Измерение Одновременное рН в эндоцитотических и цитозольные отсеков в живых клетках с помощью конфокальной микроскопии

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lucien, F., Harper, K., Pelletier, P. P., Volkov, L., Dubois, C. M. Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (86), e51395, doi:10.3791/51395 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. Приготовление растворов для мобильных телефонов рН Калибровка

  1. Добавить следующие соединения пяти отдельных 50 мл конические пробирки подготовить 5 решения, которые будут использоваться для калибровки:
    • NaCl (1 мл 1 М NaCl) (1 М NaCl = 0,58 г в 10 мл H 2 0)
    • KCl (6,75 мл 1 М KCl) (1 М KCl = 0,75 г в 10 мл H 2 0)
    • Глюкоза (1 мл 1 М D-глюкозы) (1M D-Глюкоза = 1,80 г в 10 мл H 2 0)
    • MgS0 4 (0,05 мл 1 М MgSO 4) (1 М MgSO 4 = 1,20 г в 10 мл H 2 0)
    • 20 мМ HEPES (1 мл 1М HEPES) (1 М HEPES = 2,38 г в 10 мл H 2 0)
    • CaCl 2 (0,05 мл 1 М CaCl 2) (1 М CaCl 2 = 1,47 г в 10 мл H 2 0)
      Подготовить все решения в дважды дистиллированной H 2 O (DDH 2 O).
  2. Заполните каждое решение с 35 мл DDH 2 O и смешать с магнитной мешалкой, пока таксобность достигнута.
  3. Отрегулируйте рН каждого раствора 1 н КОН или 1 N HCl для получения значения рН 5,5, 6,0, 6,5, 7,0 и 7,5. Затем, отрегулировать громкость с деионизированной водой до конечного объема 50 мл.
  4. Мера 5 мг нигерицина и добавить его в 670 мкл абсолютного этанола подготовить 10 мМ нигерицин маточного раствора.
    Внимание: нигерицин высоко токсичен и следует обращаться с большой осторожностью (перчатки, защитные очки и маски). Смешайте раствор инверсией пока нигерицин полностью не растворится.
  5. Добавить 0,05 мл 10 мМ нигерицина (конечная концентрация 10 мкМ), чтобы каждого калибровочного раствора. Нигерицин является ионофор что увеличивает клеточной проницаемости мембраны и вызывает уравновешивание внутриклеточного и внеклеточного рН в присутствии концентрации внеклеточного деполяризующее K +.
  6. Калибровочные растворы можно хранить до 1 месяца при 4 ° С

2. Подготовка Сотовый

  1. Под биологической беу капот, семян клетки в 35 мм х 10 мм чашки для культивирования в 2 мл ростовой среды с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и антибиотиков. Используйте количество клеток, необходимых для обеспечения приблизительно 50% слияния после 24 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В наших экспериментах мы используем клеточной линии НТ-1080 и пластину 1 х 10 5 клеток на блюдо культуры.
  2. Определить количество чашек для культивирования, необходимых для эксперимента и пластины 5 дополнительных чашек для культивирования, которые будут использоваться для калибровки.
  3. Место культуры блюда в 37 ° C / 5% СО 2 инкубатора в течение не менее 24 часов.

3. Подготовка зондов рН-чувствительных

  1. Подготовка 1М исходного раствора флуоресцентный зонд рН 8-hydroxypyrene-1, 3,6 трисульфоновой кислотой, тринатриева соль (HPTs / pyranine) в DDH 2 0. Это решение должно храниться при комнатной температуре в защищенном от света.
  2. Подготовка исходного раствора 1 мМ 5 - (и-6)-карбоновой seminaphthorhodafluor ацетоксиметил эфир ацетат (C-Snarf-1 утра; называется thereâосле Snarf-1) растворением 1 мг Snarf-1 в 1,76 мл ДМСО. Тщательно перемешайте повторным пипетированием. Snarf-1 решение необходимо хранить при -20 ° С в защищенном от света.

4. Маркировка Сотовый

  1. Шестнадцать часов до визуализации живых клеток, добавить 2 мкл 1М HPTs маточного раствора (конечная концентрация 1 мм) с каждой культуры блюдо, содержащих 2 мл полной среды.
  2. Верните чашки для культивирования в инкубатор. HPTs зонд клеток impermeant, поэтому этикетке органелл зонд должен быть рассмотрен пиноцитозом. Это условие требует, чтобы сотовые инкубации с HPTs выполняются в сыворотки дополнена культуральной среде.
  3. После инкубации с HPTs, промыть клетки дважды стерильной PBS и добавляют 2 мл бессывороточной среде в течение по крайней мере 2 часов. Инкубация с Snarf-1 должен быть выполнен в бессывороточной среде, так как в сыворотке крови может предотвратить поглощение зонда.
  4. Добавить 10 мкл Snarf-1 исходного раствора 1 мм, чтобы обеспечить афИнал концентрации 5 мкМ и позволяют клетки инкубируют в течение 20 мин при 37 ° С, при слабом освещении. C-Snarf-1 концентрация и время инкубации может варьироваться в зависимости от типа клеток.
  5. В конце инкубации промыть клетки дважды в стерильной PBS и добавляют 2 мл бессывороточной среды.

5. Добавление рН модуляторов

  1. Чтобы оценить, может ли метод обнаружения изменений рН в клетках, могут быть использованы различные реагенты, которые модулируют внутриклеточный рН:
    • Bafilomycin А1, специфический ингибитор V-АТФазы 5
    • Na + / H +-обмена изоформы 1 (NHE-1) 6
    • NH 4 Cl, слабым основанием, что повышает внутриклеточный рН 7
    1. Подготовьте исходные растворы реагентов, упомянутых выше:
      • Bafilomycin A1: добавить 10 мкг bafilomycin А1 до 160 мкл ДМСО, чтобы получить исходный раствор 100 мкМ
      • EIPA: добавить 25 мг EIPA до 1,67 мл метанола в obtaiпа конечная концентрация 50 мМ
      • NH 4 Cl: растворить 0,53 г хлорида аммония в 10 мл DDH 2 O с получением конечной концентрации 1 мМ.

      Примечание: Все исходные растворы должны храниться при температуре 4 ° С в течение bafilomycin А1, которые должны быть сохранены при -20 ° С в защищенном от света кроме.
    2. В отдельных культуральные чашки, добавить один из реагентов, как описано ниже:
      • 2 мкл 100 мкМ bafilomycin A1 (конечная концентрация 100 нМ)
      • 1 мкл 50 мМ EIPA (конечная концентрация 25 мкМ)
      • 40 мкл 1М NH 4 Cl (конечная концентрация 20 мМ)
    3. Инкубируйте клетки в течение 30 мин при 37 ° С
  2. Перейдите к получения изображений.

6. Технические характеристики визуализации микроскопа Онлайн-клеток и настройки с приобретением

  1. Выполните изображений живых клеток, используя цель 40X установлен на спектральной перевернутой сканирующей конфокальной microscoре оснащен моторизованным этапе XY, камеры, который вмещает стеклянным дном чашки для культивирования в экологически управляемой (температура, влажность, CO 2) стадии инкубатора.
  2. Конфокальной инструмент (Olympus FV1000) используется здесь оборудован:
    • Диодный лазер 405 нм
    • Аргоновый лазер 40 мВт (458 нм, 488 нм, 515 нм)
    • Неоновый лазер гелия (543 нм)
    • Флюорит 10X цель, NA0.4
    • LUCPLFLN 40X цель, NA0.60
    • Масло цель PLAPONSC ПЛАН APO 60X, NA1.4
    • Дихроичное зеркало DM 405/458/488/543
    • СДМ 560 и еще SDM 640 дихроичных фильтров
    • BA655-755 барьер фильтр
    • Светоделитель BS20/80
    • Анализ данных программное обеспечение для сбора и анализа изображений,
  3. После того, как этап инкубатор прогреется до 37 ° С и микроскопа устанавливается, место культуры блюдо ранее инкубировали с HPTs и Snarf-1 в конфокальной изображения камеры этап.
  4. осле обнаружения площадь интерес, настроить параметры на приобретение программного обеспечения Рисунок 1.
    • Настройте два набора виртуальных каналов.
    • Инициировать первый этап, который соответствует возбуждения HPTs при 405 нм и сбора излучения на 505 - 525 нм и Snarf-1 возбуждении на 543 нм и сбора излучения на 570 - 600 нм.
    • Инициировать второй этап, который соответствует возбуждения HPTs на 458 нм и сбора излучения на 505 - 525 нм и Snarf-1 возбуждении на 543 нм и сбора излучения на 640 - 650 нм.
    • Конфокальной диафрагмы устанавливается до 175 мкм по умолчанию и оптимальная диафрагма должна быть вручную установлена ​​на уровне 300 мкм.
    • Возьмите изображение путем укладки последовательных горизонтальных оптических срезов (800 х 800 пикселей) 0,4 мкм толщиной.

ПРИМЕЧАНИЕ: 40X цель полезна для наблюдения несколько ячеек одновременно и хорошо работает для просмотра органелл. Тем не менее, пространственное разрешение и интенсивность сигнала являются Беттг достигается с помощью масла цели 60X. Кроме того, нет возбуждение или излучение перекрестные помехи между двумя красителей.

7. Калибровка зондов рН-чувствительных

  1. Перед калибровкой удалить среды из культуры блюдо ранее инкубированной с HPTs и Snarf-1, мыть дважды стерильной PBS, а затем добавить 2 мл одного из пяти калибровочных растворов.
  2. Место культуры блюдо в конфокальной камерной сцене.
  3. Перейдите к покадровой получения изображений в соответствии со следующими настройками:
    1. Установите количество изображений и интервальных времен по продолжительности в эксперименте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы обычно используют интервал 1 мин между изображениями на срок до 30 минут.
    2. Программирование затвор, чтобы закрыть между приобретением каждого изображения.
  4. Запишите интенсивности флуоресценции в минуту в программное обеспечение электронной таблицы и определить время, когда интенсивность флуоресценции устойчив. Внутриклеточный рН обычно стабильны после 15 - 20 мин.
  5. REPEAT шаги 7,1 до 7,4 с использованием новой культуры блюдо для каждого оставшегося калибровочного раствора.

8. Сбора данных

  1. После калибровки было сделано, приобрести образцы данных от 4-5 произвольно выбранных полей, содержащих 15-20 клеток на поле. Два изображения получаются для каждого поля: одно для HPTs маркировки (везикул), а второй для Snarf-1 маркировки (цитозоля).
  2. Фоновой флуоресценции (внеклеточный область) в цифровой форме вычитают из флуоресцентных изображений обоих зондов. Меченые пузырьки и цитозоль из своих сохраненных изображений выбираются с помощью двоичного маску. Для каждого рН-чувствительного зонда, интенсивности флуоресценции измеряется на числовой шкале (0-4,095 шкалы уровней серого). Среднее значение интенсивности для всех пикселей в органеллы цитоплазмы или рассчитывается и значения используются для вычисления коэффициентов флуоресценции.

9. Анализ данных

  1. Различные программные пакеты являются коммерчески доступными для анализа данных. Т.е.FluoView Программное обеспечение.
  2. В электронной таблице рекордных значений и рассчитать коэффициенты флуоресценции следующим образом: В случае HPTs, R = (F 458 нм / F 405 нм) и, в случае Snarf-1, R = (F 644 нм / F 584 нм ).
  3. Участок данные, используя научную программное обеспечение графиков таких как GraphPad Prism. Сюжет должен изобразить отношения флуоресценции (Y-ось) в зависимости от рН (оси Х). Место Кривая достигается с помощью нелинейной регрессии.
  4. Сбор интенсивности флуоресценции образцов, как описано в шаге 8.2 и рассчитать коэффициенты флуоресценции. С помощью калибровочных кривых для преобразования коэффициентов в значениях рН.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Для одновременного измерения рН в обоих отсеках внутриклеточных и эндосом / лизосом клеток были использованы логометрических флуоресцентные рН-чувствительный зонды Snarf-1 и HPTs. Snarf-1 ограничен цитозольной отсека в то время как HPTs позволяет измерять пропорциональный рН эндосом / лизосом отсека. Сотовый загрузка с HPTs в течение 16 часов позволяет его селективный локализацию в эндосомах / лизосом 4. Типичным примером флуоресценции, записанного с HT-1080 клеток, нагруженных зондов рН-чувствительных показано на рисунке 2А. Доказательства того, что HPTs этикетки и эндосомные и лизосомальные отсеки были получены совместным окрашиванием с Alexa 546-конъюгированного трансферрина (эндосом) или флуоресцентным зондом (lysotrophic Lysotracker Deep Reddye). Данные ясно показывают, что HPTs окрашенных оба отделения Рисунок 2A.

Использование методики, описанной выше, внутриклеточные значения рН в живых клетках определяли с помощьюКалибровочная кривая для каждого зонда и 2С фиг, на основе логометрических свойств каждого рН-чувствительного красителя. Пять калибровочные растворы были использованы для преобразования интенсивность флуоресценции в единицы рН. Данные из трех независимых калибровок сообщается для каждого рН-чувствительного зонда фиг.2С. Каждая точка данных представляет собой отношение интенсивности флуоресценции при длине волны возбуждения 458/405 нм для HPTs или длин волн излучения 644/584 нм для Snarf-1 при заданном значении рН. Калибровочные кривые для обоих зондов показали нелинейную отношения, которые лучше всего приспособленную с экспоненциальным уравнением рис. 2С. Эффективность метода для обнаружения сотовых отсека связанных изменение рН оценивали в живых HT-1080 клеток с помощью NH 4 Cl, слабого основания, который увеличивает внутриклеточное рН, bafilomycin A1, фармакологический ингибитор клиновых АТФаз и EIPA, в NHE- 1 ингибитор. NH 4 Cl срабатывает внутрипузырное и цитоSolic увеличивается рН от 6,35 до 7,10 и от 7,00 до 7,40, соответственно рисунках 3a и 3b. Bafilomycin А1 индуцированной алкалинизации эндосомных и лизосомальных отсеков без изменения цитозольную рН. В противоположность этому, EIPA индуцированный подкисление цитозоле достигая значения рН 6,62 по сравнению с 7,00 в необработанных клетках фиг.3А и 3В.

Рисунок 1
Рисунок 1. Схемы настроек приобретение для конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. (А) Первая фаза устанавливается для возбуждения HPTs при 405 нм и Snarf-1 на 543 нм одновременно через дихроичных (DM405/488/543/633) зеркало. Флуоресценции сначала записывается для HPTs на 505-525 нм с использованием дихроичных зеркал (SDM560). Флуоресцентное излучение Snarf-1 затем контролируют через bandpaсс фильтр помех в диапазоне 570-600 нм. (В) Второй этап устанавливается одновременно собирать флуоресцентное излучение HPTs (отл, 458 нм) и Snarf-1 (отл, 543 нм). Возбуждения зонда порожденный лазерный луч проходит через расщепитель луча (BS20/80) и флуоресценции для каждого зонда собираются с помощью дихроичных зеркал, используемых на первом этапе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2. В месте калибровки датчиков рН зондирования. (А) Типичные изображения HPTs и Snarf-1 субклеточном локализации в HT-1080 фибросаркомы клеток. Верхние изображения показывают, что Snarf-1 этикетки цитоплазму тогда HPTS-ассоциированных флуоресценции показывает внутрипузырное локализацию. HT-1080 клетки инкубировали в течение 30 мин с Alexa 546-конъюгированного трансферрина (5 мкг / мл) или lysotrophic красителя (Lysotracker Deep Reddye) (100 нМ), соответственно. Нижние изображения показывают, что HPTs локализуется с трансферрина и lysotrophic красителя (60X). (В) Типичные изображения обоих зондов рН-чувствительных в клетках, инкубированных в течение 15 мин с калибровочных растворов при рН 6,0 и рН 7,5. (C) Знакомство интенсивности флуоресценции соотношения для HPTs и Snarf-1 определяется с использованием калибровочных растворов в зависимости от рН. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Модуляция я нтracellular рН на bafilomycin A1, EIPA и NH 4 Cl. Фармакологические ингибиторы (bafilomycin A1, EIPA) и внутриклеточный рН модулятор NH 4 Cl были использованы для проверки методологии. Графики показывают значения рН, записанные в эндосом / лизосом отсека (А) или в цитоплазме (В) HT-1080 клетками, нагруженными HPTs и Snarf-1 и инкубируют в течение 30 мин в присутствии или в отсутствие (контроль) NH 4 Cl ( 20 мМ), EIPA (25 мкМ) или bafilomycin A1 (100 нМ). Данные представлены как среднее + SEM (** Р 0,005, *** P 0,0001).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Количественное измерение рН в живых клеток визуализации различных клеточных отсеках необходима, чтобы точно измерить вариации рН в клеточных ответов на внешние вызовы. Тем не менее, одним из основных препятствий, что остается только легко и специально направлены сотовой отсеков. В этом отношении несколько исследований выявили использование HPTs как внутриклеточный рН-индикатора, введенного в клетки путем электропорации микроинъекции или 8-10. Эти методы страдают от серьезных недостатков, а именно электропорации вызывает обширные повреждения клеток, и микроинъекции требует специального оборудования и технических навыков. Интересно, что Hinton и соавт., Ранее сообщалось, что HPTs может быть рассмотрен клеток с помощью процесса пиноцитоза и что сочетание Snarf-1 и HPTs может быть использован для контроля рН цитозоле и эндосом / лизосом отсеков 3 . Мы использовали это свойство для записи вариаций рН в лизосомального / эндосомный compartmЛОР живых HT-1080 клеток. Доказательства того, что HPTs был расположен в этом отделении и, следовательно, может служить надежным индикатором рН получали совместным окрашиванием флуорофора-сопряженных трансферрина, маркером лизосомального / эндосомный отсеке, или с ацидофильной красителя, которые в основном этикетки лизосом Рисунок 2. Кроме того, использование различных внутриклеточных модуляторов рН, направленных на различных клеточных компартментах показали, что bafilomycin A1 специально увеличена внутрипузырное рН без изменения цитоплазматической рН. В противоположность этому, EIPA основном изменены цитозольную рН, но не имели практически никакого влияния на эндосомных и лизосом рН в то время как хлорид аммония влияет рН обоих отсеках. Эти результаты получены данные, что Snarf-1 и HPTs могут быть использованы одновременно контролировать изменение рН в этих двух различных клеточных отсеках.

Одной из важных особенностей способа, описанного здесь, является использование конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Большинство исследований репоrted в литературе по измерениям внутриклеточных рН было сделано на спектрофлюориметре. Хотя простой в использовании и обеспечивает быстрый сбор данных, этот подход не позволяет наблюдение клеток во время эксперимента. Этот недостаток может стать значимости, так как это был наш опыт, что во время этапа калибровки, продлен инкубации в кислой (рН 5,5) или щелочной (рН 8,0) условия могут отрицательно повлиять на различные типы клеток и запускать апоптоз. В случае HT-1080 клеток, апоптоз приводит к красной флуоресценции, тем самым препятствуя рН-зависимого флуоресценции Snarf-1 (данные не показаны). Чтобы обойти эту проблему, мы использовали отдельный культуры блюдо для каждой калибровки и отбрасываются эксперименты, в которых наблюдались признаки апоптоза или другие изменения клеток. Использование конфокальной микроскопии для измерения рН также делает анализ данных легче. Например, анализ конфокальной флуоресцентной микроскопии изображений может быть использован для отмены артефакты, apoptotiC клетки и фонового шума, что делает расчеты проще и точнее.

Хотя метод, описанный здесь имеет много преимуществ по сравнению с другими подходами, она имеет некоторые ограничения. Один из них связан с различными условиями погрузки, необходимых для каждого зонда. Что касается HPTs, краситель должен быть принят до пиноцитозом. Это ограничение необходимо, чтобы клетки необходимо поддерживать в течение длительного периода времени (например, 12 ч) в не содержащей сыворотки среде, дополненной содействия пиноцитоза и тем самым маркировки эндоцитотического отсека. В противоположность этому, проникающий в клетку Snarf-1 должно быть инкубируют в бессывороточной среде, чтобы предотвратить возможность ацетоксиметил эфира (AM) гидролиза сыворотки, содержащей неспецифических эстераз. Эти ограничения исключит экспериментальных протоколов, которые требуют загрузки-несовместимы условия культивирования клеток. Кроме того, чувствительность HPTs в кислой среде является важным ограничением. Как показано на рисунке 2, Fluorescence интенсивности HPTs возбуждаемых на 458 нМ показать минимальное изменение при рН 6,0 и ниже, с коэффициентами, близкими к фоновым значениям. Это внутреннее свойство HPTs должны быть приняты во внимание в случае исследований очень кислых клеточных компартментах, таких как лизосомы, которые имеют значения рН как низко как 4,0 до 5,0. Однако, насколько нам известно, HPTs является единственным доступным пропорциональный краситель, который может быть использован для измерения intraendosomal рН. Например, широко используются lysosensor краситель будет в основном раздел в более кислой лизосомный компартмент. Степень разбиения этого красителя в эндосомный отсеке будет зависеть от рН в пределах этих пузырьков, который является основным недостатком при измерении внутрипузырное рН в клетках, где рН эндосом гомеостаз изменяется.

В заключение, мы опишем здесь подход для одновременного измерения цитозольные и эндосомные значения рН в одиночных камерах. Это особенно важно для изучения рН гомеостаза в клетках порогае мутации или препараты могут повлиять отток и приток протонов в эндосомах.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Solutions for calibration
Sodium chloride Fischer L-11621
Potassium chloride Fischer M-12445
D-Glucose (dextrose) Fischer D16-1
Magnesium sulfate Fischer M65-500
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Calcium chloride dihydrate Fischer M-1612
Deionized water N/A N/A
Nigericin Calbiochem 481990 Toxic by inhalation or in contact with skin
Keep protected from the light at 4 °C
Culture dishes ∅ 35mm BD Biosciences 354456
pH-sensing probes
8-Hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid (HPTS) Life technologies H-348 Keep away from the light at room temperature
5-(and-6)-Carboxy SNARF®-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate Life technologies C-1271 Keep away from the light and humidity at -20 °C
Dimethyl Sufoxide (DMSO) Fischer BP231-1  Harmful
Phosphate buffered saline (PBS) 100X
Potassium chloride Fischer M-12445 20 g
Sodium phosphate monobasic Fischer S369-1 115 g
Potassium phosphate monobasic J.T Baker 3246-01 20 g
Deionized water N/A N/A Bring to 1 L
Autoclave and adjust pH to 7.4
Phosphate buffered saline (PBS) 1X
PBS 100X N/A N/A 50 ml
Sodium chloride Fischer L-11621 40.5 g
Deoinized water N/A N/A Bring to 5 L
pH modulators
Bafilomycin A1 Sigma-Aldrich B-1793
5-(N-Ethyl-N-isopropyl)amiloride (EIPA) Sigma-Aldrich A3085
Ammonium chloride Fischer A649-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Demaurex, N. pH Homeostasis of cellular organelles. News Physiol Sci. 17, 1-5 (2002).
  2. Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression. Nat Rev Cancer. 11, 671-677 (2011).
  3. Hinton, A., et al. Function of a subunit isoforms of the V-ATPase in pH homeostasis and in vitro invasion of MDA-MB231 human breast cancer cells. J Biol Chem. 284, 16400-16408 (2009).
  4. Overly, C. C., Lee, K. D., Berthiaume, E., Hollenbeck, P. J. Quantitative measurement of intraorganelle pH in the endosomal-lysosomal pathway in neurons by using ratiometric imaging with pyranine. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 3156-3160 (1995).
  5. Drose, S., Altendorf, K. Bafilomycins and concanamycins as inhibitors of V-ATPases and P-ATPases. J Exp Biol. 200, 1-8 (1997).
  6. Pedersen, S. F., King, S. A., Nygaard, E. B., Rigor, R. R., Cala, P. M. NHE1 inhibition by amiloride- and benzoylguanidine-type compounds. Inhibitor binding loci deduced from chimeras of NHE1 homologues with endogenous differences in inhibitor sensitivity. J Biol Chem. 282, 19716-19727 (2007).
  7. Alfonso, A., Cabado, A. G., Vieytes, M. R., Botana, L. M. Calcium-pH crosstalks in rat mast cells: cytosolic alkalinization, but not intracellular calcium release, is a sufficient signal for degranulation. Br J Pharmacol. 130, 1809-1816 (2000).
  8. Han, J., Burgess, K. Fluorescent indicators for intracellular pH. Chem Rev. 110, 2709-2728 (2010).
  9. Giuliano, K. A., Gillies, R. J. Determination of intracellular pH of BALB/c-3T3 cells using the fluorescence of pyranine. Anal Biochem. 167, 362-371 (1987).
  10. Willoughby, D., Thomas, R., Schwiening, C. The effects of intracellular pH changes on resting cytosolic calcium in voltage-clamped snail neurones. J Physiol. 530, 405-416 (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics