في وقت واحد قياس درجة الحموضة في التقامي وعصاري خلوي المقصورات في الخلايا الحية باستخدام متحد البؤر المجهري

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lucien, F., Harper, K., Pelletier, P. P., Volkov, L., Dubois, C. M. Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (86), e51395, doi:10.3791/51395 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. إعداد حلول لالخلوية درجة الحموضة المعايرة

  1. إضافة مركبات التالية لخمسة أنابيب 50 مل المخروطية منفصلة لإعداد 5 حلول لاستخدامها في معايرة:
    • كلوريد الصوديوم (1 مل ​​من كلوريد الصوديوم M 1) (1 M كلوريد الصوديوم = 0.58 غ في 10 مل H 2 0)
    • بوكل (6.75 مل من 1 M بوكل) (1 M بوكل = 0.75 غ في 10 مل H 2 0)
    • الجلوكوز (1 مل ​​من 1 M D-جلوكوز) (1M D-جلوكوز = 1.80 غ في 10 مل H 2 0)
    • MgS0 4 (0.05 مل من 1 M MgSO 4) (1 M MgSO 4 = 1.20 غ في 10 مل H 2 0)
    • 20 ملي HEPES (1 مل ​​من 1M HEPES) (1 M HEPES = 2.38 غ في 10 مل H 2 0)
    • و CaCl 2 (0.05 مل من 1M و CaCl 2) (1 M و CaCl 2 = 1.47 غ في 10 مل H 2 0)
      إعداد جميع الحلول في ضعف المقطر H 2 O ([ده 2 O).
  2. إكمال كل حل مع 35 مل من DDH 2 O وتخلط مع محرك مغناطيسي حتى ذلكويتحقق lution.
  3. ضبط درجة الحموضة من كل حل مع 1 N 1 N KOH أو حمض الهيدروكلوريك الحصول على قيم درجة الحموضة 5.5، 6.0، 6.5، 7.0 و 7.5. ثم، وضبط حجم مع الماء منزوع الأيونات إلى الحجم النهائي من 50 مل.
  4. قياس 5 ملغ من nigericin وإضافته إلى 670 ميكرولتر من ETOH المطلقة لإعداد 10 ملي nigericin محلول المخزون.
    الحذر: nigericin عالية السمية ويجب التعامل بحذر شديد (القفازات، ونظارات السلامة وقناع). مزيج الحل عن طريق انقلاب حتى يذوب تماما nigericin.
  5. إضافة 0.05 مل من 10 ملي nigericin (تركيز النهائي 10 ميكرومتر) على كل حل المعايرة. Nigericin هو حامل الأيون الذي يزيد من نفاذية الأغشية الخلوية ويسبب موازنة درجة الحموضة داخل الخلايا وخارج الخلية في وجود تركيز إزالة إستقطاب من خارج الخلية K +.
  6. ويمكن تخزين حلول المعايرة يصل إلى 1 في الشهر في 4 درجات مئوية

2. إعداد الخليوي

  1. تحت سافيت البيولوجيةذ غطاء محرك السيارة، وخلايا البذور في 35 ملم الأطباق ثقافة × 10 مم في 2 مل من متوسط ​​النمو تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني والمضادات الحيوية. استخدام كمية الخلايا اللازمة لضمان ما يقرب من 50٪ التقاء بعد 24 ساعة.
    ملاحظة: في تجاربنا، ونحن نستخدم خط الخلية HT-1080 ولوحة 1 × 10 5 خلايا لكل طبق الثقافة.
  2. تحديد عدد من الأطباق الثقافة اللازمة للتجربة وصفيحة 5 أطباق الثقافة إضافية لاستخدامها في المعايرة.
  3. أطباق ثقافة المكان في 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2 الحاضنة لمدة 24 ساعة على الأقل.

3. إعداد تحقيقات الحموضة الاستشعار

  1. إعداد محلول المخزون 1M من الفلورسنت التحقيق الحموضة 8 hydroxypyrene-1، 3،6 حمض trisulfonic والملح صوديوم (HPTS / pyranine) في DDH 2 0. يجب أن يتم تخزين هذا الحل على RT ومحمية من الضوء.
  2. إعداد محلول المخزون من 1 ملم 5 - (و6) الكربوكسيل seminaphthorhodafluor acetoxymethyl استر خلات (C-SNARF-1 صباحا؛ دعا thereaأي fter SNARF-1) عن طريق إذابة 1 ملغ من SNARF-1 في 1.76 مل من DMSO. مزيج دقيق من قبل pipetting المتكررة. يجب أن يتم تخزين SNARF-1 الحل في -20 درجة مئوية، ومحمية من الضوء.

4. صفها الخليوي

  1. قبل ستة عشر ساعة التصوير الخلية الحية، إضافة 2 ميكرولتر من 1M HPTS محلول المخزون (تركيز النهائي 1 ملم) إلى كل طبق ثقافة تحتوي على 2 مل من المتوسط ​​كاملة.
  2. العودة الأطباق الثقافة الحاضنة. التحقيق HPTS هو خلية impermeant، وبالتالي لتسمية العضيات يجب أن تؤخذ في التحقيق من قبل الإحتساء. يتطلب هذا الشرط أن حضانات الخلية مع HPTS يتم تنفيذها في استكمال مصل الثقافة المتوسطة.
  3. بعد الحضانة مع HPTS، وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني العقيمة وإضافة 2 مل من المصل خالية متوسطة لمدة لا تقل عن 2 ساعة. الحضانة مع SNARF-1 يحتاج إلى أن يؤديها في المصل خالية المتوسطة لأن المصل قد تمنع امتصاص التحقيق.
  4. إضافة 10 ميكرولتر من SNARF-1 محلول المخزون 1 ملم للحصول بالعربيةتركيز إينال من 5 ميكرومتر وتسمح للخلايا لاحتضان لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية، وتحت ضوء خافت. قد تختلف C-SNARF-1 تركيز ووقت الحضانة وفقا لنوع الخلية.
  5. في نهاية الحضانة، وغسل الخلايا مرتين في برنامج تلفزيوني العقيمة وإضافة 2 مل من المصل خالية المتوسطة.

5. إضافة الرقم الهيدروجيني المغيرون

  1. لتقييم ما إذا كان الأسلوب يمكن الكشف عن تغييرات درجة الحموضة في الخلايا والكواشف المختلفة التي تعدل الحموضة داخل الخلايا يمكن استخدامها:
    • Bafilomycin A1، مثبط محددة من V-أتباز 5
    • غ + / H + مبادل الإسوي 1 (NHE-1) 6
    • NH 4 CL، قاعدة ضعيفة أن يزيد درجة الحموضة داخل الخلايا 7
    1. إعداد حلول المخزون من الكواشف المذكورة أعلاه:
      • Bafilomycin A1: إضافة 10 ميكروغرام من bafilomycin A1 إلى 160 ميكرولتر من DMSO للحصول على محلول المخزون من 100 ميكرومتر
      • EIPA: إضافة 25 ملغ من EIPA إلى 1.67 مل من الميثانول إلى obtaiغ تركيز النهائي من 50 ملم
      • NH 4 الكلورين: حل 0.53 غرام من كلوريد الأمونيوم في 10 مل من DDH 2 O للحصول على تركيز النهائي من 1 ملم.

      ملاحظة: يجب أن تبقى جميع الحلول السهم عند 4 درجات مئوية فيما عدا A1 bafilomycin التي يجب تخزينها في -20 درجة مئوية، ومحمية من الضوء.
    2. في أطباق منفصلة الثقافة، إضافة واحد من الكواشف كما هو موضح أدناه:
      • 2 ميكرولتر من 100 ميكرومتر bafilomycin A1 (تركيز النهائي 100 نانومتر)
      • 1 ميكرولتر من 50 ملي EIPA (تركيز النهائي 25 ميكرومتر)
      • 40 ميكرولتر من 1M NH 4 الكلورين (تركيز النهائي 20 ملي)
    3. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  2. انتقل إلى الحصول على الصور.

6. مواصفات تعيش خلية التصوير وإعدادات اقتناء مجهر

  1. أداء التصوير الخلية الحية باستخدام الهدف 40X شنت على الطيفية مقلوب المسح microsco متحد البؤرالمؤسسة العامة مجهزة مرحلة XY بمحركات، وغرفة تستوعب الزجاج الأطباق ثقافة أسفل في بيئة تسيطر عليها (درجة الحرارة، الرطوبة، CO 2) مرحلة الحاضنة.
  2. وقد تم تجهيز الصك متحد البؤر (أوليمبوس FV1000) تستخدم هنا مع:
    • الصمام الثنائي ليزر 405 نانومتر
    • A 40 ميغاواط الأرجون ليزر (458 نانومتر، 488 نانومتر، 515 نانومتر)
    • والهيليوم نيون ليزر (543 نانومتر)
    • الهدف 10X فلوريت، NA0.4
    • وثمة هدف LUCPLFLN 40X، NA0.60
    • وثمة هدف النفط PLAPONSC خطة APO 60X، NA1.4
    • A DM مزدوج اللون مرآة 405/458/488/543
    • A SDM 560 وSDM 640 مرشحات مزدوج اللون
    • A BA655-755 مرشح حاجز
    • A BS20/80 شعاع الخائن
    • برامج تحليل البيانات عن الحصول على الصور وتحليلها،
  3. مرة واحدة وقد تحسنت الحاضنة مرحلة تصل إلى 37 درجة مئوية، ويتم تعيين ما يصل المجهر، ضع صحن الثقافة المحتضنة سابقا مع HPTS وSNARF-1 في غرفة التصوير المرحلة متحد البؤر.
  4. Aأي fter تحديد مساحة من الاهتمام، وضبط إعدادات اقتناء البرمجيات الشكل 1.
    • إعداد مجموعتين القناة الظاهرية.
    • بدء المرحلة الأولى الذي يتوافق مع HPTS الإثارة في 405 نانومتر، وجمع الانبعاثات في 505-525 نانومتر وSNARF-1 الإثارة في 543 نانومتر، وجمع الانبعاثات في 570-600 نانومتر.
    • بدء المرحلة الثانية الذي يتوافق مع HPTS الإثارة في 458 نانومتر، وجمع الانبعاثات في 505-525 نانومتر وSNARF-1 الإثارة في 543 نانومتر، وجمع الانبعاثات في 640-650 نانومتر.
    • يتم تعيين الفتحة مبائر إلى 175 ميكرومتر افتراضيا ويحتاج الفتحة الأمثل لتعيين يدويا في 300 ميكرون.
    • تأخذ الصورة عن طريق التراص الأفقي المسلسل المقاطع البصرية (800 × 800 بكسل) من 0.4 ميكرومتر سمك.

ملاحظة: ثمة هدف 40X من المفيد أن نلاحظ عدة خلايا في وقت واحد ويعمل بشكل جيد للعرض العضية. ومع ذلك، القرار المكانية وكثافة إشارة وباتحققت ص باستخدام الهدف 60X النفط. بالإضافة إلى ذلك، ليس هناك الإثارة أو الانبعاثات عبر الحديث بين اثنين من الأصباغ.

7. معايرة مجسات استشعار درجة الحموضة

  1. قبل المعايرة، وإزالة المتوسطة من الطبق الثقافة المحتضنة سابقا مع HPTS وSNARF-1، وغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني العقيمة ثم إضافة 2 مل من أحد الحلول المعايرة الخمسة.
  2. وضع الطبق الثقافة في غرفة المرحلة متحد البؤر.
  3. انتقل إلى الحصول على الصور مرور الزمن وفقا للإعدادات التالية:
    1. تعيين عدد من الصور والأوقات مدة الفاصل الزمني للتجربة.
      ملاحظة: نحن عادة استخدام فاصل 1 دقيقة بين الصور لمدة تصل إلى 30 دقيقة.
    2. برمجة لإغلاق مصراع بين اقتناء كل صورة.
  4. تسجيل كثافة مضان لكل دقيقة في برنامج جداول البيانات وتحديد الوقت عند كثافة مضان هو ثابت. درجة الحموضة داخل الخلايا عادة مستقرة بعد 15-20 دقيقة.
  5. REPEAT الخطوات 7،1-7،4 باستخدام طبق ثقافة جديدة لكل حل المعايرة المتبقية.

8. الحصول على البيانات

  1. مرة واحدة وقد تم ذلك المعايرة، والحصول على بيانات عينة 4-5 مجالات اختيارها عشوائيا تحتوي على خلايا 15-20 في الميدان. ويتم الحصول على صورتين لكل حقل: واحدة لوصفها HPTS (الحويصلات) والثانية لSNARF-1 وضع العلامات (العصارة الخلوية).
  2. خلفية مضان (منطقة خارج الخلية) يتم طرح رقميا من الصور الفلورسنت من كلا تحقيقات. ويتم اختيار الحويصلات وصفت والعصارة الخلوية من الصور الخاصة بها المخزنة باستخدام قناع ثنائي. لكل مسبار درجة الحموضة الاستشعار عن بعد، ويتم قياس كثافة مضان على نطاق والعددية (0-4،095 مقياس مستوى الرمادي). يتم احتساب متوسط ​​كثافة لجميع بكسل في عضية أو السيتوبلازم وتستخدم لحساب قيم نسب مضان.

9. تحليل البيانات

  1. تتوفر تجاريا لتحليل البيانات وحزم البرمجيات المختلفة. أيFluoview البرمجيات.
  2. في جدول بيانات، والقيم سجل وحساب نسب مضان على النحو التالي: في حالة HPTS، R = (F 458 نانومتر / F 405 نانومتر) و، في حالة SNARF-1، R = (F 644 نانومتر / F 584 نانومتر ).
  3. رسم البيانات باستخدام برنامج الرسوم البيانية العلمية مثل GraphPad بريزم. المؤامرة يجب تصوير نسب مضان (Y-المحور) بوصفها وظيفة من درجة الحموضة (المحور السيني). ويتحقق منحنى المناسب باستخدام الانحدار غير الخطية.
  4. جمع شدة مضان من العينات كما هو موضح في الخطوة 8.2 وحساب نسب مضان. استخدام منحنيات المعايرة لتحويل نسب إلى قيم درجة الحموضة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لقياس درجة الحموضة في وقت واحد في كل من داخل الخلايا والمقصورات الخلية endosomal / الليزوزومية، استخدمت الفلورسنت تحقيقات الحموضة الاستشعار ratiometric SNARF-1 وHPTS. SNARF-1 يقتصر على مقصورة عصاري خلوي في حين يسمح HPTS قياس درجة الحموضة ratiometric من المقصورة endosomal / الليزوزومية. تحميل الخلية مع HPTS لمدة 16 ساعة يسمح توطين انتقائية في الإندوسومات / 4 الجسيمات الحالة. ويرد مثال نموذجي من مضان سجلت من الخلايا HT 1080 محملة تحقيقات الحموضة الاستشعار عن بعد في الشكل 2A. تم الحصول على أدلة على أن HPTS تسميات كلا endosomal والليزوزومية المقصورات التي كتبها المشارك تلطيخ مع ترانسفيرين اليكسا 546 مترافق (الإندوسومات) أو التحقيق lysotrophic الفلورسنت (Lysotracker ديب Reddye). وأظهرت البيانات بوضوح أن HPTS الملون على حد سواء مقصورات الشكل 2A.

باستخدام المنهجية الموصوفة أعلاه، تم تحديد قيم درجة الحموضة داخل الخلايا في الخلايا الحية باستخداممنحنى المعايرة لكل 2B و 2C الأرقام التحقيق، استنادا إلى خصائص ratiometric من كل صبغة حساسة لدرجة الحموضة. تم استخدام حلول المعايرة خمسة لتحويل كثافة مضان إلى وحدات درجة الحموضة. وأفادت بيانات من ثلاث المعايرة مستقلة لكل درجة الحموضة الاستشعار مسبار الشكل 2C. كل نقطة بيانات يمثل نسبة كثافة مضان في موجات الإثارة من 458/405 نانومتر لHPTS أو موجات انبعاث 644/584 نانومتر لSNARF-1 في الرقم الهيدروجيني معين. وأظهرت منحنيات المعايرة لكل من تحقيقات علاقة غير الخطية التي كانت أفضل مزودة المعادلة الأسية الشكل 2C. تم تقييم كفاءة طريقة للكشف عن تغيرات درجة الحموضة الخلوية المرتبطة مقصورة في الخلايا الحية باستخدام HT 1080 NH 4 CL، قاعدة ضعيفة أن يزيد درجة الحموضة داخل الخلايا، bafilomycin A1، مثبط الدوائية للV-ATPases وEIPA، وهو NHE- 1 المانع. أثار NH 4 الكلورين intravesicular وخلويزيادة درجة الحموضة solic 6،35-7،10 و7،00-7،40، أرقام التوالي 3A 3B و. Bafilomycin A1 يسببها التقلون من endosomal والليزوزومية مقصورات دون تغيير درجة الحموضة عصاري خلوي. في المقابل، EIPA بفعل تحمض العصارة الخلوية التوصل إلى قيمة الرقم الهيدروجيني من 6.62 بالمقارنة مع 7.00 في الخلايا غير المعالجة أرقام 3A 3B و.

الشكل 1
الشكل 1. رسم تخطيطي من إعدادات اقتناء للمتحد البؤر مجهر المسح بالليزر. (أ) يتم تعيين المرحلة الأولى لإثارة HPTS في 405 نانومتر وSNARF-1 في 543 نانومتر في وقت واحد من خلال مزدوج اللون (DM405/488/543/633) المرآة. وسجلت الانبعاثات مضان الأول لHPTS في 505-525 نانومتر باستخدام مرآة مزدوج اللون (SDM560). ثم يتم رصد الانبعاثات مضان من SNARF-1 من خلال bandpaق ق مرشح تدخل في نطاق 570-600 نانومتر. (B) يتم تعيين المرحلة الثانية لجمع في وقت واحد الانبعاثات مضان من HPTS (غير شامل، 458 نانومتر) وSNARF-1 (غير شامل، 543 نانومتر). التحقيق الإثارة التي تولدها شعاع الليزر يمر عبر الخائن شعاع (BS20/80) والانبعاثات مضان ليتم جمع كل مسبار من خلال المرايا مزدوج اللون المستخدمة في المرحلة الأولى. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الرقم 2. في المعايرة في الموقع من تحقيقات الحموضة الاستشعار عن بعد. (A) وصور ممثل HPTS وSNARF-1 التعريب شبه الخلوية في HT-1080 خلايا ليفية. تظهر الصور العليا التي SNARF-1 تسميات السيتوبلازم بينما HPTيظهر مضان S المرتبطة توطين intravesicular. وحضنت الخلايا HT 1080 لمدة 30 دقيقة مع ترانسفيرين اليكسا 546 مترافق (5 ميكروغرام / مل) أو صبغة lysotrophic (Lysotracker ديب Reddye) (100 نانومتر)، على التوالي. تظهر الصور التي أقل HPTS colocalizes مع ترانسفيرين والصبغة lysotrophic (60X). (B) وصور الممثل على حد سواء تحقيقات الحموضة الاستشعار عن بعد في الخلايا المحتضنة لمدة 15 دقيقة مع حلول المعايرة في درجة الحموضة 6.0 و 7.5 درجة الحموضة (C) العلاقة بين كثافة مضان نسب لHPTS وSNARF-1 تحديد باستخدام حلول المعايرة بوصفها وظيفة من درجة الحموضة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3
الرقم 3. التحوير ط الإقليم الشماليواستخدمت racellular درجة الحموضة التي كتبها bafilomycin A1، EIPA وNH 4 CL. مثبطات الدوائية (bafilomycin A1، EIPA) ودرجة الحموضة داخل الخلايا المغير NH 4 الكلورين للتحقق من صحة المنهجية. تظهر الرسوم البيانية قيم درجة الحموضة سجلت في حجرة endosomal / الليزوزومية (A) أو السيتوبلازم (ب) من الخلايا HT 1080 محملة HPTS وSNARF-1 والمحتضنة لمدة 30 دقيقة في وجود أو غياب (السيطرة) من NH 4 Cl (و 20 ملي)، EIPA (25 ميكرومتر) أو bafilomycin A1 (100 نانومتر). يتم تمثيل البيانات كما يعني + ووزارة شؤون المرأة (ع ** 0.005 *** 0.0001 ع).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هناك حاجة إلى قياس درجة الحموضة الكمي في مجال التصوير الخلية الحية من مقصورات الخلوية المختلفة لقياس درجة الحموضة بدقة الاختلافات في استجابات الخلايا إلى التحديات الخارجية. ومع ذلك، واحدة من العقبات الرئيسية التي لا يزال هو بسهولة وتحديدا استهداف مقصورات الخلوية. في هذا الصدد، أبرزت عدد قليل من الدراسات استخدام HPTS كمؤشر درجة الحموضة داخل الخلايا التي أدخلت الخلايا عن طريق التثقيب الكهربائي أو حقن مكروي 8-10. هذه التقنيات تعاني من عيوب خطيرة، وهي تسبب أضرارا واسعة النطاق التثقيب الكهربائي للخلايا، وحقن مكروي يتطلب معدات خاصة والمهارات التقنية. من الفائدة، هينتون وآخرون، وذكرت في وقت سابق ان HPTS يمكن تناولها من قبل الخلايا من خلال عملية الإحتساء وأن الجمع بين SNARF-1 وHPTS يمكن استخدامها لمراقبة درجة الحموضة في العصارة الخلوية وendosomal / المقصورات الليزوزومية 3 . وقد استخدمنا هذه الخاصية لتسجيل التغيرات في الرقم الهيدروجيني compartm الليزوزومية / endosomalوالأنف والحنجرة من الخلايا HT-1080 حية. تم الحصول على أدلة على أن HPTS كانت تقع في هذا الحيز، وبالتالي، يمكن أن يكون بمثابة مؤشر الرقم الهيدروجيني موثوق بها عن طريق التعاون مع تلطيخ fluorophore مترافق ترانسفيرين، علامة من المقصورة الليزوزومية / endosomal، أو مع صبغة حمضة أن تسميات معظمها الجسيمات الحالة الشكل 2. وبالإضافة إلى ذلك، أشارت استخدام مختلف جهري درجة الحموضة داخل الخلايا تستهدف مقصورات الخلوية المتميزة التي bafilomycin A1 زيادة درجة الحموضة تحديدا intravesicular دون تغيير درجة الحموضة حشوية. في المقابل، EIPA غيرت أساسا عصاري خلوي درجة الحموضة ولكن لم يكن لها أثر قليلة أو معدومة على endosomal والليزوزومية درجة الحموضة بينما كلوريد الأمونيوم تتأثر درجة الحموضة كل من المقصورات. قدمت هذه النتائج الأدلة على أن SNARF-1 وHPTS يمكن استخدامها لرصد التغيرات في وقت واحد ودرجة الحموضة في هذه اثنين من مقصورات الخلوية المختلفة.

واحدة سمة هامة من الطريقة الموصوفة هنا هو استخدام متحد البؤر المسح الضوئي ليزر المجهري. معظم الدراسات الريبوrted في الأدب على قياسات درجة الحموضة داخل الخلايا وقد تم القيام به من قبل spectrofluorometry. على الرغم من السهل استخدام وتوفير الحصول على البيانات السريعة، فإن هذا النهج لا يسمح مراقبة الخلايا أثناء التجربة. قد يصبح هذا العيب من الأهمية نظرا لأنه كان تجربتنا أنه خلال خطوة المعايرة، الحضانة الممنوح بموجب الحمضية (الرقم الهيدروجيني 5.5) أو القلوية (الرقم الهيدروجيني 8.0) الأحكام قد تؤثر سلبا على مختلف أنواع الخلايا وتؤدي إلى موت الخلايا المبرمج. في حالة الخلايا HT 1080، يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج تألق ذاتي الحمراء، وبالتالي التدخل في مضان تعتمد على درجة الحموضة من SNARF-1 (لا تظهر البيانات). للتحايل على هذه المشكلة، وقد استخدمنا طبق ثقافة منفصلة لكل المعايرة والتجارب التخلص منها حيث لوحظت علامات موت الخلايا المبرمج أو التعديلات الخلايا الأخرى. استخدام المجهر متحد البؤر لقياس درجة الحموضة أيضا يجعل تحليل البيانات أسهل. على سبيل المثال، وتحليل الصور متحد البؤر المجهري مضان يمكن استخدامها لتجاهل القطع الأثرية، apoptotiج الخلايا والضوضاء الخلفية، مما يجعل الحسابات أكثر سهولة ودقة.

على الرغم من أن الطريقة الموصوفة هنا يوفر مزايا عديدة أكثر المناهج الأخرى، لديها بعض القيود. واحدة من هذه هي ذات الصلة لمختلف ظروف التحميل المطلوبة لكل التحقيق. فيما يتعلق HPTS، الصبغة لابد من تناولها من قبل الإحتساء. يتطلب هذا التقييد أن الخلايا يجب أن يحتفظ به لفترة ممتدة من الزمن (مثلا 12 ساعة) في متوسطة تستكمل المصل لتعزيز الإحتساء وبالتالي وضع العلامات من المقصورة التقامي. في المقابل، يحتاج خلايا نفيذ SNARF-1 لتكون المحتضنة في وسط المصل خالية لمنع إمكانية acetoxymethyl استر (ص) من قبل التحلل المائي الاسترات غير محددة المحتوية على مصل. وهذه القيود استبعاد البروتوكولات التجريبية التي تتطلب ظروف خلية ثقافة التحميل غير متوافق. بالإضافة إلى ذلك، حساسية HPTS إلى الوسط الحمضي هو الحد الهامة. كما هو مبين في الشكل 2، وشدة luorescence من HPTS متحمس في 458 نانومتر تظهر الحد الأدنى من الاختلاف في درجة الحموضة 6.0 أو أقل، مع نسب قريبة من القيم الخلفية. هذه الخاصية الجوهرية للHPTS يجب أن تؤخذ بعين الاعتبار في حالة الدراسات المقصورات الخلوية حمضية جدا مثل الجسيمات الحالة التي تحتوي على قيم درجة الحموضة منخفضة تصل إلى 4،0-5،0. ومع ذلك، على حد علمنا، ليست سوى HPTS الصبغة ratiometric المتاحة التي يمكن استخدامها لقياس درجة الحموضة intraendosomal. على سبيل المثال، الصبغة lysosensor يشيع استخدامها في الغالب سوف التقسيم داخل مقصورة الليزوزومية أكثر حمضية. ومدى تقسيم هذه الصبغة داخل مقصورة endosomal تعتمد على قيم درجة الحموضة داخل هذه الحويصلات، وهو العيب الرئيسي عند قياس درجة الحموضة intravesicular في الخلايا حيث يتم تبديل endosomal درجة الحموضة التوازن.

في الختام، نحن تصف هنا نهجا لقياس وقت واحد عصاري خلوي وendosomal قيم درجة الحموضة في الخلايا واحد. هذا مهم بشكل خاص لدراسة درجة الحموضة التوازن في الخلايا وهرالطفرات البريد أو المخدرات يمكن أن تؤثر على هروب رأس المال وتدفق البروتونات في الإندوسومات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Solutions for calibration
Sodium chloride Fischer L-11621
Potassium chloride Fischer M-12445
D-Glucose (dextrose) Fischer D16-1
Magnesium sulfate Fischer M65-500
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Calcium chloride dihydrate Fischer M-1612
Deionized water N/A N/A
Nigericin Calbiochem 481990 Toxic by inhalation or in contact with skin
Keep protected from the light at 4 °C
Culture dishes ∅ 35mm BD Biosciences 354456
pH-sensing probes
8-Hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid (HPTS) Life technologies H-348 Keep away from the light at room temperature
5-(and-6)-Carboxy SNARF®-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate Life technologies C-1271 Keep away from the light and humidity at -20 °C
Dimethyl Sufoxide (DMSO) Fischer BP231-1  Harmful
Phosphate buffered saline (PBS) 100X
Potassium chloride Fischer M-12445 20 g
Sodium phosphate monobasic Fischer S369-1 115 g
Potassium phosphate monobasic J.T Baker 3246-01 20 g
Deionized water N/A N/A Bring to 1 L
Autoclave and adjust pH to 7.4
Phosphate buffered saline (PBS) 1X
PBS 100X N/A N/A 50 ml
Sodium chloride Fischer L-11621 40.5 g
Deoinized water N/A N/A Bring to 5 L
pH modulators
Bafilomycin A1 Sigma-Aldrich B-1793
5-(N-Ethyl-N-isopropyl)amiloride (EIPA) Sigma-Aldrich A3085
Ammonium chloride Fischer A649-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Demaurex, N. pH Homeostasis of cellular organelles. News Physiol Sci. 17, 1-5 (2002).
  2. Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression. Nat Rev Cancer. 11, 671-677 (2011).
  3. Hinton, A., et al. Function of a subunit isoforms of the V-ATPase in pH homeostasis and in vitro invasion of MDA-MB231 human breast cancer cells. J Biol Chem. 284, 16400-16408 (2009).
  4. Overly, C. C., Lee, K. D., Berthiaume, E., Hollenbeck, P. J. Quantitative measurement of intraorganelle pH in the endosomal-lysosomal pathway in neurons by using ratiometric imaging with pyranine. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 3156-3160 (1995).
  5. Drose, S., Altendorf, K. Bafilomycins and concanamycins as inhibitors of V-ATPases and P-ATPases. J Exp Biol. 200, 1-8 (1997).
  6. Pedersen, S. F., King, S. A., Nygaard, E. B., Rigor, R. R., Cala, P. M. NHE1 inhibition by amiloride- and benzoylguanidine-type compounds. Inhibitor binding loci deduced from chimeras of NHE1 homologues with endogenous differences in inhibitor sensitivity. J Biol Chem. 282, 19716-19727 (2007).
  7. Alfonso, A., Cabado, A. G., Vieytes, M. R., Botana, L. M. Calcium-pH crosstalks in rat mast cells: cytosolic alkalinization, but not intracellular calcium release, is a sufficient signal for degranulation. Br J Pharmacol. 130, 1809-1816 (2000).
  8. Han, J., Burgess, K. Fluorescent indicators for intracellular pH. Chem Rev. 110, 2709-2728 (2010).
  9. Giuliano, K. A., Gillies, R. J. Determination of intracellular pH of BALB/c-3T3 cells using the fluorescence of pyranine. Anal Biochem. 167, 362-371 (1987).
  10. Willoughby, D., Thomas, R., Schwiening, C. The effects of intracellular pH changes on resting cytosolic calcium in voltage-clamped snail neurones. J Physiol. 530, 405-416 (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics