Diagnostikk klarert Intakte biologiske systemer på cellenivå ved 3DISCO

Neuroscience
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Ertürk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging Cleared Intact Biological Systems at a Cellular Level by 3DISCO. J. Vis. Exp. (89), e51382, doi:10.3791/51382 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Histologisk undersøkelse av biologiske vev er en fundamental tilnærming i forståelsen av molekyler / celler i sin naturlige sammenheng. Ideelt sett er høyoppløselig avbildning av hele organet mest informative og ønsket. Fordi lyset har en begrenset inntrengningsdybde, på grunn av spredning 1, faste organer må være seksjonert for å utføre høy oppløsning mikroskopisk avbildning. Derfor er de fleste av de histologiske undersøkelser utført på noen få vevssnitt representerer bare en liten del av organet. I noen studier, for eksempel, de som tar sikte på å finne fram nevrale forbindelser i hjernen eller ryggmargen, alle vev seksjoner fra målet organer blir innsamlet og fotografert for en 3D-rekonstruksjon. Men vev seksjonering og påfølgende avbildning av enkelte delene har ulike begrensninger. Disse inkluderer å være tidkrevende, og fører til en ufullstendig 3D gjenoppbygging av vev, på grunn av mekaniske forstyrrelser og vanskeligkaper i justeringen av de resulterende bildene.

Nylig, har avregnings-og bildebehandling intakte gjennomsiktige organer blitt utviklet som en betydelig løsning på dette brist 2,3. Ved avregning, er hele organet gjengis transparent, slik at avbildnings lyset å reise ende-til-ende (figur 1) for å frembringe bilder med høy oppløsning av det innlagt organ ved hjelp av et laser scanning mikroskop for eksempel en fler foton-eller lys-ark mikroskop ( figur 2). Ulike forskningsmiljøer har utviklet nye vev clearing protokoller for å være i stand til bildet sitt vev av interesse for ulike formål. Disse inkluderer organisk løsemiddel 2-5, vann 6,7 og elektroforese basert åtte clearing protokoller. Blant dem, tre-dimensjonal avbildning av oppløsningsmiddel fjernet organer eller 3DISCO er et lett anvendelig protokoll på en rekke forskjellige biologiske prøver, inkludert sentralnervesystem (CNS) organer, immunsystemet og faste tumorer. I addition, kan det bli kombinert med forskjellige mikroskopi teknikker som lys ark fluorescensmikroskopi (LSFM), multi foton og konfokal laser-skanning mikroskopi. 3DISCO er basert på rydding med lett tilgjengelige og rimelige reagenser slik som tetrahydrofuran (THF) og dibenzyl-eter (DBE) 4.. Hele protokollen kan ta så kort som 3-4 timer. Dermed er 3DISCO en robust og effektiv teknikk sammenlignet med tradisjonelle histologiske metoder som kan ta uker eller måneder for å fullføre 9..

Protocol

Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med IACUC (Institutional Animal Care og bruk Committee) forskrift om mus ~ 3-5 måneder gamle. Forfatteren erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

En. Animal Perfusjons og Vevpreparerina

Timing: 30-60 min per mus + post-fiksering (noen timer til over natten).

  1. Vei dyret og anesthetize ved hjelp av ketamin (80 til 200 mg / kg) og xylazin (7-20 mg / kg) eller 2,5% avertin (0,5 ml/25 g kroppsvekt IP).
  2. Vent noen minutter for anestesi å ta fullstendig effekt.
  3. Knip på tå og halen på dyret for å være sikker på at dyret er fullt bedøvet.
  4. Perfuse dyret først ved RT med 0,1 M fosfatbuffer (PB) eller i 0,1 M fosfatbuffer saltvann (PBS) i 5-10 min til blodet er helt fjernet fra vevet.
  5. Slå perfusjon til fiksativ løsning: 4% PFA i 0,1 M PB (eller 0,1 M PBS) og fortsette perfusjonmed 4% PFA i 30-40 min ved en hastighet på 3 ml / min.
  6. Dissekere organ / s av interesse nøye uten å skade, for eksempel, unngå punktering og klemme vevet som blir dissekert.
  7. Fjern det ekstra vev som omgir organene (bindevev, meninges eller dura stoffer) i en petriskål fylt med PBS.
  8. Post-fikse organene i 4% PFA for noen time eller over natten ved 4 º C. Unngå lange post-fikseringen på grunn PFA kan slukke signalet eller øke autofluorecense overtid 10 spesielt for GFP kanal (som er en mindre problem i røde og langt røde kanaler).
  9. Vask organene 2-3x med PBS ved RT like før du starter clearing prosedyre.

2. Tissue Clearing

Timing: 2-3 timer for små organer og 1-4 dager for store organer.

Merknader: Den fluorescerende merking av vev av transgene uttrykk, viral transfeksjon, fargestoff sporing eller antiKroppen merking skal være avsluttet før rydding. Alle vev clearing trinnene er utført ved RT. Clearingløsninger THF, DBE, Babb (en del benzylalkohol og 2 del benzylbenzoat) og diklormetan er giftige og innånding (utføre eksperimenter i godt ventilert avtrekkshette) og direkte kontakt med huden bør unngås (bruk nitrilhansker).

  1. Forbered 50% (vol / vol), 70% og 80% THF fortynninger i destillert vann i separate glassflasker som følger: Til 50% THF, f.eks, bland 25 ml THF og 25 ml destillert vann i en glassflaske med volum på større enn 50 ml.
  2. Bland løsninger ved å forsiktig riste flasken for en 1-2 min.
  3. Merke glassflaske klart.
  4. Trygt lukker flaskene og holde arbeidsløsninger i et mørkt skap. For best resultat bør du ikke bruke de samme arbeidsløsninger lengre enn 1-2 uker. Derfor bestiller clearingløsninger som den minste volum tilgjengelig for å kunne bruke ferske aksje reagenser.
  5. Fyll hetteglass (f.eks 2-3 ml) med den første clearingløsning, 50% THF, og overføre organer fra PBS i hetteglass for å starte rydding.
  6. Trygt lukke hetteglass med deres lokk og bruke en rotator (f.eks, et hjul rører) for røring.
  7. Bruk aluminiumsfolie for å dekke og holde glasshetteglassene i mørket. Start rotator omrøres prøvene i hetteglass for den angitte tid (tabell 1) ved en konstant hastighet (~ 30 rpm).
  8. Fjern rydde løsning og tilsett den neste i protokollen når tiden i tabell 1 er fullført.
  9. Samle clearing avfall i containere glassavfall som er holdt i en hette.
    Gjenta foregående trinn for hver lysning løsning i protokollen til slutten. Bruk en ny Pasteur pipette når en ny clearingløsning tilsettes (for eksempel endring fra THF til DBE).
  10. På den siste clearing takt med BABB eller DBE, kan de inkubasjonstidene forlenges eller shortened før prøvene blir helt gjennomsiktig i synlig lys (eller gulaktig / gjennomsiktig hvis det er en veldig stor vev som hjernen).
  11. Hold ryddet organer i den endelige clearingløsning til alle tider, inkludert bildebehandlings trinn.

Tre. Forbereder Slettet Organer for Imaging

Timing: 5-15 min.

Merk: Bilde de ryddet organer så snart en komplett rensing oppnås. For dette formål, følg de neste trinnene for å forberede prøver for lys-ark mikroskopi (f.eks ultramicroscopy) eller konfokalmikroskoper / multi-foton mikroskopi bildebehandling.

Merk: Slettet organer vil miste sin fluorescens styrke over tid (spesielt fluorescerende proteiner f.eks GFP; antistoff merking er mer motstandsdyktig og kan også gi bedre resultater med lengre inkubasjoner). For avbildning, kan forskjellige fluorescerende mikroskopi-teknikker bli brukt så lenge som riktig håndtering av organene i clearing-løsning er oppnådd.

  1. For lys-ark mikros
    1. Plasser eller montere prøven hensiktsmessig.
    2. Fest ryddet organ manuelt ved å dreie skruen av prøven holder fire.
    3. Dypp prøven i avbildningskammeret (fortrinnsvis laget av glass) av thelight ark mikroskop som er fylt med BABB eller DBE, avhengig av hva som ble brukt ved den siste avregnings trinn.
  2. For multi foton / konfokalmikroskopi
    1. Monter prøven på en avbildningsskyveren (eller et avbildningskammer) med den endelige avbildning løsning for å være i stand til bilde med en fler foton eller konfokal mikroskopi, som typisk bruker olje eller vann nedsenket mål.
    2. Bruk dental sement for å gjøre en ramme rundt vevet.
    3. Fylle bassenget med BABB eller DBE like før dental sement blir fullt rigid.
      Merk: dental sement størkner raskt; øve et par ganger for å bli kjent med det før du prøver selve prøvene.
    4. Umiddelbart plassereryddet prøven i midten av bassenget og dekke den med et dekkglass.
    5. Trykk på dekkglass til den er helt avtettet ved hjelp av dental sement og rører ved overflaten av den erte organ, noe som gjør det mulig å nå den maksimale bildedybden ved konfokal / multifotonmikroskopi.
      Merknader: Dette sikrer at ingen clearing løsningen vil bli sølt under bildebehandling. Unngå å dyppe bildebehandling objektivet direkte mot clearingløsning, noe som kan skade linsen med mindre det er motstandsdyktig mot BABB / DBE eller har et beskyttende deksel.

4. Diagnostikk klarert Organs

Timing: 15-45 min.

  1. Samle en z-scan dekker hele ryddet vev (hvis brukt objektivet tillater) på den beste oppløsningen som mikroskopet kan levere.
  2. Zoome inn på områder av interesse å samle bilder med høyere oppløsning.

5. Undersøkelse av data med Software Amira

  1. Laste bildet series til programvare Amira med ResolveRT modul.
  2. Oppgi riktige voxel størrelser i "Image Les Parameter"-vinduet, og trykk ok.
  3. Velg "Multi høvel View" sub-program. Deretter bruker "tykkelse" glidebryteren for å velge den optimale terskelen for de grå verdier, justering av 2D-og 3D-verdier.
  4. Visual prøven ved å surfe på skiver i ulike 2D-orientering og bruk av crop-hjørnemodul i 3D-visning.
    Merk: Du finner en detaljert feilsøkingsguiden av protokollen i Erturk et al fire.

Representative Results

Nerveceller er sterkt polarisert celler med ekstremt lang morfologi. Deres funksjon er avhengig av de forbindelser som de danner mellom hverandre og med andre vev. Derfor kartlegger strukturelle organiseringen av nervecellene er ekstremt viktig for å forstå hvordan de fungerer i helse og sykdom. Men tracing slike enorme nevrale forbindelser gjennom hele nervesystemet-nylig kåret connectomics 11 - fremdeles en av de vanskeligste utfordringene i nevrovitenskap. For å oppnå dette, har både EU 12 og US 13 igangsatt store prosjekter for å kartlegge den menneskelige hjerne.

Mens 3DISCO kan være ansatt på ulike organer, har det vært spesielt nyttig å spore lange nevrale forbindelser i ryggmargen og hjernen. For eksempel bruker ultramicroscopy skanninger av store ryddet ryggmargssegmenter, de aksonale tilkoblinger kan følges over centimeter i gnager ryggmargen (Figur 2). På lignende måte kan hele erte musehjerne (figur 3a) og hippocampus (figur 3b) avbildes å følge neuronal forbindelser i hjernen.

Når confocal eller multi fotonmikroskopi blir brukt på ryddet organer, kan avbildningsoppløsningen bli betydelig forbedret, spesielt i z-dimensjonen. For eksempel, multi foton avbildning av ryddet ryggmargen fra GFP-M linje mus (Figur 4a) oppnår en sømløs image gjennom hele dybden (~ 1,5-2 mm) av ryggmargen. Konfokalmikroskoper microcopy på ryddet ryggmarg gir bedre oppløsning på en lignende måte (Tall 4b og c). Multi foton mikros avbildning av ryddet hjerner leverer svært høy oppløsning for å visualisere fine detaljene i nevronale strukturer inkludert dendrittutløperne (figur 5). Prøvene til 3DISCO kan merkes på forskjellige måter, inkludert transgene uttrykk, viral transfeksjon, fargestoff sporing og antistoff merking. For eksempel er det mulig å merke hele blodkar i hjernen (Fig. 6a og b), og ryggmargen (figurene 6c og d) under anvendelse av lektin konjugerte fluorescerende tracere 4, som kan brukes til å studere blod-hjerne-barrieren (BBB ) i helse og sykdom.

Begge mikroglia og astrocytter er sterkt innblandet i patologi nevrodegenerasjon inkludert Alzheimers sykdom og traumatiske skader 14,15. Ved hjelp 3DISCO, kan deres tetthet og fordeling i ryggmargen (figur 7) eller hjerne skal studeres.

Ikke-neuronale vev kan også avbildes. For eksempel kan Clara celler i hele gnager lungene bli immunolabeled med antistoffer og avbildes uten snitting i en enkeltcelle-nivå (fig. 8). Tilsvarende er det mulig å klare og bildet celler f.eksalfa-celler i det innlagt pankreas vev (Figur 9).

Figur 1
Figur 1. 3DISCO vev clearing gjengir innlagt vev gjennomsiktige for dype vev bildebehandling. Innskuddet (a) og ryddet (b) ryggmargen vev som er sett av synlig lys. Ved clearing, blir dype vev laser-scanning mikros mulig. (C) uncleared og ryddet ryggmargs vev ble fotografert av to-foton mikroskopi. Scale barer i a, b = 0,5 mm og i c = 100 mikrometer.

Fig. 2
Figur 2. 3DISCO avbildning av ryggmargen til å følge aksonal forlengelse. The ryggmarg dissekert fra Thy-1-GFP transgen muselinje (GFP-M) er delt i mindre deler (~4 mm). Etter å ha fulgt clearing protokoll for små vev (Tabell 1) de gjennomsiktige ryggmargen ble visualisert ved hjelp ultramicroscopy. 3D-rekonstruksjoner av en ~ 4 mm ryggmargssegmentet i horisontal (a), koronal (b), og sagittal vis (c). (D) Representant spores axoner (rød) er vist i gråtoner gjennomsiktig visning. (E) høy forstørrelse visning av den indikerte regionen i (d). Skala stolper i a, b, c, d = 0,5 mm, og i e = 20 mikrometer.

Figur 3
Figur 3. 3DISCO avbildning av ryddet hjernen og hippocampus. Eksempler ryddet hjerner og hippocampi av GFP-M mus ble fotografert med en ultramicroscope. 3D-visualiseringer av hele hjernen (a) og hippocampus (b) demonstrerer neuronal netwoRKS i de fotografert transparente vev. Scale barer i a = 2 mm og i b = 20 mikrometer.

Figur 4
Fig. 4. Tissue lysning forbedrer oppløsningen oppnådd ved multi foton og konfokal mikroskopi. Transparente ryggmargs segmenter fra GFP-M mus avbildes ved multi foton (a) eller konfokal mikroskopi (b, c). Merk at clearing vesentlig forbedrer oppløsningen og bildedybde avsløre den fine strukturen av axoner og dendritter. Skala bar på a = 100 pm, og i b, c = 20 mikrometer.

Figur 5
Figur 5. 3DISCO avbildning av dendrittutløperne. Transparent hjernevev fra GFP-M mus fotografert av multi foton. 3D-visualiseringer av skannede cortex regionen presenteres i vertiske (a) og horisontale perspektiv (b). (C) ~ 50 mikrometer projeksjon fra de angitte nivåer i (a, b). (D) høy forstørrelse av den indikerte regionen i (c) som viser de fine detaljene i de neuronale strukturer inkludert dendrittutløperne (pilspisser). Scale barer i en = 50 mikrometer, i b, c = 25 mikrometer, i d = 5 mikrometer.

Figur 6
Figur 6. 3DISCO av blodkar. For å markere blodårene i hele organer, ble lektin-FITC fargestoff som brukes i løpet av perfusjon (før avregning) som beskrevet 16. Det er bemerkelsesverdig å nevne at vi har funnet at haleveneinjeksjon av sporstoffet gir bedre signal over kardial perfusjon av tracer. Etter å samle de faste hjernen og ryggmargen, ble de fjernet og jegmaged av ultramicroscopy. 3D-visualisering av hele musen hjernen blodkar i heatmap (a) og grå-skala (a). (B) 3D-visualisering av blodkar i en mus ryggmargssegmentet i heatmap (c) og grå-skala (d). De Heat ble generert basert på intensiteten av lektin flekker; blå: lav intensitet (bakgrunn) og rød: høy intensitet (blodkar). Scale barer i a = 2 mm, b = 1 mm, og i c, d = 250 mikrometer.

Figur 7
Figur 7. 3DISCO av gliaceller celler i ryddet CNS vev. Den ryggmargen av transgene mus som uttrykker GFP i mikroglia tGH (CX3CR1-EGFP) eller astrocytter TGN (hGFAP-ECFP) ble ryddet og fotografert av multi foton mikroskopi. 3D-gjengivelse av microglia er vist som underlag volum visualisering (a) og gjennomsiktig visning ( (C) En optisk projeksjon (~ 50 mikrometer) er presentert for å vise detaljene i mikroglia i ryggmargen. 3D-rendring av astrocytter er vist som overflatevolumvisualisering (a) og gjennomsiktig vis (b). (F) En optisk projeksjon (~ 50 mikrometer) er presentert for å vise detaljene i astrocytter i ryggmargen. Skala stolper i a, b, d, e = 100 mikrometer og i C, F = 50 mikrometer.

Figur 8
Figur 8. 3DISCO av en hel-mount lunge lapp med antistoffarging av clara celler. For hele-mount antistoffarging av lungelapper, ble 10 uker gamle BALB / C hunnmus perfundert gjennom høyre ventrikkel med PBS for å fjerne blod fra lungene. Lungene ble deretter blåst opp med 4% PFA og fast O / N ved RT i fiksativ minst tre ganger volumet av the vev. Neste dag, ble lungene kort skylt i PBS og høyre lapp ble satt i 5 ml av 1% Triton X-100 i PBS for permeabilization i 48 timer eller inntil vev sank. Alle stainings ble utført i 0,2% Triton X-100 i PBS inneholdende 5% FBS og 2% BSA og skyllingene ble i 0,2% Triton X-100 i PBS. Farging med anti-CC10 var i 72 timer ved 4 ° C fulgt av omfattende vask til omtrent 6 timer. Fluorescerende merking av det primære antistoff ble oppnådd med anti-geit-Alexa Fluor-594 sekundært antistoff over natten ved 4 ° C fulgt av omfattende vask i 6 timer til over natten. Den følgende dag, farget fliker ble tømt gjennom 50%, 70% og 80% THF i 30 minutter hver, etterfulgt av tre vaskinger 30 min i 100% THF, etterfulgt av 20 min i DCM, etterfulgt av 30 min i DBE. Scale barer i en og b = 1 mm og i c = 100 mikrometer.

Figur 9
Figur 9. 3DISCO av bukspyttkjertelen. Etter perfusjon av mus som er beskrevet ovenfor i protokollen, bukspyttkjertelen ble dissekert og klarert med kort protokoll. Fluorescensen er avledet fra ROSA26 LSL tdTomato rekombinasjon indusert av tamoxifen behandling av mus som bærer en 200 kb BAC transgenet som strekker seg over den endogene mus glukagon locus med CreERT2 satt inn i ATG av glukagon. Pilhodene markere noen av de fluorescensmerkede alfaceller i holmen. Skala stolper i a, b og c = 1 mm, og på d = 500 ym.

Tabell 1
Tabell 1. Tissue clearing protokoller for ulike vev. Eksempler på vev clearing protokoller for ulike vev. Merk at clearing tid for hvert trinn kan forkortes eller forlenges etter behov for å forbedre clearing ytelse. Den omtrentlige vekten av små vev er ~ 20-100 mg og hjernen er ~ 300-500 mg.ttps :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/51382/51382table1.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se en større versjon av denne tabellen.

Discussion

Tissue clearing metoder tar sikte på å redusere spredning av bildebehandling lys ved å matche brytningsindeksene i ulike vev lag i de ryddet organer. Som et resultat, kan avbildnings lys trenge dypt inn i vev og stimulerer de merkede celler / molekyler. Denne gamle begrepet vev clearing 17 har fått økende oppmerksomhet etter den første sofistikert anvendelse av teknikken på intakte mus hjerner etter Dodt og kolleger to. Siden da, det er en raskt voksende liste av nye oppgjørsmetoder, inkludert 3DISCO, Sca / e, ClearT2, CLARITY og SeeDB 3,4,7,18-20. I hovedsak de alle tar sikte på å gjengi organer gjennomsiktige for dyp vev avbildning ved å bevare den fluorescerende etiketten. Blant dem, står 3DISCO ut som en av de enkleste og reproduserbare fremgangsmåter. Det er relativt rask i forhold til andre clearing metodene nevnt ovenfor (1-5 dager vs 2-3 uker for voksne hjerner, henholdsvis) 21. Det har allerede vært vellykketfullt brukt til ulike organer som hjernen, ryggmargen, lymfeknuter, milt, lunger, solide tumorer, bukspyttkjertelen, og melkekjertler 3,4,9. I tillegg er flere publikasjoner av uavhengige forskergrupper allerede brukt denne metoden for å få bildebehandling resultater 22,23. Likevel kunne ulike vev clearing prosedyrer være en fordel for forskjellige forhold. For eksempel, mens Sca / e og SeeDB gjelder beste på embryonale vev 6,7, de er vannbasert clearing metoder, som kan være enklere å håndtere under bildebehandling. I motsetning til dette er KLARHET en komplisert og kostbar rensing metode. Men det kan være fordelaktig i sammenheng med antistoffmerking, spesielt i store vev slik som hjerne 8..

Den mest kritiske trinnet for å oppnå de beste bilderesultatene fra 3DISCO er vev merking, noe som oppnås før vevet clearing. Det er viktig å starte med den sterkeste fluorescenssignalet mulig. Dette kan be oppnås på ulike måter, inkludert transgene uttrykk for fluorescerende proteiner, sporing av syntetiske fargestoffer, viral transfeksjon eller antistoff merking. Det bør være oppmerksom på at noen clearing prosedyre vil redusere fluorescenssignalet av vev. Derfor, hvis det fluorescerende signalet ikke er sterk nok til i begynnelsen - dvs. det er ikke mulig å påvise før clearing-avbildning av de klarerte vev vil gi dårlige resultater.

Det er noen begrensninger for clearing metoder som venter på forbedringer. En viktig begrensning er at siden fjerne reagenser endre strukturen i de tømte organer, kan de ikke brukes på levende vev. Derfor bør eksperimenter som med photoactivatable mEos2 24 utføres før fikse og clearing. Ved clearing, blir super-oppløsning avbildning av fluorescerende signal fra lyse og photo proteiner mulig. I tillegg, fordi den lysning protokollen minskerintensiteten av fluorescerende proteiner, kan de klarerte organer ikke lagres i lengre perioder. Det er viktig å merke seg at noen organer er vanskeligere å bli ryddet. Spesielt, dersom de dissekerte organer beholde store mengder blodceller (for eksempel, milt, lever), de er forholdsvis vanskelige å fjerne og bilde. Det er også forholdsvis vanskelig å oppnå en fullstendig rensing for store vev, for eksempel voksen gnager hjernen. Slike vev kan trenge lengre inkubasjonstider, som kan, på den annen side, å redusere det fluorescerende signal. I tillegg, utvikling av mikroskopi metoder som kan image store gjennomsiktige organer på en gang på en høy oppløsning er en avventer må tas opp. En annen viktig begrensning av teknikken er vevet merking. Mens et sterkt fluorescerende signal via genetisk eller virus expression er ideell, kan ikke hver celle eller molekyl merkes genetisk eller viralt. På den annen side er antistoffmerking av tykk vev ikke er en enkel prosedyre eller ikke possible i de fleste tilfeller. Det kan trenge spesial permeabilization protokoller og lang inkubasjonstid (flere dager til noen uker) tre. Det er også viktig å huske på at vev krympe ~ 20% i hver dimensjon (målt for ryggmargen vev) etter avregning hovedsakelig på grunn av dehydrering og delipidering. Dette svinn oppstår ratiometrisk og bør korrigeres i kvantifisering trinn. Som observert i de presenterte resultater, fluorescensmerkede konstruksjoner forblir intakt, noe som er en indikasjon på protein integritet i de tømte vev. På grunn av den hydrofobe karakter av den endelige erte vev, kan det ikke lenger var farget med antistoffer, eller innebygd i vannholdige løsninger f.eks Focusclear-som brukes i KLARHET-eller 80% glycerol. Til slutt er det en utfordring å analysere overveldende størrelser av bildedata. For eksempel, når en hel murine hjernen skannes på et cellular oppløsning, ville det være svært vanskelig å spore og kvantifisere ønsket structures (f.eks neuronal eller gliaceller nettverk) og sammenligne over ulike prøvene i en automatisert måte. I sammendraget, mens forskerne som mål å finne ut nye oppgjørsmetoder, de ulike utfordringene ovenfor (vanskeligheter med å fjerne ulike vev, bildebehandling med høy oppløsning på større områder, og komplisert dataanalyse) bør forbedres parallelt.

I konklusjonen, nyutviklede vev ryddesag inkludert 3DISCO, elegant demonstrerer at høyoppløselig 3D avbildning av intakte organer er nå mulig. Ved hjelp av disse metodene, kan forskere skaffe anatomisk informasjon av celler og molekyler i intakt organ. Disse banebrytende 3D-imaging studier på gjennomsiktige organer inspirere et økende antall forskere å tyde komplekse anatomiske og molekylære organisasjoner av vev / organer i lyng og sykdom.

Disclosures

Det er ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker C. Højer for kritisk lesing av manuskriptet, B. Bingol (Genentech) for deltakelse i skript fortellinger, N. Bien-Ly for å dele opplevelsen av forbedret blodkar bildebehandling med halen vene injeksjon av Lektin fargestoff, og M Solloway (Genentech ) for mus brukt i bukspyttkjertelen avbildning. GFP-M linjen ble opprettet av J. Sanes (i St. Louis Washington University) og CX3CR1-GFP mus ved R. Littman (NYU). Arbeidet er støttet av Genentech, Inc.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Thy-1 GFP (GFP-M) mouse Can be obtained from Jackson.
CX3CR1 GFP mouse Can be obtained from Littman lab at NYU.
TgN(hGFAP-ECFP) mouse Can be obtained from Jackson.
Paraformaldehyde Sigma P6148
Na2HPO4 Mallinckrodt 7917-16
NaH2PO4 Mallinckrodt 7892-04
2-2-2 Tribromoethanol Sigma T48402
2-Methyl-2-butanol Sigma 152463 Used to prepare Avertin solution.
Saline Braun
Tetrahydrofuran Sigma 186562-12X100ML
Dichloromethane Sigma 270997-12X100ML
Dibenzyl ether Sigma Sigma, 108014-1KG
Benzyl alcohol Sigma 305197-100ML
Benzyl benzoate Sigma B6630-250ML
Lectin FITC Sigma L0401-1MG
anti-CC10 Santa Cruz SC-9772 0.388888889
Heparin APP pharmaceuticals 504001 Used in perfusion.
Glass vials VWR 548-0554
Forceps FST 11251-10
Mini Rotator VWR 100498-878
Aluminum Foil Fisherbrand 01-213-104
100 ml Media Storage Bottles Kimax Media Bottles EW-34523-00
Minipuls evolution perfusion pump with MF4* medium flow pump head Gilson, Inc F110701 and F117606
Microscopy slide VWR 48311-703
FastWell Grace Bio-Labs FW20
Cover slip Corning 2940-245
Glass petri dish Corning Pyrex 3160-101
Dental cement Lang Dental 1223PNK
Quantofix Peroxide Test Strips Sigma 37206
Amira with RT resolve microscopy module Visage Imaging image analysis software
Imaris Bitplane imaging image analysis software
ImageJ NIH freeware

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tuchin, V. Tissue optics: light scattering methods and instruments for medical diagnosis. SPIE Press. (2007).
  2. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Methods. 4, 331-336 (2007).
  3. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nat Med. 18, 166-171 (2012).
  4. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
  5. Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PLoS One. 7, (2012).
  6. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
  7. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
  8. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
  9. Erturk, A., Bradke, F. High-resolution imaging of entire organs by 3-dimensional imaging of solvent cleared organs (3DISCO). Exp Neurol. 242, 57-64 (2013).
  10. Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation. Cytometry Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 71, 379-385 (2007).
  11. Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Ome sweet ome: what can the genome tell us about the connectome. Curr Opin Neurobiol. 18, 346-353 (2008).
  12. Roh, M. I., Chung, S. H., Stulting, R. D., Kim, W. C., Kim, E. K. Preserved peripheral corneal clarity after surgical trauma in patients with Avellino corneal dystrophy. Cornea. 25, 497-498 (2006).
  13. Liu, J. K., Chung, C. H., Chang, C. Y., Bond Shieh, D. B. Bond strength and debonding characteristics of a new ceramic bracket. American journal of orthodontics and dentofacial orthopedics : official publication of the American Association of Orthodontists, its constituent societies, and the American Board of Orthodontics. 128, 761-765 (2005).
  14. Perry, V. H., Nicoll, J. A., Holmes, C. Microglia in neurodegenerative disease. Nature reviews. Neurology. 6, 193-201 (2010).
  15. Maragakis, N. J., Rothstein, J. D. Mechanisms of Disease: astrocytes in neurodegenerative disease. Nature clinical practice. Neurology. 2, 679-689 (2006).
  16. Jahrling, N., Becker, K., Dodt, H. U. 3D-reconstruction of blood vessels by ultramicroscopy. Organogenesis. 5, 145-148 (2009).
  17. Spalteholz, W. Über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten. S. Hirzel. (1903).
  18. Smith, C., et al. The neuroinflammatory response in humans after traumatic brain injury. Neuropathology and applied neurobiology. 39, 654-666 (2012).
  19. Zotova, E., et al. Microglial alterations in human Alzheimer's disease following Abeta42 immunization. Neuropathology and applied neurobiology. 37, 513-524 (2011).
  20. Frewin, B., Chung, M., Donnelly, N. Bilateral cochlear implantation in Friedreich's ataxia: A case study. Cochlear implants international. 14, 287-290 (2013).
  21. Kim, S. Y., Chung, K., Deisseroth, K. Light microscopy mapping of connections in the intact brain. Trends in cognitive sciences. 17, 596-599 (2013).
  22. Luo, X., et al. Three-dimensional evaluation of retinal ganglion cell axon regeneration and pathfinding in whole mouse tissue after injury. Exp Neurol. 247, 653-662 (2013).
  23. Soderblom, C., et al. Perivascular fibroblasts form the fibrotic scar after contusive spinal cord injury. J Neurosci. 33, 13882-13887 (2013).
  24. McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nat Methods. 6, 131-133 (2009).

Comments

1 Comment



  1. Conventionally we are limited in the knowledge of biology and science due to lack of resources and researches. But now as we are moving in new era, researchers are getting great benefit to study developmental problems and disease. Now various medical devices are out there whose example is available at http://www.ilexmedical.com/products.php?act=cat helping researchers to look inside an organism and figure out what exactly went wrong and when. Researchers can thoroughly look tissues, organs and even an entire body without any trouble. Certainly such techniques are practical for many fields in biology!!!!

    Reply
    Posted by: Isabella L.
    March 25, 2015 - 8:13 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics