Terapia cellulare per insufficienza cardiaca nel ratto: Doppia Toracotomia per infarto miocardico e epicardico impianto di cellule e Biomatrix

1Cardiology, Department of Medicine, University of Fribourg
Published 9/22/2014
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Bioengineering

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Summary

L'impianto di una biograft per trattare infarto del miocardio indotta da legatura LAD in un modello di roditore è convenzionalmente richiesto due operazioni a cuore aperto. Al fine di ridurre la mortalità e fornire le condizioni ottimali per la fissazione di biomatrici solidi e gelatinosi associati con le cellule, sono state sviluppate procedure minimamente invasive.

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Frobert, A., Valentin, J., Cook, S., Lopes-Vicente, J., Giraud, M. N. Cell-based Therapy for Heart Failure in Rat: Double Thoracotomy for Myocardial Infarction and Epicardial Implantation of Cells and Biomatrix. J. Vis. Exp. (91), e51390, doi:10.3791/51390 (2014).

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Abstract

Terapia cellulare cardiaca ha guadagnato crescente interesse e l'impianto di biomateriali associati con le cellule è diventata una questione importante per ottimizzare la consegna delle cellule del miocardio. Modello di roditore di infarto del miocardio (MI) composto da discendente anteriore sinistra (LAD) legatura è stata comunemente eseguita mediante una toracotomia; un secondo intervento a cuore aperto tramite una sternotomia viene tradizionalmente eseguita per l'applicazione epicardica del trattamento. Dal momento che la descrizione di LAD modello legatura, il tasso di mortalità post-operatoria è sceso 35-13%, comunque il secondo intervento chirurgico è rimasta critica. Al fine di migliorare il recupero post-intervento chirurgico e ridurre il dolore e l'infezione, procedure chirurgiche minimamente invasive sono presentati. Due toracotomie state eseguite, quello iniziale per LAD legatura e la seconda per il trattamento somministrazione epicardico. Biografts costituiti da cellule associate con matrici di tipo solido o gel sono stati applicati sulla ar infartuatoEA. LAD legatura comportato la perdita della funzione cardiaca, come confermato da ecocardiografia eseguita dopo 2 e 6 settimane. Colorazione tricromica Goldner eseguita su sezioni di cuore confermata la formazione della cicatrice transmurale. Ambulatori di primo e secondo portato a meno che il 10% la mortalità post-operatoria.

Introduction

Dalla fine del 19 ° secolo, le malattie cardiovascolari è rimasto il serial killer numero uno nei paesi industrializzati. Tra questi, malattia coronarica rappresenta la eziologia principale. I risultati della fase acuta di infarto del miocardio (MI) ed è seguita da rimodellamento disadattivi che si sviluppa progressivamente verso una fase cronica e insufficienza cardiaca grave. Nonostante i recenti significativi progressi tecnologici e terapeutici, la morbilità e la mortalità dovute alla progressione dello scompenso cardiaco è ancora in crescita 1. In questo contesto, la terapia cellulare ha guadagnato crescente interesse come una nuova opzione terapeutica per arrestare la progressione della malattia verso l'insufficienza cardiaca e per stimolare la capacità rigenerativa recentemente identificato del miocardio. Indagini sperimentali e clinici hanno fornito prove convincenti degli effetti benefici ottenuti dopo il trapianto cardiaco di vari tipi di cellule. I principali risultati inclusi migliorata cardifunzione contrattile ac, diminuito rimodellamento ventricolare sinistro, ridotta dimensione infartuale, ed ha aumentato la densità vascolare nella zona infartuata. Tuttavia, il basso numero di cellule di conservazione dopo l'iniezione delle cellule è rimasto un importante svantaggio. Associazione di celle con un biomatrice per migliorare di consegna cella 2 ha recentemente promosso ricercatore e interessi clinici.

Legatura della discendente anteriore dell'arteria coronaria (LAD) è un metodo di riferimento per MI in piccolo modello animale che provoca infarto transmurale e una cicatrice maturo. La terapia cellulare applicata nella fase cronica di MI richiede un secondo intervento chirurgico. Un sternotomia mediana è di solito eseguita per consentire l'iniezione intramiocardico delle cellule o impianto epicardico di biografts. Tali procedure chirurgiche invasive aumentare il tasso di mortalità, i tempi di recupero post-operatorio, il dolore, e il rischio di infezione. L'approccio mini-invasivo qui presentato non solo impedisce tale distorsione, ma fornisce anche oaccessibilità ptimal del cuore per l'applicazione del trattamento. MI e impianto epicardico delle cellule associate a un tipo di gel biomatrice vengono eseguite su un cuore che batte con toracotomia intercostale sinistro.

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Protocol

NOTA: Lewis ratti maschi e femmine, 200-220 g sono stati alloggiati in condizioni standard di laboratorio (12 ore di luce e buio ciclo, ad libitum acqua e cibo, IVC gabbia). Tutti gli animali sono stati trattati in conformità con le raccomandazioni della FELASA e la legge svizzera sulla protezione degli animali.

1 Cella Preparazione: isolamento di cellule staminali mesenchimali dal midollo osseo

  1. Anestetizzare i ratti con isoflurano 5% O 2 e 5 L / min in una camera di induzione per 5 min. Posizionare muso dell'animale in un cono collegato al sistema di anestesia. Eseguire un pizzico punta o la coda per confermare la sedazione.
  2. Togliere la pelle dalla gamba con le forbici tagliando la pelle dalla caviglia all'anca. Togliere i muscoli e tagliare l'arteria femorale per dissanguamento degli animali. Esporre l'articolazione dell'anca e dislocare la testa del femore. E 'importante non danneggiare la testa del femore. Mettere le ossa in PBS sterile in un tubo di plastica da 50 ml.
  3. Rimuovere tutti i muscles e legamenti delle ossa senza romperle. NOTA: E 'importante che l'osso rimane intatto per evitare il collegamento di soluzione di lavaggio o contaminazione con etanolo. Sciacquare le ossa pelati in etanolo al 70% per 5 min.
  4. Sotto la cappa a flusso laminare sterile, tagliare entrambe le punte delle ossa con le forbici. Lavare il midollo osseo mediante iniezione di PBS sterile dalla estremità dell'osso. Raccogliere osseo in una provetta da 15 ml. Centrifugare 7 min a 300 x g.
  5. Rimuovere il surnatante. Sospendere il pellet in 3 ml di globuli rossi Lysis buffer. Incubare la sospensione per 1 min a temperatura ambiente prima della filatura ancora per 7 min a 300 x g. In un pallone di coltura di 150 ml, aggiungere sterile terreno di coltura cellulare (395 ml medio IMDM, 5 penna ml / strep, 100 ml FBS) e seminare le cellule.
  6. Modificare media il secondo giorno per rimuovere le cellule non aderenti.
    1. Eseguire i cambiamenti medi ogni secondo giorno per 2-3 settimane, fino ad ottenere la quantità cella desiderata.
    2. In alternativa, preparare il biograft per semezione le cellule sulla matrice solida come necessario e descritto altrove 3.
  7. Il giorno di impianto cardiaco, preparare le cellule o raccogliere il biograft poco prima dell'applicazione epicardico.
    1. Raccogliere le cellule utilizzando soluzione distacco delle cellule Accutase. Contare le cellule. Riempire una provetta da 1,5 ml per centrifuga con il volume della sospensione cellulare calcolate per ottenere quantità cella desiderata. Centrifugare per 7 minuti a 300 xg e rimuovere il surnatante.
    2. In alternativa, raccogliere il biograft da terreno di coltura cellulare, sciacquare in PBS sterile, e tenere in terreno di coltura fresco senza siero.

2 Prima Toracotomia e KOP legatura

  1. Pesare il ratto. Accendere il rilievo di riscaldamento a 37 ° C. Anestetizzare il topo con il 5% isoflurano e 5 L / min 100% O 2 in una camera di induzione per 5-7 min. Eseguire un pizzico punta o la coda per confermare la sedazione. Posizionare il ratto sulla rampa di riscaldamento.
  2. Intubare l'animale con un 14G catetere iv. Collegare il catetere intubazione di un ventilatore roditore programmato per 2.5 L / min di ossigeno, 2,5% isoflurano, volume corrente di 2 ml, e una frequenza respiratoria di 90 respiri / min.
  3. Preparare una soluzione di buprenorfina a 0.1 mg / kg. Iniettare per via sottocutanea un terzo della soluzione. Radere la parte sinistra del torace. Disinfettare con una soluzione di Betadine 1%.
  4. Incidere la pelle perpendicolare allo sterno al quarto spazio intercostale. Separare i 3 strati di muscolatura toracica (pettorale, ascendente pettorale, e pettorale obliqua esterna). Aprire il quarto spazio intercostale (tra nervature 4 e 5).
  5. Utilizzare un piccolo divaricatore per diffondere le costole e per esporre il cuore. Aprire con cautela il pericardio. Individuare e legare la discendente anteriore dell'arteria coronaria (LAD) con un 7,0 mm 4 sutura sotto l'atrio.
  6. Chiudere lo spazio intercostale con due punti con 3.0 punti di sutura. Posizionare i due punti di sutura prossimale e distale dallo sterno. In primo luogo, tSerrate la sutura distale. Fissare il tubo di scarico ventilatore per 2 secondi per gonfiare il petto ed evitare qualsiasi pneumotorace. Stringere la seconda sutura. Posizionare i muscoli strati a posto (non sono necessari punti di sutura). Chiudere la pelle con un 5.0 sutura.
  7. Disinfettare la sutura con una soluzione di Betadine 1%. Iniettare il resto della soluzione buprenorfina. Spegnere il sistema di anestesia. Rimuovere il catetere intubazione.
  8. Tenere il topo in gabbia sotto una lampada caldo per 1-2 ore. Mantenere un termometro nella gabbia e controllare la distanza tra la luce calda e la gabbia per evitare il surriscaldamento. Restituire il ratto nell'unità IVC. Iniettare per via sottocutanea Buprenorfina 0,05-0,1 mg / kg dopo -operatively ogni 6-12 ore per 48 ore.

3. epicardico Amministrazione della Via trattamento una seconda Toracotomia

  1. Ripetere i passaggi 2,1-2,3.
  2. Incidere la pelle perpendicolare allo sterno al quinto spazio intercostale. Separare il 3 stratis del muscolo toracico (grande pettorale, ascendente pettorale e pettorale obliqua esterna). Aprire il quinto spazio intercostale (fra nervature 5 e 6).
  3. Utilizzare un piccolo divaricatore per diffondere le costole e per esporre il cuore. Se c'è qualche aderenza, rimuoverli delicatamente con una pinza sottile.
  4. Individuare la zona infartuata che appare come un'area pallida sotto la legatura. NOTA: Se necessario, utilizzare un 10 centimetri pezzo di sutura (7.0) inserito al vertice per visualizzare meglio il ventricolo sinistro. Estrarre delicatamente la sutura mantenuto liberamente da un morsetto per esporre il cuore.
  5. Applicare uno dei seguenti trattamenti:
    1. Posizionare il biograft alla superficie del cuore. Utilizzare la siringa preriempita di fibrina sigillante preriscaldata a temperatura ambiente per 10 min. Applicare una goccia (50-100 ml) di fibrina sigillante sotto la biograft utilizzando un ago 25 G Luer. Verificare che il biograft sia perfettamente sigillato.
    2. In alternativa, applicare il pellet di cellule raccolte con un puntale in superficie of cuore sull'area pallido sotto la legatura. Applicare una goccia (50-100 ml) di fibrina sigillante sul pellet di cellule.
  6. Rimuovere il pezzo di sutura dall'apice.
  7. Ripetere i passaggi 2,6-2,8.

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Representative Results

Tutti gli animali recuperati entro 1 ora dopo toracotomia. La guarigione della ferita è stata rapida. È stata osservata nessuna infezione o edema.

La doppia toracotomia sinistra consentito un accesso ottimale al cuore (Figura 1). Il dolore e la mortalità post-operatoria erano bassi. L'animale recuperato rapidamente dalla chirurgia ed ha guadagnato peso (Figura 2). Kaplan Meir sopravvivenza percentuale è stata del 96% per il primo toracotomia. Quattro ratti oltre 104 morti entro la seguente applicazione di trattamento di 24 ore con una seconda toracotomia. Kaplan-Meir per cento di sopravvivenza varia dal 100% quando animale ha ricevuto una seconda toracotomia, ma nessun trattamento (sham), 96% per MSC e fibrina sigillante gruppo, o il 86% quando animale ha ricevuto MSC iniettato direttamente all'interno del miocardio (Figura 3).

M-mode valutazione ecocardiografica effettuato 2 settimane dopo la legatura LAD ha mostrato una riduzione della frazione di accorciamento (FS) da 44 ± 3%a 22 ± 4%. La rappresentazione frequenza delle FS registrati sui 104 animali 2 settimane dopo KOP legatura fornite prove della ripetibilità del metodo (Figura 4). Il coefficiente di variazione (CV) è stata del 17%. Inoltre, ecocardiografia eseguita a 2 e 6 settimane dopo la legatura LAD ha mostrato una progressione verso l'insufficienza cardiaca suggerito da una riduzione della frazione di eiezione (EF) e un aumento dei volumi LV in diastole e sistole (figure 4 e 5). Lo sviluppo di un infarto transmurale nel gruppo operato sham stata confermata dal Goldner colorazione di sezioni trasversali del cuore (Figura 6).

Figura 1
Figura 1 (A) L'uso del divaricatore consentito l'accesso al cuore dopo toracotomia. LAD legatura è stata eseguita due settimane primae sutura è visibile (freccia). Applicazione trattamento epicardico è stata eseguita con esteriorizzazione minima del cuore. (B) Le cellule pellet fissati con colla di fibrina sono stati mantenuti alla superficie della zona infartuata.

Figura 2
Figura 2 Quotidiano postoperatorio follow up ha evidenziato la perdita di peso per 2 giorni dopo l'intervento chirurgico. Recovery è stato accompagnato con guadagno di peso in tutti gli animali. Variazioni di peso erano indipendenti dal tipo di trattamento.

Figura 3
Figura 3 Kaplan-Meir grafico che rappresenta per cento di sopravvivenza dopo legatura LAD (A) e dopo il trattamento con un secondo toracotomia (B) ha mostrato che entrambi gli interventi hanno comportato una ridotta perdita di animali. gruppo di controllo rappresenta animale sano che non ha avuto un intervento chirurgico. Due settimane dopo il primo toracotomia, gli animali hanno ricevuto una operazione di mistificazione, ma nessun trattamento (sham), fibrina sigillante da solo, cellule fissate con colla di fibrina, o le cellule iniettate direttamente nel miocardio (MSC iniettato).

Figura 4
Figura 4 (A) Rappresentante M-mode immagini ecocardiografia pre registrati (sano), e 2 settimane dopo la legatura LAD (infartuato). Distribuzione (B) Frequenza dei valori di accorciamento frazionale registrato due settimane dopo legatura LAD (n = 104).

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Figura 5 funzione cardiaca è stata valutata mediante ecocardiografia 2dimentional (metodo di Simpson biplano) e registrato 2 e 6 settimane postare KOP legatura. Animale aveva due toracotomia, ma ha ricevuto alcun trattamento. Media ± SD così come valori individuali sono rappresentati per la frazione di eiezione (A) Volume LV in sistole (B) e diastole (C). Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando un test non parametrico di Wilcoxon accoppiato.

Figura 6
Figura 6 Rappresentante Goldner colorazione che mostra cicatrice fibrotica (verde) e il miocardio vitale (rosso) a 2 settimane (A) e 6 settimane KOP legatura (B) post.

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Discussion

La legatura permanente di LAD provoca danno miocardico irreversibile. Il primo modello animale è stato descritto nel 1960 4. Da allora, è stato considerato come un modello standard e adatto a MI cronica. La sua stabilità e riproducibilità consentito valutazione sperimentale delle terapie per MI 5. Miglioramento delle procedure di seguito la descrizione iniziale riportato un tasso di mortalità operatoria del 35-13% 6.

Come previsto, LAD legatura indotto funzione cardiaca compromessa osservato entro 2 settimane. Un ulteriore diminuzione della funzione cardiaca è stato registrato fino a 6 settimane e associata con transmurale cicatrice fibrotica. Inoltre, LV rimodellamento compreso LV dilatazione è stata chiaramente osservata 6 settimane dopo la legatura.

Un intervallo di 2 settimane tra la prima e la seconda operazione è stata scelta. In questa condizione, la seconda toracotomia stata facilitata dall'assenza di aderenze, come erano troppo abbondanti dopo 1 settimana a PERFORsecondo intervento chirurgico ma in ottime condizioni. Inoltre 2 settimane rappresentato un periodo di tempo ottimale per le applicazioni di trattamento e consentito di evitare la precoce pic dell'infiammazione indotta da ischemia e ad applicare il trattamento prima della formazione di un tessuto fibroso denso e progressione della dilatazione.

Anche se toracotomia laterale è oggi la procedura chirurgica standard per la legatura LAD di piccoli animali, una sternotomia mediana è di solito eseguita per l'applicazione della terapia cellulare 7. La seconda toracotomia intercostale presentato per l'applicazione di trattamento è un romanzo, approccio mini-invasivo; permette l'accesso al cuore attraverso le costole senza tagliare ossa e dividendo il muscolo. Il verificarsi di aderenza è ridotta a causa della piccola e limitata cicatrice dopo la prima toracotomia e questi non interferiscono con la realizzazione dell'applicazione trattamento. L'approccio ha portato a bassissimo rischio di emorragia, postoperatoria velocerecupero, bassa mortalità, il dolore, e il rischio di infezione. Questa seconda procedura minimamente traumatica è durato 20 minuti per un intervento chirurgico e fino a 20 minuti per il fissaggio della matrice. La procedura rapida e l'esposizione limitata del cuore minimizzato asciugatura del tessuto cardiaco. Post-operatorio ecografia ha portato buona acquisizione delle immagini di qualità per l'analisi misurazioni riproducibili. Non c'erano ematomi che potrebbero compromettere l'imaging.

L'accessibilità del cuore consentito visibilità ottimale del miocardio infartuato nonché una buona esposizione del cuore per l'applicazione di trattamenti epicardici compreso biografts solidi e gel tipo 8-10.

L'uso di fibrina sigillante presentato diversi vantaggi. (I) Per fissare patch solidi, l'uso di fibrina sigillante era meno traumatico di suture. (Ii) se confrontato con altri colla quale BioGlue (CryoLife), fibrina sigillante era più compiacente di BioGlue che ha formato la struttura rigida e cuore alteratacontrazioni. (Iii) Il suo tempo di polimerizzazione è stato ottimale per un adeguato ponteggio o posizionamento pellet di cellule. (Iv) di fibrina sigillante consentito eccellente adesione iniziale di solida patch. La patch è stata mantenuta saldamente sulla superficie del cuore per almeno 4 settimane 10. (V) La fibrina sigillante era facile processo quando usati come impalcatura per la consegna cellule epicardico e cellule fissate sono state mantenute in superficie della zona infartuata fino al termine della procedura chirurgica. Anche se il tempo di ritenzione delle cellule era fuori di focus di questo studio e richiederebbe ulteriori indagini, è stato proposto che la matrice permette una migliore ritenzione del miocardio delle cellule impiantate 11-14. Lavare delle cellule durante la contrazione cardiaca, così come l'ipossia e l'ambiente infiammatorio, potrebbe in parte spiegare la rapida clearance. Questi svantaggi possono essere ridotti quando le cellule sono associati a una matrice.

Le principali sfide tecniche riguardano il trattamento chirurgico diun biograft solido. Se la matrice è rigido e nonflexible, fissazione con sutura dovrebbe essere favorito. I seguenti passaggi critici dovrebbero essere considerati per la procedura di successo. In primo luogo, una particolare attenzione deve essere prestata durante la toracotomia per evitare di rompere le costole. In secondo luogo, l'eccesso di colla deve essere rimosso con attenzione per evitare l'adesione di altri tessuti. Infine, un posizionamento di legature standard è importante in quanto può ridurre la variabilità nella dimensione dell'infarto. Un infarto transmurale può essere ottenuta quando KOP è legatura 4 mm sotto l'atrio.

In conclusione, doppia toracotomia rappresentata una procedura chirurgica sicuro con bassa mortalità, adeguato accesso al cuore pulsante per l'applicazione del trattamento, e quindi favorirà ottimizzazione della pianificazione sperimentale e ridotto numero di perdita di animale.

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Acknowledgements

Gli autori ringraziano il prof Hendrik Tevaearai e il Dipartimento di Chirurgia Cardiovascolare di sostegno finanziario per la parte iniziale dello studio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polysorb 3-0 suture Covidien UL 204
Polysorb 5-0 suture Covidien UL 202
Surgipro II 7-0 Suture Covidien VP904X
Catheter Insyte 14 G BD 381267
Inspira Advanced Volume Controlled Ventilator Harvard Apparatus 557058
Dumont #7 Forceps FST Germany 11274-20
Fibrin Sealant Baxter 1501441 TISSEEL Glue, Frozen -20 °C
Castroviejo Eye Specula Harvard Apparatus 72-8925 use as retractor for the ribs
IMDM GlutaMAX Gibco 31980
Pen/Strep Gibco 15140
FBS PAA Clone       A15-101
Bone Scissors Fine Science Tools 16044-10
Red Blood Cell Lysis Solution Gentra Systems D-50k1
Accutase Cell Detachment Solution Stem Cell Technology 7920

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References

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