Una estrategia para sensibles, grande escala cuantitativa Metabolómica

1Division of Nutritional Sciences, Cornell University, 2Field of Biochemistry, and Molecular Cell Biology, Cornell University
Published 5/27/2014
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Biology

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Summary

Metabolito de perfiles ha sido un valioso activo en el estudio del metabolismo en la salud y la enfermedad. La utilización de la cromatografía en fase normal líquida acoplada a espectrometría de masas de alta resolución con el cambio de polaridad y un ciclo de trabajo rápido, se describe un protocolo para analizar la composición metabólica polar de material biológico con una alta sensibilidad, precisión y resolución.

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Liu, X., Ser, Z., Cluntun, A. A., Mentch, S. J., Locasale, J. W. A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics. J. Vis. Exp. (87), e51358, doi:10.3791/51358 (2014).

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Abstract

Metabolito de perfiles ha sido un valioso activo en el estudio del metabolismo en la salud y la enfermedad. Sin embargo, las actuales plataformas tienen diferentes factores limitantes, como las preparaciones de mano de obra de la muestra, bajos límites de detección, la velocidad de barrido lento, optimización de método intensivo para cada metabolito, y la imposibilidad de medir tanto positiva e iones con carga negativa en los experimentos individuales. Por lo tanto, un nuevo protocolo de la metabolómica podría avanzar los estudios de metabolómica. Cromatografía hidrófilo a base de amida permite el análisis de metabolitos polares sin ninguna derivatización química. MS de alta resolución usando el Q-Exactive (QE-MS) ha mejorado la óptica de iones, aumento de velocidades de exploración (256 ms a una resolución de 70.000), y tiene la capacidad de llevar a cabo el cambio positivo / negativo. Utilizando una estrategia de extracción de metanol frío y acoplar una columna de amida con QE-MS permite la detección robusta de 168 metabolitos y miles polares dirigidos de características adicionales de forma simultánea. Datun procesamiento se lleva a cabo con el software disponible comercialmente en una forma altamente eficiente, y características desconocidas extraídas de los espectros de masas se puede consultar en las bases de datos.

Introduction

La metabolómica, definidas como un experimento que mide varios metabolitos simultáneamente, ha sido un área de intenso interés. La metabolómica proporciona una lectura directa de la fisiología molecular y ha proporcionado conocimientos sobre el desarrollo y la enfermedad como el cáncer de 1-4. La resonancia magnética nuclear (RMN) y la cromatografía de espectrometría de masas de gases (GC-MS) se encuentran entre los instrumentos más utilizados 5-9. RMN, especialmente se ha utilizado para los experimentos de flujo desde compuestos marcados de isótopos pesados, tales como 13 C etiquetados metabolitos, son RMN-activo 10,11. Sin embargo, esta estrategia requiere relativamente alta pureza de la muestra y la gran cantidad de la muestra, lo que limita sus aplicaciones en la metabolómica. Mientras tanto, los datos obtenidos de RMN análisis de las necesidades de obra y asignación compuesta de los espectros de RMN complejo es difícil. GC-MS ha sido ampliamente utilizado para los metabolitos polares y los estudios de lípidos, pero requiere compoun volátilds y, por tanto, a menudo la derivación de metabolitos, que a veces implica la química compleja que puede llevar mucho tiempo e introduce ruido experimental.

La cromatografía líquida (LC) acoplada a espectrometría de masas de triple cuadrupolo utiliza el primer cuadrupolo para la selección de los iones primarios intactos, que son fragmentados a continuación, en el segundo cuadrupolo, mientras que el tercer cuadrupolo se utiliza para seleccionar fragmentos característicos o iones hija. Este método, que registra la transición de iones primarios a iones secundarios específicos, se denomina monitorización de reacción múltiple (MRM). MRM es un método muy sensible, específico y robusta tanto para moléculas pequeñas y cuantificación de proteínas 12-15,21. Sin embargo, MRM tiene sus limitaciones. Para lograr una alta especificidad de un método MRM tiene que ser construido para cada metabolito. Este método consiste en la identificación de un fragmento específico y la correspondiente energía de colisión optimizado, que requiere conocimiento previo de la propertes de los metabolitos de interés, como la información de la estructura química. Por lo tanto, con algunas excepciones que implican la pérdida neutra de fragmentos comunes, no es posible identificar metabolitos desconocidos con este método.

En los últimos años, la espectrometría de masas de alta resolución (HRMS) instrumentos han sido puestos en libertad, tales como la serie LTQ-orbitrap y Exactive, el QuanTof y TripleTOF 5600 16-18,22. HRMS pueden proporcionar una relación masa a carga (m / z) de los iones intactos dentro de un error de unas pocas ppm. Por lo tanto, un instrumento HRMS operado por la detección de todos los iones precursores (es decir, modo de barrido completo) puede obtener información estructural directa de la masa exacta y la composición elemental resultante del analito, y esta información puede ser utilizada para identificar los posibles metabolitos. De hecho, toda la información acerca de un compuesto se puede obtener con una masa exacta, hasta el nivel de los isómeros estructurales. Además, un completométodo de exploración no requiere conocimientos previos de los metabolitos y no requiere la optimización del método. Además, puesto que todos los iones con m / z caer en el rango de exploración pueden ser analizados, HRMS tiene una capacidad casi ilimitada en términos del número de metabolitos que pueden ser cuantificadas en un solo plazo en comparación con el método de MRM. HRMS también es comparable a un MRM de triple cuadrupolo de la capacidad cuantitativa debido al ciclo de trabajo corto que resulta en un número comparable de puntos de datos que se pueden obtener en un análisis completo de MS. Por lo tanto, HRMS proporciona un enfoque alternativo para la metabolómica cuantitativos. Recientemente, una versión mejorada de HRMS denomina espectrometría de masas Q-Exactive (QE-MS) se puede funcionar bajo la conmutación entre los modos positivos y negativos con tiempos de ciclo lo suficientemente rápido en un solo método, que amplía el rango de detección 19. Aquí describimos nuestra estrategia metabolómica utilizando el QE-MS.

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Protocol

1. Preparación de LC-MS Reactivos, Establecimiento de un método de cromatografía, y establecimiento de procedimientos de operación del instrumento

  1. Preparación de disolventes LC
    1. Preparar 500 ml fases móviles. A es acetato de amonio 20 mM y 15 mM de hidróxido de amonio en 3% de acetonitrilo / agua, pH final 9,0; y B es 100% de acetonitrilo.
    2. Sin apretar tapar la botella, colocarlo en un baño de ultrasonido agua, y someter a ultrasonidos durante 10 minutos sin calentamiento adicional. (Este paso es asegurarse de que todas las sales de amonio se disuelven por completo y que no hay burbujas de aire residuales.)
    3. Transferir 250 ml de disolvente a una botella de vidrio de 250 ml para el uso LC-MS, y mantener el resto a 4 ° C.
  2. Preparar la solución de calibración rango de masa baja. Es importante utilizar una mezcla de calibración de gama baja masa a medida para aplicaciones de metabolómica para asegurar que las masas exactas se detectan en pesos moleculares bajos.
    1. Pesar 5 mg de ambos sodium fluoroacetato y ácido homovanílico y disolverlos en 5 ml de agua para hacer una concentración final de 1 mg / ml. Disolver diazinón en metanol para hacer una concentración final de 10 mg / ml.
    2. Para preparar 1 ml de la solución de calibración de masa negativa baja, mezclar 960 ml de solución de calibración térmica negativa con 20 ml de fluoroaceate de sodio y solución de ácido homovanílico. Para hacer 1 ml de solución positiva calibración baja masa, mezclar 990 ml de solución de calibración térmica positiva y 10 ml de solución de diazinon. (La solución de calibración de baja masa debe almacenarse a 4 ° C y ser preparado fresco cada 2 meses.)
  3. Calibración de QE-MS en un rango bajo de masa
    1. Antes de realizar la calibración de bajo rango de masas, llevar a cabo una calibración de masas (m / z, 150-2,000) en los modos tanto positivos como negativos sobre la base de las instrucciones del fabricante.
    2. Una vez que pasa una calibración de masa regular, ajustar el rango de exploración de 60 a 900 m / z en el panel de control de instrumentosy se aplica un CID fuente de 25 eV para el modo positivo y 35 eV para modo negativo. (Esto le dará señales robustas del ión fragmento de la cafeína y el ión sulfato. El rango de exploración aquí es fijo, porque la última m / z no debe ser mayor de 15x de la m el inicio / z)
    3. Una vez que la fuente de iones es estable, a continuación, realizar la calibración personalizada. Nota: Una fuente estable se define como menos de 10% de la variación de la corriente total de iones en el modo positivo, y menos de 15% en modo negativo. Los iones de calibración correspondiente personalizados y m / z se enumeran en la Tabla 1.
  4. Establecer la instrumentación LC-MS para el análisis de metabolitos polares. LC está acoplado a un QE-MS para la separación y detección de metabolito.
    1. Equipar el QE-MS con una sonda de ionización electrospray calentado (H-ESI). Establezca los parámetros de ajuste pertinentes para la sonda que se enumeran: la temperatura del calentador, 120 ° C; gas envolvente, 30; gas auxiliar, 10; barrer de gas, 3; voltaje, 3,6 kV para rociarmodo positivo y 2,5 kV para modo negativo. Ajuste la temperatura del capilar a 320 º C, y S-lente a 55.
    2. Construir un método de exploración completa de la siguiente manera: Completo Rango de escaneado: de 60 a 900 (m / z); Resolución: 70000; tiempo máximo de inyección: 200 mseg con tiempos típicos de inyección de alrededor de 50 ms; control automático de ganancia (AGC): 3.000.000 iones. Estos ajustes dan lugar a un ciclo de trabajo de alrededor de 550 ms para llevar a cabo exploraciones en modo positivo y negativo.
    3. Establecer el método de cromatografía. Emplear una columna de amida (100 x 2,1 mm di, 3,5 mm) para la separación de compuestos a temperatura ambiente 13,15. La fase móvil A es como se describe anteriormente, y la fase móvil B es acetonitrilo. Utilice un gradiente lineal de la siguiente manera: 0 min, 85% de B; 1,5 min, 85% de B, 5,5 min, 35% de B; 10min, 35% de B, 10,5 min, 35% de B, 14,5 min, 35% de B, 15 min, 85% de B, y 20 min, 85% de B. El caudal es de 0,15 ml / min de 0 a 10 min y 15 a 20 min, y 0,3 ml / min 10,5 a 14,5 min.

2. Preparation de muestras de metabolitos

  1. Preparar un disolvente de extracción. Mezclar 40 ml de metanol (LC-MS grado) y 10 ml de agua (LC-MS de grado) en un tubo de 50 ml, y mantenerlo en -80 ° C congelador durante al menos 1 hora antes de su uso. Nota: Este procedimiento y los pasos siguientes pueden ser modificados para la extracción de los tejidos biológicos y muestras de fluidos.
    1. Cultura de colon HCT cáncer de 8 celdas de tres platos de 10 cm o placas de 6 pocillos con medio de cultivo completo RPMI 1640 suplementado con 10% inactivado por calor suero fetal bovino y 100 mil unidades / l de penicilina y 100 mg / l de estreptomicina.
    2. Cuando las células alcanzan el 80% de confluencia, retire rápidamente el medio, y colocar el plato o plato encima de 13,15 hielo seco. Añadir 1 ml de disolvente de extracción inmediatamente (80% de metanol / agua), y transferir la placa a la -80 ° C congelador. Para un plato de 10 cm, añadir 3 ml de disolvente de extracción a cada pocillo. (Trate de eliminar el medio de tanto como sea posible para evitar el efecto de supresión de iones debido a las sales residuales del medio.)
    3. Deje la placa durante 15 minutos. Retire del congelador, y raspar las células en el disolvente en hielo seco. Transferir la solución a 1,7 ml de tubos Eppendorf, y se centrifuga a la velocidad de 20.000 xga 4 ° C durante 10 min. (Preparar metabolitos celulares de tres platos separados para hacer tres muestras replicadas. El propósito de mantener dos tubos es tener una como una copia de seguridad.)
    4. Transferir el sobrenadante a dos nuevos tubos Eppendorf, y secarlos en el vacío la velocidad. Esto toma alrededor de 3-6 horas dependiendo de la velocidad de vacío utilizado. (Las muestras también se pueden secar durante la noche bajo gas nitrógeno.)
    5. Después de tubos de secado, las tiendas de cada muestra en el -80 ° C congelador. Cuando esté listo, reconstituir una muestra en 20 ml de agua (LC-MS grado), e inyectar 5 ml de LC-QE-MS para el análisis.

3. Configuración de la secuencia de muestras

  1. Una vez que la calibración se ha llevado a cabo correctamente en el QE-MS, LC equilibrar la columna durante 5 min con 85% A en un flujotasa de 0,15 ml / min, que es la condición de inicio de la gradiente de LC.
  2. Establecer la secuencia de muestras en orden aleatorio. Nota: En este modo, se distribuye las fluctuaciones introducidas por el LC-MS a cada muestra y se asegura de comparación más precisa entre las diferentes muestras. Cada 6 muestras, añadir una carrera de lavado, que comparte el mismo método de MS, excepto el gradiente de LC es 95% de A durante 10 min y seguido de un equilibrado de la columna 5 min a 85% de A con una velocidad de flujo de 0,15 ml / min. Añadir muestras en blanco (100% de agua) después de cada carrera de lavado de evaluar el fondo del sistema y transferir los niveles.
  3. Guarde la secuencia y una vez que la columna de la LC muestra la presión estable, en torno a 400 psi, comience la secuencia de ejecución. Si no hay otra muestra se debe ejecutar después de esta secuencia, a continuación, agregar una carrera parada en el final de la secuencia, que tiene un caudal de 0 ml / min en el final del degradado y seleccione "modo de espera" después de terminar el secuencia.
  4. Vuelva a ejecutar el mismo conjunto de muestras de 12 horas después de la calibración. (Este is de evaluar la fluctuación de error en masa después de la calibración.)

4. Publicar Análisis de instrumentos de limpieza y mantenimiento

  1. Al final de la secuencia, lavar la columna con 95% de A a una velocidad de flujo de 0,2 ml / min durante 2 horas, y si es necesario, invertir la columna antes de lavar.
  2. Retire la columna de la LC y conectar directamente el LC a la fuente de iones por un sindicato. Preparar disolvente de limpieza, / metanol / ácido fórmico agua (v: v: v, 90:10:0,2), configurar MS en el modo de espera, y sistema de lavado de LC-EM a una velocidad de flujo de 0,1 ml / min durante 1 h para eliminar el residuo precipitó sales u otras impurezas. Baje la velocidad de flujo si hay demasiada presión en el sistema.
  3. Ajuste la temperatura del capilar a 50 º C, y quite la jaula de iones. Retire cuidadosamente el cono de barrido de iones y el tubo de transferencia de iones después de la temperatura del capilar se reduce a 50 ° C. Utilice una malla en bruto, tales como papel de lija, para eliminar las impurezas que quedan en la superficie del cono de barrido de iones.
  4. Coloque la transferencia de ionestubo en un tubo Falcon de 15 ml que contiene 10 ml de 90% de agua / metanol con ácido fórmico al 0,1%. Después de sonicación el tubo en un baño de ultrasonido de agua durante 20 minutos, se decanta el disolvente en el interior, reemplazarlo con 10 ml de metanol puro y someter a ultrasonidos durante otros 20 minutos. (Si es necesario, la sonicación se puede hacer a 40 ° C o una temperatura aún más alta para lograr mejores resultados de limpieza.)

5. Análisis de CL-EM de datos

  1. Para asegurar la secuencia de muestras se ejecuta sin problemas, después de terminar las dos primeras muestras de la secuencia, compruebe picos de metabolitos desconocidos. Utilice un archivo csv lista nombres de metabolitos, fórmula química neutral y modo de detección (ya sea positivo o negativo), como archivo de entrada y el archivo de salida contiene picos extraídos y error masivo en ppm. Si la forma del pico es anormal o el error de masas es apagado por más de 5 ppm, entonces el resto de la secuencia tiene que ser detenido y solución de problemas que hay que hacer.
  2. Elija el método de la "alineación picoy la extracción de fotograma "en el software disponible en el mercado. Seleccione datos en bruto de LC-MS y los de grupo. Elige muestras en el medio de la secuencia de ejecución como muestra de referencia para el pico de cromatografía de alineación. Subir una semilla marco incluyendo metabolitos conocidos para el análisis de metabolitos apuntado con los datos recogidos y la semilla marco correspondiente.
  3. Lleve a cabo el análisis de datos en modo positivo y negativo por separado. Utilice la configuración predeterminada para otros parámetros. Desactive la función de búsqueda de base de datos y ejecutar el flujo de trabajo. Exportar los datos tratados como una hoja de Excel que contiene el área del pico de cada cuadro. Los primeros conjuntos de marcos corresponden a los metabolitos en la lista de destino. Nota: Para un análisis de metabolitos dirigida, se obtiene la información de los metabolitos en base a los estudios previos 13,15.
  4. Para un análisis de metabolitos no directo, elija el método de "extracción de componentes". Cargue las muestras en blanco para la sustracción de fondo. Establecer pico de intensidad umbral de unt 10 5, ancho de m / z de 10 ppm y relación señal a ruido de 3.
  5. Utilice la base de datos para la identificación humana metabolome compuestos desconocidos. Utilice un filtro de CV para eliminar los componentes con grandes CVs en muestras repetidas. Manualmente a través de cada componente y elegir aquellos con pico bien definido-o relativamente gran diferencia en diferentes tipos de muestras para la búsqueda de base de datos. Exportar datos con hits en la base de datos. (Alineación pico podría ser evitada si la puntuación pico alineación es demasiado baja.)

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Representative Results

La exactitud de la metabolómica datos depende en gran medida del rendimiento del instrumento LC-QE-MS. Para evaluar si el instrumento está operando en buenas condiciones, y si el método aplicado es adecuada, varios picos LC metabolito conocido se extraen de la cromatografía de iones totales (TIC), como se muestra en la Figura 1. Metabolitos polares, incluyendo aminoácidos, productos intermedios de la glucólisis , intermedios TCA, nucleótidos, vitaminas, ATP, NADP + y así sucesivamente tienen una buena retención de las formas de las columnas y el buen pico en la columna de la amida en condiciones de LC actuales. Mientras tanto, una prueba de error de la masa se ​​realiza dentro de las 24 horas después de la calibración de baja masa, como se ilustra en la Figura 2. 6 concentraciones diferentes de muestras por triplicado, se ejecutan dos veces después de la calibración, y toda la gama de tiempo cubre casi 24 horas. El error de masa se evaluó mediante la comparación de la detectada m / z para el teórico m / z de metabolitos específicos. Aquí los metabolitos específicos tienen un m / zque van desde 74 (glicina) a 744 (NADP +). El eje Y aquí representa el porcentaje acumulativo de metabolitos dentro de cierto rango de error de masas. La curva azul muestra el resultado 0-12 hr, mientras que la curva de color rojo muestra los datos recogidos 12-24 horas. Figura 2 indica claramente que más del 90% de los metabolitos se encuentran a 5 ppm en masa de error, que es la masa baja método de calibración de rango desarrollado aquí es suficiente para mantener el error de masa 5 ppm para la detección de bajo rango de masas.

Otro tema a tratar es la sensibilidad del instrumento con el método actual y la configuración del instrumento. Una dilución en serie de muestras por triplicado de 10 cm de placa de Petri se llevó a cabo 5 veces con un factor de dilución de 6, para terminar con 6 concentraciones diferentes de muestras. Estas muestras representan la cantidad de metabolitos extraídos de 10 7, 1,67 x 10 6, 2,78 x 10 5, 4,63 x 10 4, 7,72 x 10 3, y 1,29x 10 3 de las células, respectivamente. Dado que cada concentración de muestra se prepara por triplicado, un total de 18 muestras se analizan en LC-QE-MS. Una lista específica se utiliza para evaluar el número de metabolitos detectados en diferentes para la concentración de la muestra. El resultado en la Figura 3 indica que el número óptimo de metabolitos específicos detectados es entre 2,78 x 10 5 y 1,67 x 10 6 células, mientras que 1 x 10 7 células dan un menor número de metabolitos detectados, que es debido a los efectos de supresión de iones. Este resultado indica que la cantidad óptima de células para extraer de este análisis es más o menos la de un pozo de en una placa de 6 pocillos.

Para el análisis de metabolitos no directo, un CV de corte del 20% y un valor medio de intensidad de 10 7 se usan para filtrar la tabla de componentes. Estos valores umbral CV y ​​de intensidad media rígidas se utilizan para este fin demostración. Para mejorar la reproducibilidad, los valores de corte CV pueden seraumento (por ejemplo, 30%), mientras que los valores medios de intensidad necesitan ser disminuido (por ejemplo, 10 5) para incluir más picos. Después de comprobar manualmente los picos, se seleccionan los componentes con las buenas formas y buscaron en la base de datos metaboloma humano. Los resultados se muestran en la Tabla 2. Tabla 2A se enumeran los resultados de los datos recogidos en modo positivo, mientras que la Tabla 2B muestra los resultados de modo negativo. Algunos de los metabolitos identificados aquí se superponen con los metabolitos en la lista específica, como el glutatión, prolina y así sucesivamente, pero mientras tanto, los metabolitos adicionales de ausencia de la lista específica se exploran, como methyglyoxal, que se puede derivar de la glicólisis, y 1 -palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina, que se detecta en positivo con un tiempo de retención de 3,2 min, que es una retención razonable para los fosfolípidos en una columna de amida. Un protocolo de búsqueda de base de datos no directo metabolito ha sido previously reportado 20.

Figura 1
Figura 1. Ejemplos de picos de cromatografía LC-MS. Aquí, la cromatografía reconstruida se genera con una ventana de masa de 10 ppm (m / z ± 5 ppm). El eje X muestra el tiempo de retención, mientras que el eje Y muestra la intensidad relativa y la intensidad del pico está en la lista por encima de cualquier metabolito. A muestra picos detectados de modo positivo, mientras que B muestra picos de modo negativo. Haz clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 2
Figura 2. 60;. Evaluación de calibración de bajo rango de masas El eje Y es el porcentaje acumulativo de metabolitos con el error de detección de masa dentro de 5 ppm. El eje X es el margen de error en masa en ppm. Curvas azules y rojas representan 0-12 horas y 12-24 horas, respectivamente. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 3
. Figura 3 Evaluación de la cantidad de muestra -. Número de metabolitos específicos detectados en función del número de células HCT 8 plazas rojas representan los metabolitos detectados en modo positivo, círculos azules significan metabolitos medidos en modo negativo, y los triángulos negros son el número total de los metabolitos de los dos modo positivo y negativo. El eje X muestra el número de células HCT 8.upload/51358/51358fig3highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

<td> NA
Normas M / Z, modo positivo M / Z, modo negativo Fórmula neutral Masa neutral
n-butilamina 74.096425 NA C 4 H 11 N 73.089149
Fragmento de cafeína 138.066188 NA C 6 H 8 N 3 O 137.058912
Cafeína 195.087652 NA C 8 H 11 N 4 O 2 194.080376
El diazinón 305.108329 NA C 12 H 20 N 2 O 3 PS 304.101053
Péptido MRFA 524.264966 C 23 H 37 N 7 O 5 S 523.25769
Fluoroacetato N / A 77.004432 C 2 H 3 FO 2 78.011708
Sulfato N / A 96.960106 H 2 SO 4 97.967382
Ácido homovanílico N / A 181.050634 C 9 H 10 O 4 182.05791
Dodecil sulfato N / A 265.147906 C 12 H 26 SO 4 266.155182
Taurocolato N / A 514.2844 C 26 H 45 NO 7 S 515.291676

Tabla 1. Estándares de calibración de masa de baja y su exacta m / z.

<td> 131.05901
CSID Nombre Fórmula Monoisotópico Misa Buscar Misa Error (ppm) RT (min)
234 beta-alanina C 3 H 7 NO 2 89.04800 89.04805 0.62 8.08
1057 Sarcosina C 3 H 7 NO 2 89.04768 89.04805 4.22 8.08
5735 alanina C 3 H 7 NO 2 89.04768 89.04805 4.22 8.08
568 La creatinina C 4 H 7 N 3 O 113.05900 113.05889 1.00 4.41
128566 Proline C 5 H 9 NO 2 115.06333 115.06338 0.41 7.54
6050 L-(+)-Valina C 5 H 11 NO 2 117.07898 117.07896 0.18 7.42
7762 El nitrito de amilo I C 5 H 11 NO 2 117.07898 117.07896 0.18 7.42
135 Ácido valérico 5-amino C 5 H 11 NO 2 117.07900 117.07896 0.38 7.42
242 trimetilglicina C 5 H 11 NO 2 117.07900 117.07896 0.38 7.42
911 Niacinamida C6H6N2O 122.04800 122.04793 0.55 2.60
1091 Taurin C 2 H 7 NO 3 S 125.01466 125.01469 0.20 7.61
1030 Hidroxicarboxílico pirrolina C 5 H 7 NO 3 129.04259 129.04259 0.02 8.51
7127 PCA C 5 H 7 NO 3 129.04259 129.04259 0.02 8.51
90657 N-Acryloylglycine C 5 H 7 NO 3 129.04259 129.04259 0.02 8.51
388752 5-oxo-D-prolina C 5 H 7 NO 3 129.04259 129.04259 0.02 8.51
389257 3-hidroxi-3 ,4-dihidro-2H-pirrol-5-carboxílico C 5 H 7 NO 3 129.04259 129.04259 0.02 8.51
8031176 Ácido pirrolidonacarboxílico C 5 H 7 NO 3 129.04259 129.04259 0.03 8.51
5605 Hidroxiprolina C 5 H 9 NO 3 131.05824 131.05901 5.83 8.08
7068 N-Acetylalanin C 5 H 9 NO 3 131.05824 5.83 8.08
79449 Ac-Ala-OH C 5 H 9 NO 3 131.05824 131.05901 5.83 8.08
89122 Ethylformylglycine C 5 H 9 NO 3 131.05824 131.05901 5.83 8.08
167744 L-glutámico-gamma-semialdehído C 5 H 9 NO 3 131.05824 131.05901 5.83 8.08
388519 -5-amino 2-oxo-pentanoico C 5 H 9 NO 3 131.05824 131.05901 5.83 8.08
134 El ácido aminolevulínico C 5 H 9 NO 3 131.05800 131.05901 </ Td> 7.70 8.08
9312313 3-hidroxi-L-prolina C 5 H 9 NO 3 131.05800 131.05901 7.70 8.08
566 La creatina C 4 H 9 N 3 O 2 131.06900 131.06905 0.36 8.08
5880 L-(+)-Leucina C 6 H 13 NO 2 131.09464 131.09455 0.68 6.96
6067 L-(+)-Isoleucina C 6 H 13 NO 2 131.09464 131.09455 0.68 6.96
19964 L-norleucina C 6 H 13 NO 2 131.09464 131.09455 0.68 6,96 </ Td>
388796 beta-Leucina C 6 H 13 NO 2 131.09464 131.09455 0.68 6.96
548 El ácido aminocaproico C 6 H 13 NO 2 131.09500 131.09455 3.48 6.96
6031 L-(-)-Asparagina C 4 H 8 N 2 O 3 132.05350 132.05348 0.10 8.31
109 Ácido ureidopropiónico C 4 H 8 N 2 O 3 132.05299 132.05348 3.71 8.31
6026 L-ornitina C 5 H 12 N 2 O 2 132.08987 132.08988 0.02 10.37
64236 D-ornitina C 5 H 12 N 2 O 2 132.08987 132.08988 0.02 10.37
5746 Glutamina C 5 H 10 N 2 O 3 146.06914 146.06900 0.93 8.25
128633 D-glutamina C 5 H 10 N 2 O 3 146.06914 146.06900 0.93 8.25
141172 Ácido Ureidoisobutyric C 5 H 10 N 2 O 3 146.06914 146.06900 0.93 8.25
21436 N-metil-D <scp> </ SCP> ácido-aspártico C 5 H 9 NO 4 147.05316 147.05300 1.13 8.06
21814 D-- ácido-glutámico () C 5 H 9 NO 4 147.05316 147.05300 1.13 8.06
30572 L-ácido (+)-glutámico C 5 H 9 NO 4 147.05316 147.05300 1.13 8.06
58744 N-acetil-L-serina C 5 H 9 NO 4 147.05316 147.05300 1.13 8.06
5907 L-(-)-metionina C 5 H 11 NO 2 S 149.05106 149.05095 0.70 7.39
6038 La histidina C 6 H 9 N 3 O 2 155.06947 155.06940 0.48 8.33
5910 L-(-)-fenilalanina C 9 H 11 NO 2 165.07898 165.07887 0.63 6.60
1025 Piridoxina C 8 H 11 NO 3 169.07390 169.07376 0.80 3.24
4463 Oxidopamine [USAN: INN] C 8 H 11 NO 3 169.07390 169.07376 0.80 3.24
102750 5 - (2-aminoetil)-pirogalol C 8 H 11 NO 3 169.07390 169.07376 0.80 3.24
388394 La norepinefrina C 8 H 11 NO 3 169.07390 169.07376 0.80 3.24
6082 L-(+)-arginina C 6 H 14 N 4 O 2 174.11168 174.11144 1.39 10.77
64224 D-Arg C 6 H 14 N 4 O 2 174.11168 174.11144 1.39 10.77
780 heteroauxina C 10 H 9 NO 2 175.06300 175.06304 0.18 2.32
67261 Indol-3-acetaldehído, 5-hidroxi- C 10 H 9 NO 2 175.06332 175.06304 1.65 2.32
3574185 Indol-2-acético C 10 H 9 NO 2 175.06332 175.06304 1.65 2.32
5833 L-(-)-tirosina C 9 H 11 NO 3 181.07390 181.07378 0.66 7.48
389285 3-amino-3-(4-hidroxifenil) propanoico C 9 H 11 NO 3 181.07390 181.07378 0.66 7.48
13628311 L-treo-3-fenilserina C 9 H 11 NO 3 181.07390 181.07378 0.66 7.48
425 4-hidroxi-4-(3-piridil) butanoico C 9 H 11 NO 3 181.07401 181.07378 1.25 7.48
13899 3 - ácido acrílico (1H-indol-3-il) C 11 H 9 NO 2 187.06332 187.06330 0.15 6.44
10607876 Ácido indolacrílico C 11 H 9 NO 2 187.06332 187.06330 0.15 6.44
389120 N6, N6, N6-trimetil-L-lisina C 9 H 20 N 2 O 2 188.15248 188.15221 1.45 10.87
388321 5 "-S-metil-5"-thioadenosine C 11 H 15 N 5 O 3 S 297.08957 297.08898 2.00 2.56
144 9 - (5-s-metil-5-thiopentofuranosyl)-9H-purin-6-amina C 11 H 15 N 5 O 3 S 297.09000 297.08898 3.43 2.56
111188 El glutatión C 10H 17 N 3 O 6 S 307.08380 307.08345 1.14 8.02

Tabla 2A.

5 H 9 NO 3 11 H 19 NO 9
CSID Nombre Fórmula Monoisotópico Misa Buscar Misa Error (ppm) RT (min)
857 Metilglioxal C 3 H 4 O 2 72.02100 72.02108 1.03 7.70
1057 Sarcosina C 3 H 7 NO 2 89.04768 89.04747 2.33 8.19
5735 alanina C 3 H 7 NO 2 89.04768 89.04747 2.33 8.19
234 beta-alanina C 3 H 7 NO 2 89.04800 89.04747 5.93 8.19
55423 Ácido R-láctico C 3 H 6 O 3 90.03169 90.03143 2.91 5.12
61460 Hidroxipropiónico C 3 H 6 O 3 90.03169 90.03143 2.91 5.12
96860 L-ácido (+)-láctico C 3 H 6 O 3 90.03169 90.03143 2.91 5.12
592 Ácido láctico C 3 H 6 O 3 90.03200 90.03143 6.29 5.12
650 Dihidroxiacetona C 3 H 6 O 3 90.03200 90.03143 6.29 5.12
731 Gliceraldehído C 3 H 6 O 3 90.03200 90.03143 6.29 5.12
1086 Ácido sulfúrico H 2 O 4 S 97.96738 97.96683 5.63 8.13
128566 Proline C 5 H 9 NO 2 115.06333 115.06302 2.67 7.78
1078 El ácido succínico C 4 H 6 O 4 118.02661 118.02630 2.66 7.72
466979 Erythrono-1 ,4-lactona C4 H 6 O 4 118.02661 118.02630 2.66 7.72
4483398 D-eritrónico g-lactona C 4 H 6 O 4 118.02661 118.02630 2.66 7.72
473 El ácido metilmalónico C 4 H 6 O 4 118.02700 118.02630 5.96 7.72
8527138 (3S, 4R) -3,4-Dihydroxydihydrofuran-2 (3H)-ona C 4 H 6 O 4 118.02700 118.02630 5.96 7.72
140384 Ácido 2-ketocaproic C 6 H 10 O 3 130.06299 130.06270 2.24 2.35
164251 Ácido Methyloxovaleric C 6 H 10 O 3 130.06299 130.06270 2.24 2.35
388419 (3S)-2-oxo-pentanoico-3-metílico del ácido C 6 H 10 O 3 130.06299 130.06270 2.24 2.35
15642233 Cetoleucina C 6 H 10 O 3 130.06299 130.06270 2.24 2.35
46 ácido a-Oxo-b-metilvalérico C 6 H 10 O 3 130.06300 130.06270 2.36 2.35
69 Ácido alfa-ketoisocaproic C 6 H 10 O 3 130.06300 130.06270 2.36 2.35
134 El ácido aminolevulínico 131.05800 131.05795 0.36 8.19
9312313 3-hidroxi-L-prolina C 5 H 9 NO 3 131.05800 131.05795 0.36 8.19
5605 HIDROXIPROLINA C 5 H 9 NO 3 131.05824 131.05795 2.23 8.19
7068 N-Acetylalanin C 5 H 9 NO 3 131.05824 131.05795 2.23 8.19
79449 Ac-Ala-OH C 5 H 9 NO 3 131.05824 131.05795 2.23 8.19
89122 Ethylformylglycine C 5 H 9 NO 3 131.05824 131.05795 2.23 8.19
167744 L-glutámico-gamma-semialdehído C 5 H 9 NO 3 131.05824 131.05795 2.23 8.19
388519 -5-amino 2-oxo-pentanoico C 5 H 9 NO 3 131.05824 131.05795 2.23 8.19
5880 L-(+)-Leucina C 6 H 13 NO 2 131.09464 131.09419 3.39 7.09
6067 L-(+)-Isoleucina C 6 H 13 NO 2 131.09464 131.09419 3.39 7.09
19964 L-norleucina C 6 H 13 NO 2 131.09464 131.09419 3.39 7.09
388796 beta-Leucina C 6 H 13 NO 2 131.09464 131.09419 3.39 7.09
548 El ácido aminocaproico C 6 H 13 NO 2 131.09500 131.09419 6.18 7.09
109 Ácido ureidopropiónico C 4 H 8 N 2 O 3 132.05299 132.05321 1.60 8.28
6031 L-(-)-Asparagina C 4 H 8 N 2 O 3 132.05350 132.05321 2.21 8.28
6026 L-ornitina C 5 H 12 N 2 O 2 132.08987 132.08961 1.98 10.36
64236 D-ornitina C 5 H 12 N 2 O 2 132.08987 132.08961 1.98 10.36
193317 L-- ácido málico-() C 4 H 6 O 5 134.02153 134.02130 1.72 7.95
510 (±)-Ácido málico C 4 H 6 O 5 134.02200 134.02130 5.25 7.95
133224 ácido treónico C 4 H 8 O 5 136.03717 136.03688 2.14 7.70
388628 Ácido 2,3,4-Trihydroxybutanoic C 4 H 8 O 5 136.03717 136.03688 2.14 7.70
2061231 DL-ácido eritrónico C 4 H 8 O 5 136.03717 136.03688 2.14 7.70
21436 N-metil-D <scp> </ SCP> ácido-aspártico C 5 H 9 NO 4 147.05316 147.05299 1.16 8.05
21814 D-- ácido-glutámico () C 5 H 9 NO 4 147.05316 147.05299 1.16 8.05
30572 L-ácido (+)-glutámico C 5 H 9 NO 4 147.05316 147.05299 1.16 8.05
58744 N-acetil-L-serina C 5 H 9 NO 4 147.05316 147.05299 1.16 8.05
6038 La histidina C 6 H 9 N 3 O 2 155.06947 155.06930 1.09 8.36
199 Alantoína C 4 H 6 N 4 O 3 158.04401 158.04387 0.88 4.76
6082 L-(+)-arginina C 6 H 14 N 4 O 2 174.11168 174.11154 0.80 10.76
64224 D-Arg C 6 H 14 N 4 O 2 174.11168 174.11154 0.80 10.76
58576 Ácido N-acetil-L-aspártico C 6 H 9 NO 5 175.04807 175.04803 0.18 7.87
996 Ácido pirofosfórico H 4 O 7 P 2 177.94299 177.94331 1.79 8.42
5589 Glucosa C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
17893 Manosa C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
58238 . Beta-D-glucopiranosa C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
71358 . Alfa-D-glucopiranosa C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
134838 Ácido 3-desoxi-arabino-hexonic C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
388332 L-sorbopiranosa C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
388476 beta-D-galactopiranosa C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
388480 . Alfa-D-galactopiranosa C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
388775 beta-D-fructofuranosa C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
10239179 El inositol C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
16736992 Cis-inositol C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
17216070 alosa C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
17216093 L-sorbosa C 6 H 12 O 6 180.06339 180.06346 0.41 7.53
201 hexopiranosa C 6 H 12 O 6 180.06300 180.06346 2.53 7.53
868 1,2,3,4,5,6-Cyclohexanhexol C 6 H 12 O 6 180.06300 180.06346 2.53 7.53
2068 La teofilina C 7 H 8 N 4 O 2 180.06473 180.06346 7.04 7.53
4525 1,7-dimetil-xantina C 7 H 8 N 4 O 2 180.06473 180.06346 7.04 7.53
5236 Teobromina C 7 H 8 N 4 O 2 180.06473 180.06346 7.04 7.53
1161 ácido isocítrico C 6 H 8 O 7 192.02701 192.02704 0.15 8.18
305 Ciácido gástrico C 6 H 8 O 7 192.02699 192.02704 0.23 8.18
963 ácido pantoténico C 9 H 17 NO 5 219.11067 219.11049 0.84 6.72
6361 Ácido D-pantoténico C 9 H 17 NO 5 219.11067 219.11049 0.84 6.72
960 ácido palmítico C 16 H 32 O 2 256.23999 256.24000 0.05 1.73
111188 El glutatión C 10 H 17 N 3 O 6 S 307.08380 307.08339 1.35 8.03
388337 Ácido N-acetilneuramínico 309.10599 309.10585 0.45 7.43
392681 Ácido N-acetil-alfa-neuramínico C 11 H 19 N º 9 309.10599 309.10585 0.45 7.43
392810 Neu5Ac El ácido siálico C 11 H 19 N º 9 309.10599 309.10585 0.45 7.43

Tabla 2B.

. Tabla 2 Lista de los metabolitos detectados no focalizados en HCT 8 células (equivalencia 2,78 x 10 5 células) Tabla 2A y 2B incluye los componentes de extracción de información:. Tiempo de retención, m / z y el error en masa, y mientras tanto, los resultados de búsqueda de base de datos: Propiedades físicas de identificación ( CSID), nombre, fórmula, y así sucesivamente. Aquí las muestras analizadas son ecuacionesl a metabolitos extraídos de 2,78 x 10 5 células, y el umbral de intensidad es de 1 x 10 7 para evitar resultado tedioso para objetivo demostración.

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Discussion

Los pasos más críticos para el metabolito de perfiles éxito en células utilizando este protocolo son: 1) controlar el medio de crecimiento y cuidadosa extracción de las células; 2) ajustar el método LC basado en configuración de métodos MS para asegurar que hay suficientes generalmente por lo menos 10) puntos de datos (a través de un pico para la cuantificación; 3) hacer una calibración de baja masa antes de ejecutar muestras; 4) la inyección de no más de 5 ml para evitar tiempo de retención desplazamiento y ensanchamiento de los picos causado por el agua; y 5) la preparación y la ejecución de ejemplos para la comparación en el mismo lote para minimizar los efectos de lote.

Los estándares (Tabla 1) elegido en este caso para la calibración de gama baja masa son intercambiables. Cualquier compuesto conocido con un m / z que cae en el rango de exploración en masa, se comporta bien en una fuente de H-ESI, y es soluble en agua, metanol o acetonitrilo son candidatos razonables para los estándares de calibración. Es muy recomendable para almacenar todas las soluciones de calibración de unT 4 ° C para estabilizar la cafeína y también para minimizar la evaporación de metanol o acetonitrilo en la solución de calibración de manera que el rendimiento de calibración puede ser más reproducible. En comparación con un rango de masa regular, m / z de 150 a 2000, la calibración de bajo rango de masas que hay que hacer con más frecuencia, al menos una vez cada dos días.

Este flujo de trabajo, desde la extracción por solventes, disolventes de la reconstitución, la fase móvil LC, a la calibración rango de masa baja y Estados miembros de exploración gama ha sido optimizado para medir metabolitos polares. Esto incluye aminoácidos, acetilo aminoácidos, productos intermedios de la vía glucólisis, nucleósidos, productos intermedios del ciclo del TCA, algunos productos intermedios de la vía del metabolismo de un carbono y así sucesivamente. Sin embargo, las modificaciones de este protocolo para las demás clases de metabolitos, como las especies coenzima A (CoA), folatos, los fosfolípidos son posibles. Por ejemplo, CoAs son más estables en condiciones ácidas, por lo que la adición de un ácido a 80% de metanol / agua será útil para impsensibilidad rove CoA. También, CoAs y lípidos tienden a tener mucho grandes pesos moleculares, así el rango de exploración m / z necesita ser ajustado 60 a 900 con el rango adecuado que permita cubrir esos metabolitos.

A pesar de que algunos de los resultados de búsqueda de bases de datos no orientados componente se superponen con la lista específica, sigue siendo de importancia para construir esta lista específica en base a la prioridad de la investigación. Dado que los metabolitos en la lista específica son más bajas que el umbral de intensidad media, información sobre estos metabolitos se eliminará durante el procesamiento. La lista específica incluye la información de tiempo de retención, lo que nos da mayor confianza para la identificación y cuantificación de metabolitos. Una ventaja adicional con la configuración de QE-MS es que la espectrometría de masas en tándem puede permitir una mayor identificación de los metabolitos.

Un problema asociado a este flujo de trabajo es que la aguja H-ESI inseRT es sensible al contenido de sal de las muestras, como la sensibilidad se verá comprometida en gran medida si hay grandes cantidades de sales no volátiles. Por lo tanto, lo que minimiza el contenido de sal de las muestras, y la limpieza de rutina de la columna y la inserción de la aguja H-ESI será útil para asegurar que los datos de buena calidad y aumentar la vida útil de la columna.

En resumen, este protocolo emplea LC-QE-MS para analizar con éxito los metabolitos polares a partir de células cultivadas, con los pasos de preparación de muestras mínimas y adquisición de datos rápida. Pequeñas modificaciones en preparación de la muestra se pueden llevar a cabo para obtener datos de otras fuentes biológicas tales como suero y tejido. Por ejemplo, desde metanol puro se puede añadir al suero líquido añadido para hacer una concentración final de metanol al 80% para la extracción de metabolitos polares. Para las muestras de tejido, se requiere agitación rigurosa y mezcla para lograr una mejor eficiencia de la extracción. Por lo general, 10 ml de suero o1 mg de tejido es suficiente para el análisis de metabolitos. Los datos en bruto pueden ser analizados tanto en el modo dirigido, si existen metabolitos conocidos en las muestras, y de una manera orientada ONU seguido por HRMS búsqueda de base de datos. Metabolómica basada HRMS se encuentra todavía en sus primeras etapas. Para los futuros avances, las técnicas experimentales se pueden optimizar aún más, la información adicional HRMS metabolitos y patrones de fragmentación MS / MS serán algoritmos útiles y pertinentes, como la alineación de pico, pico de la integración, la agrupación de isótopos y así sucesivamente, puede mejorar la eficiencia y precisión de el procesamiento de datos. En última instancia, sin embargo, muchas de las preguntas que nuestras direcciones de laboratorio en el metabolismo son limitados por una cuidadosa interpretación de los datos después del procesamiento. Con estas técnicas de metabolómica en gran escala, a menudo se nos limitados por nuestra interpretación de los datos y la evaluación de hipótesis generadas. Por lo tanto, todos los metabolómica experimentos necesitan ser formuladas en torno a cuestiones específicas.

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Disclosures

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Acknowledgements

Los autores desean agradecer Detlef Schumann, Jennifer Sutton (Thermo Fisher Scientific) y Nathaniel Snyder (Universidad de Pennsylvania) valiosa para los debates sobre la calibración de masas y el procesamiento de datos. Las investigaciones realizadas en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional del Cáncer de los Institutos Nacionales de la Salud con el número Premio R00CA168997. El contenido es de exclusiva responsabilidad de sus autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Positive calibration mix Thermo Scientific #88323 It is light sensitive. Store at 4 °C
Negative calibration mix Thermo Scientific #88324 Store at 4 °C
Diazinon Sant Cruz Biotechnology #C0413 It causes eyes irritation, so work in hood. Store at 4 °C
H-ESI needle insert Fisher Scientific #1303200 This could be replaced or cleaned with 5% formic acid/water (remove rubber ring) if clogged.
Xbridge amide column Waters #186004860 Guard column is recommend to increase column lifetime.

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References

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