑制效应。这一结果表明,细胞的最佳数量,提取该分析是大致的井是在一个6孔板中。

对于无目标代谢产物的分析,20%的简历截止和10 7的平均强度值是用来过滤元件表。这些刚性的简历和平均强度的阈值用于演示目的。为了提高可重复性,简历截止值可以是增加(例如,30%),而平均强度值需要被降低(例如,10 5),以包括更多的峰。经过手动检查峰,具有良好的形状的部件被选中,并在人类代谢组数据库中搜索。其结果示于表2。表2A列出了从收集在正模式数据的结果,而表2B示出了从负模式的结果。一些这里确定的代谢物与代谢物中的目标列表,如谷胱甘肽,脯氨酸等,但同时,额外的代谢物从目标清单中不存在进行了探索,如methyglyoxal,这可以从糖酵解中导出,并且1重叠-棕榈酰-2 -油酰-sn-甘油基-3 -磷酸胆碱,这是在为3.2分钟,这是一个合理的保留有关的酰胺柱磷脂的保留时间检测到阳性。对非靶向代谢物数据库检索的协议一直公关eviously报20。

图1
图1的LC-MS色谱峰的例子,在这里,重构层析用10ppm的质量窗口(M / Z±5ppm的)生成的。 X轴显示的保留时间,而Y轴表示相对强度,峰值强度列出的每个代谢物上面, 一个显示了积极的模式检测到的峰,而B显示了从消极模式峰。 点击这里查看大图。

图2
图2。 60;低质量范围校正评估中的Y轴是代谢物与内5 ppm的质量检测误差的累积百分比。 X轴为以ppm表示质量的误差范围。蓝色和红色的曲线代表0-12小时和12-24小时,分别为。 点击这里查看大图。

图3
图3:评价的样品量-检测与HCT的8细胞数靶向代谢物的数目红色方块代表在正离子模式检测到的代谢物,蓝色圆圈意味着在负模式中测得的代谢产物,而黑色三角形是同时从总数代谢物的正和负模式。 X轴显示HCT 8细胞的数量。upload/51358/51358fig3highres.jpg“目标=”_blank“>点击这里查看大图。

<TD> NA
标准 M / Z,积极模式 M / Z,负模式中性配方中性质量
丁胺 74.096425 不适用 C 4 H 11 N 73.089149
咖啡因片段 138.066188 不适用 C 6 H 8 N 3 O 137.058912
咖啡因 195.087652 不适用 C 8 H 11 N 4 O 2 194.080376
二嗪农 305.108329 不适用 C 12 H 20 N 2 O 3 PS 304.101053
MRFA肽 524.264966 C 23 H 37 N 7 O 5 S 523.25769
氟乙 N / A 77.004432 C 2 H 3 FO 2 78.011708
硫酸 N / A 96.960106 H 2 SO 4 97.967382
高香草酸 N / A 181.050634 C 9 H 10 O 4 182.05791
十二烷基硫酸钠 N / A 265.147906 C 12 H 26 SO 4 266.155182
牛磺胆酸钠 N / A 514.2844 C 26 H 45 NO 7 S 515.291676

表1。低质量范围校准标准和它们的确切M / Z。

<TD> 131.05901
CSID 名称公式单一同位素质量海量搜索错误(PPM) RT(分钟)
234 β-丙氨酸 C 3 H 7 NO 2 89.04800 89.04805 0.62 8.08
1057 肌氨酸 C 3 H 7 NO 2 89.04768 89.04805 4.22 8.08
5735 丙氨酸 C 3 H 7 NO 2 89.04768 89.04805 4.22 8.08
568 肌酐 C 4 H 7 N 3 O 113.05900 113.05889 1.00 4.41
128566 脯氨酸 C 5 H 9 NO 2 115.06333 115.06338 0.41 7.54
6050 L-(+)-缬氨酸 C 5 H 11 NO 2 117.07898 117.07896 0.18 7.42
7762 亚硝酸异戊酯我 C 5 H 11 NO 2 117.07898 117.07896 0.18 7.42
135 5 - 氨基戊酸 C 5 H 11 NO 2 117.07900 117.07896 0.38 7.42
242 三甲基甘氨酸 C 5 H 11 NO 2 117.07900 117.07896 0.38 7.42
911 烟酰胺 C6H6N2O 122.04800 122.04793 0.55 2.60
1091 牛磺酸 C 2 H 7 NO 3 S 125.01466 125.01469 0.20 7.61
1030 吡咯啉羟基羧酸 C 5 H 7 NO 3 129.04259 129.04259 0.02 8.51
7127 PCA C 5 H 7 NO 3 129.04259 129.04259 0.02 8.51
90657 N-丙烯酰基 C 5 H 7 NO 3 129.04259 129.04259 0.02 8.51
388752 5 - 氧代-D-脯氨酸 C 5 H 7 NO 3 129.04259 129.04259 0.02 8.51
389257 3 - 羟基-3,4 - 二氢-2H-吡咯-5 - 羧酸 C 5 H 7 NO 3 129.04259 129.04259 0.02 8.51
8031176 吡咯烷酮羧酸 C 5 H 7 NO 3 129.04259 129.04259 0.03 8.51
5605 羟脯氨酸 C 5 H 9 NO 3 131.05824 131.05901 5.83 8.08
7068 N-Acetylalanin C 5 H 9 NO 3 131.05824 5.83 8.08
79449 AC-ALA-OH C 5 H 9 NO 3 131.05824 131.05901 5.83 8.08
89122 Ethylformylglycine C 5 H 9 NO 3 131.05824 131.05901 5.83 8.08
167744 L-谷氨酸-γ-半醛 C 5 H 9 NO 3 131.05824 131.05901 5.83 8.08
388519 5 - 氨基-2 - 氧代戊酸 C 5 H 9 NO 3 131.05824 131.05901 5.83 8.08
134 氨基乙酰丙酸 C 5 H 9 NO 3 131.05800 131.05901 </ TD> 7.70 8.08
9312313 3 - 羟基-L-脯氨酸 C 5 H 9 NO 3 131.05800 131.05901 7.70 8.08
566 肌酸 C 4 H 9 N 3 O 2 131.06900 131.06905 0.36 8.08
5880 L-(+) - 亮氨酸 C 6 H 13 NO 2 131.09464 131.09455 0.68 6.96
6067 L-(+) - 异亮氨酸 C 6 H 13 NO 2 131.09464 131.09455 0.68 6.96
19964 L-正亮氨酸 C 6 H 13 NO 2 131.09464 131.09455 0.68 6.96 </ TD>
388796 β-亮氨酸 C 6 H 13 NO 2 131.09464 131.09455 0.68 6.96
548 氨基己酸 C 6 H 13 NO 2 131.09500 131.09455 3.48 6.96
6031 L-( - ) - 天冬酰胺 C 4 H 8 N 2 O 3 132.05350 132.05348 0.10 8.31
109 脲基丙酸 C 4 H 8 N 2 O 3 132.05299 132.05348 3.71 8.31
6026 L-鸟氨酸 C 5 H 12 N 2 O 2 132.08987 132.08988 0.02 10.37
64236 D-鸟氨酸 C 5 H 12 N 2 O 2 132.08987 132.08988 0.02 10.37
5746 谷氨酰胺 C 5 H 10 N 2 O 3 146.06914 146.06900 0.93 8.25
128633 D-谷氨酰胺 C 5 H 10 N 2 O 3 146.06914 146.06900 0.93 8.25
141172 Ureidoisobutyric酸 C 5 H 10 N 2 O 3 146.06914 146.06900 0.93 8.25
21436 N-甲基-<scp> D </ SCP>-天冬氨酸 C 5 H 9 NO 4 147.05316 147.05300 1.13 8.06
21814 D-( - )-谷氨酸 C 5 H 9 NO 4 147.05316 147.05300 1.13 8.06
30572 L-(+) - 谷氨酸 C 5 H 9 NO 4 147.05316 147.05300 1.13 8.06
58744 N-乙酰基-L-丝氨酸 C 5 H 9 NO 4 147.05316 147.05300 1.13 8.06
5907 L-( - )-蛋氨酸 C 5 H 11 NO 2 S 149.05106 149.05095 0.70 7.39
6038 组氨酸 C 6 H 9 N 3 O 2 155.06947 155.06940 0.48 8.33
5910 L-( - ) - 苯丙氨酸 C 9 H 11 NO 2 165.07898 165.07887 0.63 6.60
1025 吡哆醇 C 8 H 11 NO 3 169.07390 169.07376 0.80 3.24
4463 Oxidopamine [USAN:INN] C 8 H 11 NO 3 169.07390 169.07376 0.80 3.24
102750 5 - (2 - 氨基乙基)邻苯三酚 C 8 H 11 NO 3 169.07390 169.07376 0.80 3.24
388394 去甲肾上腺素 C 8 H 11 NO 3 169.07390 169.07376 0.80 3.24
6082 L-(+) - 精氨酸 C 6 H 14 N 4 O 2 174.11168 174.11144 1.39 10.77
64224 D-精氨酸 C 6 H 14 N 4 O 2 174.11168 174.11144 1.39 10.77
780 heteroauxin C 10 H 9 NO 2 175.06300 175.06304 0.18 2.32
67261 吲哚-3 - 乙醛,5 - 羟基 C 10 H 9 NO 2 175.06332 175.06304 1.65 2.32
3574185 吲哚-2 - 乙酸 C 10 H 9 NO 2 175.06332 175.06304 1.65 2.32
5833 L-( - )-酪氨酸 C 9 H 11 NO 3 181.07390 181.07378 0.66 7.48
389285 3 - 氨基-3 - (4 - 羟基苯基)丙酸 C 9 H 11 NO 3 181.07390 181.07378 0.66 7.48
13628311 L-苏-3 - 苯基丝氨酸 C 9 H 11 NO 3 181.07390 181.07378 0.66 7.48
425 4 - 羟基-4 - (3 - 吡啶基)丁酸 C 9 H 11 NO 3 181.07401 181.07378 1.25 7.48
13899 3 - (1H-吲哚-3 - 基)丙烯酸 C 11 H 9 NO 2 187.06332 187.06330 0.15 6.44
10607876 吲哚乙酸 C 11 H 9 NO 2 187.06332 187.06330 0.15 6.44
389120 N6,N6,N6-三甲基-L-赖氨酸 C 9 H 20 N 2 O 2 188.15248 188.15221 1.45 10.87
388321 5“-S-甲基-5”-thioadenosine C 11 H 15 N 5 O 3 S 297.08957 297.08898 2.00 2.56
144 9 - (5-S-甲基-5 - thiopentofuranosyl)-9H-嘌呤-6 - 胺 C 11 H 15 N 5 O 3 S 297.09000 297.08898 3.43 2.56
111188 谷胱甘肽 C 10的H 17 N 3 O 6 S 307.08380 307.08345 1.14 8.02

表2A。

5 H 9 NO 3 11 H 19 NO 9
CSID 名称公式单一同位素质量海量搜索错误(PPM) RT(分钟)
857 甲基乙二醛 C 3 H 4 O 2 72.02100 72.02108 1.03 7.70
1057 肌氨酸 C 3 H 7 NO 2 89.04768 89.04747 2.33 8.19
5735 丙氨酸 C 3 H 7 NO 2 89.04768 89.04747 2.33 8.19
234 β-丙氨酸 C 3 H 7 NO 2 89.04800 89.04747 5.93 8.19
55423 R-乳酸 C 3 H 6 O 3 90.03169 90.03143 2.91 5.12
61460 羟基丙酸 C 3 H 6 O 3 90.03169 90.03143 2.91 5.12
96860 L-(+) - 乳酸 C 3 H 6 O 3 90.03169 90.03143 2.91 5.12
592 乳酸 C 3 H 6 O 3 90.03200 90.03143 6.29 5.12
650 二羟基丙酮 C 3 H 6 O 3 90.03200 90.03143 6.29 5.12
731 甘油醛 C 3 H 6 O 3 90.03200 90.03143 6.29 5.12
1086 硫酸 H 2 O 4 S 97.96738 97.96683 5.63 8.13
128566 脯氨酸 C 5 H 9 NO 2 115.06333 115.06302 2.67 7.78
1078 琥珀酸 C 4 H 6 O 4 118.02661 118.02630 2.66 7.72
466979 Erythrono -1,4 - 内酯 Ç4 H 6 O 4 118.02661 118.02630 2.66 7.72
4483398 D-赤糖G-内酯 C 4 H 6 O 4 118.02661 118.02630 2.66 7.72
473 甲基丙二酸 C 4 H 6 O 4 118.02700 118.02630 5.96 7.72
8527138 (3S,4R)-3,4 - Dihydroxydihydrofuran -2(3H) - 酮 C 4 H 6 O 4 118.02700 118.02630 5.96 7.72
140384 2 - ketocaproic酸 C 6 H 10 O 3 130.06299 130.06270 2.24 2.35
164251 Methyloxovaleric酸 C 6 H 10 O 3 130.06299 130.06270 2.24 2.35
388419 (3S)-3 - 甲基-2 - 氧代戊酸 C 6 H 10 O 3 130.06299 130.06270 2.24 2.35
15642233 Ketoleucine C 6 H 10 O 3 130.06299 130.06270 2.24 2.35
46 α-氧代-β-甲基戊酸 C 6 H 10 O 3 130.06300 130.06270 2.36 2.35
69 α-酮异己酸 C 6 H 10 O 3 130.06300 130.06270 2.36 2.35
134 氨基乙酰丙酸 131.05800 131.05795 0.36 8.19
9312313 3 - 羟基-L-脯氨酸 C 5 H 9 NO 3 131.05800 131.05795 0.36 8.19
5605 羟脯氨酸 C 5 H 9 NO 3 131.05824 131.05795 2.23 8.19
7068 N-Acetylalanin C 5 H 9 NO 3 131.05824 131.05795 2.23 8.19
79449 AC-ALA-OH C 5 H 9 NO 3 131.05824 131.05795 2.23 8.19
89122 Ethylformylglycine C 5 H 9 NO 3 131.05824 131.05795 2.23 8.19
167744 L-谷氨酸-γ-半醛 C 5 H 9 NO 3 131.05824 131.05795 2.23 8.19
388519 5 - 氨基-2 - 氧代戊酸 C 5 H 9 NO 3 131.05824 131.05795 2.23 8.19
5880 L-(+) - 亮氨酸 C 6 H 13 NO 2 131.09464 131.09419 3.39 7.09
6067 L-(+) - 异亮氨酸 C 6 H 13 NO 2 131.09464 131.09419 3.39 7.09
19964 L-正亮氨酸 C 6 H 13 NO 2 131.09464 131.09419 3.39 7.09
388796 β-亮氨酸 C 6 H 13 NO 2 131.09464 131.09419 3.39 7.09
548 氨基己酸 C 6 H 13 NO 2 131.09500 131.09419 6.18 7.09
109 脲基丙酸 C 4 H 8 N 2 O 3 132.05299 132.05321 1.60 8.28
6031 L-( - ) - 天冬酰胺 C 4 H 8 N 2 O 3 132.05350 132.05321 2.21 8.28
6026 L-鸟氨酸 C 5 H 12 N 2 O 2 132.08987 132.08961 1.98 10.36
64236 D-鸟氨酸 C 5 H 12 N 2 O 2 132.08987 132.08961 1.98 10.36
193317 L-( - ) - 苹果酸 C 4 H 6 O 5 134.02153 134.02130 1.72 7.95
510 (±) - 苹果酸 C 4 H 6 O 5 134.02200 134.02130 5.25 7.95
133224 苏糖酸 C 4 H 8 O 5 136.03717 136.03688 2.14 7.70
388628 2,3,4 - Trihydroxybutanoic酸 C 4 H 8 O 5 136.03717 136.03688 2.14 7.70
2061231 DL-赤糖酸 C 4 H 8 O 5 136.03717 136.03688 2.14 7.70
21436 N-甲基-<scp> D </ SCP>-天冬氨酸 C 5 H 9 NO 4 147.05316 147.05299 1.16 8.05
21814 D-( - )-谷氨酸 C 5 H 9 NO 4 147.05316 147.05299 1.16 8.05
30572 L-(+) - 谷氨酸 C 5 H 9 NO 4 147.05316 147.05299 1.16 8.05
58744 N-乙酰基-L-丝氨酸 C 5 H 9 NO 4 147.05316 147.05299 1.16 8.05
6038 组氨酸 C 6 H 9 N 3 O 2 155.06947 155.06930 1.09 8.36
199 尿囊素 C 4 H 6 N 4 O 3 158.04401 158.04387 0.88 4.76
6082 L-(+) - 精氨酸 C 6 H 14 N 4 O 2 174.11168 174.11154 0.80 10.76
64224 D-精氨酸 C 6 H 14 N 4 O 2 174.11168 174.11154 0.80 10.76
58576 N-乙酰-L-天冬氨酸 C 6 H 9 NO 5 175.04807 175.04803 0.18 7.87
996 焦磷酸 H 4 O 7 P 2 177.94299 177.94331 1.79 8.42
5589 葡萄糖 C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
17893 甘露糖 C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
58238 ,β-D-吡喃葡萄糖 C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
71358 ,α-D-吡喃葡萄糖 C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
134838 3 - 脱氧-阿拉伯 - hexonic酸 C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
388332 L-Sorbopyranose C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
388476 β-D-吡喃半乳糖 C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
388480 ,α-D-吡喃半乳糖 C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
388775 β-D-呋喃果糖 C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
10239179 肌醇 C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
16736992 顺肌醇 C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
17216070 阿洛糖 C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
17216093 L-山梨糖 C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
201 六吡喃糖 C 6 H 12 O 6 180.06300 180.06346 2.53 7.53
868 1,2,3,4,5,6-cyclohexanhexol C 6 H 12 O 6 180.06300 180.06346 2.53 7.53
2068 茶碱 C 7 H 8 N 4 O 2 180.06473 180.06346 7.04 7.53
4525 1,7 - 二甲基黄嘌呤 C 7 H 8 N 4 O 2 180.06473 180.06346 7.04 7.53
5236 可可碱 C 7 H 8 N 4 O 2 180.06473 180.06346 7.04 7.53
1161 异柠檬酸 C 6 H 8 O 7 192.02701 192.02704 0.15 8.18
305 慈TRIC酸 C 6 H 8 O 7 192.02699 192.02704 0.23 8.18
963 泛酸 C 9 H 17 NO 5 219.11067 219.11049 0.84 6.72
6361 D-泛酸 C 9 H 17 NO 5 219.11067 219.11049 0.84 6.72
960 棕榈酸 C 16 H 32 O 2 256.23999 256.24000 0.05 1.73
111188 谷胱甘肽 C 10 H 17 N 3 O 6 S 307.08380 307.08339 1.35 8.03
388337 N-乙酰神经氨酸 309.10599 309.10585 0.45 7.43
392681 N-乙酰基-α-神经氨酸 C 11 H 19 NO 9 309.10599 309.10585 0.45 7.43
392810 唾液酸的Neu5Ac C 11 H 19 NO 9 309.10599 309.10585 0.45 7.43

表2B中。

表2中的HCT检测到非目标代谢物的列表8细胞(2.78×10 5细胞当量计)表2A和2B中包括的组件提取的信息保留时间,M / Z和质量误差,同时,数据库的搜索结果:Chemspider ID( CSID),名称,公式,等等。这里所分析的样品是方程l来代谢物从2.78×10 5细胞中提取,并且强度阈值为1×10 7,避免繁琐的结果为示范的目的。

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Discussion

在使用这种协议的细胞成功代谢物图谱中最关键的步骤是:1)控制所述生长培养基中并小心萃取的细胞; 2)调整液相色谱方法基于MS方法设置,以确保有足够的(通常至少为10)跨数据进行定量峰点; 3)做一个低质量运行校准样品前; 4)注入不超过5毫升到避免保留时间偏移和峰展宽引起的水; 5)准备和运行样品在同一批次,以减少批效果比较。

标准( 表1)选择这里的低质量范围的校准是可以互换的。用M / Z落入质量扫描范围内的任何已知的化合物,性能良好,在H-ESI源,并且可溶于水,甲醇或乙腈是合理的候选校准标准。强烈建议来存储所有的校准解决方案吨4℃下,以稳定的咖啡因,同时尽量减少甲醇或乙腈的蒸发在校准溶液,使校准性能可以更具有可重复性。相比于常规的质量范围,M / Z为150至2000,低质量范围内的校准需要更频繁地每两天进行,至少一次。

这个工作流程,从提取溶剂,溶剂重组,LC流动相,低质量范围校准和MS扫描范围进行了优化,测量极性代谢物。这包括氨基酸,乙酰基氨基酸,糖酵解途径的中间体,核苷,TCA循环中间体,有些一碳代谢途径的中间体等。然而,该协议对于其他类别的代谢物,如辅酶A(CoA的)物种的修改,叶酸,磷脂是可能的。例如,辅酶A是更稳定的,在酸性条件下,使加入酸的80%甲醇/水,将有助于imp的罗夫辅酶A的灵敏度。此外,辅酶A和脂质往往有许多大的分子量,从而在M / Z扫描范围需要从60-900到适当范围将涵盖这些代谢物来进行调整。

即使一些不相关的组件数据库检索结果与目标列表重叠,这是很重要的还是要建立的基础上,优先研究这一目标列表。因为在目标列表中的代谢产物是比一般的强度阈值,对这些代谢物的信息将在处理过程中被除去。目标清单包括的保留时间信息,这让我们对代谢物鉴定和定量较高的信心。与QE-MS建立的一个进一步的优点是串联质谱法可以允许进一步鉴定代谢物。

与此工作流程相关的一个问题是,H-ESI喷针樱雪rt是对样品的盐含量敏感,作为灵敏度会大大损害,如果有大量的非挥发性盐。因此,从样品中,列和H-ESI喷针插入的常规清洗减少盐含量将有助于确保良好的质量的数据,并增加柱的寿命。

总之,本协议采用LC-QE-MS成功地分析极性代谢物从培养的细胞中,以最少的样品制备步骤和快速的数据采集。在样品制备小的修改,可以进行以获得从其它生物来源,如血清和组织数据。例如,由于纯甲醇可以加入到液体血清加入到做出最终的甲醇浓度为80%的极性代谢物的提取。对于组织样品,严格的搅拌和混合是需要达到更好的提取效率。一般为10毫升血清或1毫克组织是足够的代谢物分析。原始数据既可以在目标模式进行分析,如果存在已知代谢物的样品中,并在一个未定位的方式后跟HRMS数据库搜索。基于代谢组学的人力资源管理系统仍处于早期阶段。对于未来的进步,本实验技术可以进一步优化,额外的代谢产物的HRMS信息和MS / MS碎裂模式将是有益的和相关的算法,如峰对齐,峰积分,同位素簇等,可以提高效率和准确性数据处理。然而,归根结底,很多的,我们的代谢实验室地址通过仔细解读数据的后处理有限的问题。随着这些大型代谢组学技术,我们常常被我们所产生的假设的数据和评价解释的限制。因此,所有的代谢组学实验需要围绕具体问题制定。

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Disclosures

作者宣称没有利益冲突。

Acknowledgements

作者要感谢德特勒夫·舒曼,詹妮弗·萨顿(赛默飞世尔科技)和纳撒尼尔·斯奈德(宾夕法尼亚大学)为质量校准和数据处理有价值的讨论。研究报告本出版物中得到了卫生部下奖号码R00CA168997国家研究院​​国立癌症研究所的支持。内容完全是作者的责任,并不一定代表美国国立卫生研究院的官方意见。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Positive calibration mix Thermo Scientific #88323 It is light sensitive. Store at 4 °C
Negative calibration mix Thermo Scientific #88324 Store at 4 °C
Diazinon Sant Cruz Biotechnology #C0413 It causes eyes irritation, so work in hood. Store at 4 °C
H-ESI needle insert Fisher Scientific #1303200 This could be replaced or cleaned with 5% formic acid/water (remove rubber ring) if clogged.
Xbridge amide column Waters #186004860 Guard column is recommend to increase column lifetime.

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