מדידת pH בו זמנית בendocytic ותאי Cytosolic בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופיה confocal

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lucien, F., Harper, K., Pelletier, P. P., Volkov, L., Dubois, C. M. Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (86), e51395, doi:10.3791/51395 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. הכנה של פתרונות לסלולריים pH כיול

  1. הוסף את התרכובות הבאות לחמישה צינורות נפרדים 50 מיליליטר חרוטי להכין פתרונות 5 לשמש לכיול:
    • NaCl (1 מיליליטר של 1 M NaCl) (1 M NaCl = 0.58 גרם ב10 H מיליליטר 2 0)
    • KCl (6.75 מיליליטר של 1 M KCl) (1 M KCl = 0.75 גרם ב10 H מיליליטר 2 0)
    • גלוקוז (1 מיליליטר של 1 M D-גלוקוז) (1M D-גלוקוז = 1.80 גרם ב10 H מיליליטר 2 0)
    • MgS0 4 (0.05 מיליליטר של 1 M MgSO 4) (1 M MgSO 4 = 1.20 גרם ב10 H מיליליטר 2 0)
    • 20 HEPES מ"מ (1 מיליליטר של 1M HEPES) (1 M HEPES = 2.38 גרם ב10 H מיליליטר 2 0)
    • CaCl 2 (0.05 מיליליטר של 1M CaCl 2) (ז גרם CaCl 2 = 1.47 1 ב10 H מיליליטר 2 0)
      הכן את כל הפתרונות במזוקקים H 2 O (DDH 2 O) הכפול.
  2. להשלים כל פתרון עם 35 מיליליטר של DDH 2 O ולערבב עם בוחש מגנטי עד כהlution מושגת.
  3. התאם את ה-pH של כל פתרון עם 1 N KOH או 1 N HCl להשיג ערכי ה-pH של 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 ו7.5. לאחר מכן, להתאים את עוצמת הקול עם מים deionized נפח סופי של 50 מיליליטר.
  4. מדד 5 מ"ג של nigericin ולהוסיף אותו ל670 μl של EtOH המוחלט להכין 10 מ"מ nigericin פתרון מניות.
    זהירות: nigericin הוא רעיל מאוד ויש לטפל בם בזהירות רבה (כפפות, משקפי מגן ומסכה). מערבבים את הפתרון על ידי היפוך עד nigericin הוא נמס לגמרי.
  5. הוספת 0.05 מיליליטר של 10 מ"מ nigericin (ריכוז סופי 10 מיקרומטר) לכל פתרון כיול. Nigericin הוא ionophore שמגביר את חדירות קרום תא וגורם לאיזון של רמת חומציות תוך תאית וחוץ תאי בנוכחות ריכוז depolarizing של תאי K +.
  6. ניתן לאחסן את פתרונות כיול לחודש 1 על 4 מעלות צלזיוס

2. הכנת תא

  1. תחת safet ביולוגימכסה המנוע y, תאי זרע ב35 מ"מ מנות תרבות x 10 מ"מ 2 מיליליטר של מדיום גידול בתוספת 10% בסרום שור עוברי ואנטיביוטיקה. השתמש בכמות התאים הדרושה כדי להבטיח מפגש 50 כ% לאחר 24 שעות.
    הערה: בניסויים שלנו, אנו משתמשים בקו HT-1080 התא וצלחת 1 x 10 5 תאים לכל צלחת תרבות.
  2. לקבוע את מספר מנות התרבות הדרושה לניסוי וצלחת 5 מנות תרבות נוספות שמשמש לכיול.
  3. מנות תרבות המקום בC / 5% CO 2 באינקובטור 37 מעלות לפחות 24 שעות.

3. הכנת בדיקות pH חישה

  1. הכן פתרון מניות 1M של חללית ה-pH ניאון 8-hydroxypyrene-1, 3,6 חומצת trisulfonic, מלח trisodium (HPTS / pyranine) בDDH 2 0. פתרון זה חייב להיות מאוחסן ב RT ומוגן מפני אור.
  2. הכן פתרון מניות של 1 מ"מ 5 - (ו- 6)-carboxyl seminaphthorhodafluor acetoxymethyl אסטר אצטט (C-snarf-1 בבוקר, נקרא thereaחרי snarf-1) על ידי המסת 1 מ"ג של snarf-1 ב1.76 מיליליטר של DMSO. לערבב ביסודיות על ידי pipetting חוזר ונשנה. פתרון snarf-1 חייב להיות מאוחסן ב-20 מעלות צלזיוס ומוגנת מפני אור.

4. תיוג תא

  1. שישה עשר שעות לפני ההדמיה לחיות תאים, להוסיף 2 μl של פתרון מניות 1M HPTS (ריכוז סופי 1 מ"מ) לכל מנה תרבות המכילה 2 מיליליטר של מדיום שלם.
  2. להחזיר את הכלים התרבות לחממה. הבדיקה HPTS היא תא impermeant, ולכן לתווית האברונים הבדיקה חייבת להיות נלקחת על ידי pinocytosis. מצב זה מחייב את incubations תא עם HPTS מבוצע במדיום תרבות, בתוספת סרום.
  3. לאחר דגירה עם HPTS, לשטוף את התאים פעמיים עם PBS סטרילי ולהוסיף 2 מיליליטר של מדיום סרום ללא לפחות 2 שעות. דגירה עם snarf-1 צריכה להתבצע במדיום סרום ללא בגלל סרום עלול למנוע הספיגה של החללית.
  4. הוסף 10 μl של פתרון מניות snarf-1 1 מ"מ להשיג afריכוז inal של 5 מיקרומטר ולאפשר לתאי דגירה של 20 דקות על 37 מעלות צלזיוס, באור עמום. ריכוז C-snarf-1 וזמן דגירה יכולים להשתנות בהתאם לסוג תא.
  5. בסוף הדגירה, לשטוף תאי פעמים PBS סטרילי ולהוסיף 2 מיליליטר של מדיום ללא סרום.

5. תוספת של מאפנני pH

  1. על מנת להעריך האם השיטה יכולה לזהות שינויי pH בתאים, חומרים כימיים שונים המווסתים pH תאיים ניתן להשתמש:
    • Bafilomycin A1, מעכב ספציפי של V-ATPase 5
    • איזופורם מחליף Na + / H + 1 (NHE-1) 6
    • NH 4 Cl, בסיס חלש, שמגביר את רמת חומציות תוך תאית 7
    1. הכן פתרונות מניות של חומרים כימיים שהוזכרו לעיל:
      • Bafilomycin A1: להוסיף 10 מיקרוגרם של bafilomycin A1 ל160 μl של DMSO להשיג פתרון מניות של 100 מיקרומטר
      • EIPA: להוסיף 25 מ"ג EIPA ל1.67 מיליליטר של מתנול לobtaiריכוז סופי na של 50 מ"מ
      • NH 4 Cl: לפזר 0.53 גרם של אמוניום כלוריד ב10 מיליליטר של DDH 2 O להשיג ריכוז סופי של 1 מ"מ.

      הערה: כל פתרונות המניות חייבים להישמר על 4 מעלות צלזיוס למעט A1 bafilomycin אשר חייב להיות מאוחסן ב-20 מעלות צלזיוס ומוגנות מפני אור.
    2. בתרבות מנות נפרדות, מוסיף אחד מהחומרים הכימיים כמפורט להלן:
      • 2 μl של 100 bafilomycin מיקרומטר A1 (ריכוז סופי 100 ננומטר)
      • 1 μl של 50 מ"מ EIPA (מיקרומטר ריכוז 25 הסופי)
      • 40 μl של 1M 4 Cl NH (ריכוז סופי 20 מ"מ)
    3. דגירה התאים למשך 30 דקות ב37 ° C.
  2. המשך לרכישת תמונה.

6. מפרט של מיקרוסקופ Live-תא ההדמיה והגדרות רכישה

  1. לבצע הדמיה לחיות תאים באמצעות מטרת 40X רכוב על microsco סריקה הפוכה רפאים confocalpe מצויד בשלב XY ממונע, חדר שיכול להכיל מנות תרבות תחתית זכוכית בחממת במה (טמפרטורה, לחות, CO 2) מבוקרת לסביבה.
  2. מכשיר confocal (אולימפוס FV1000) משמש כאן מצויד ב:
    • ננומטר 405 לייזר דיודה
    • לייזר ארגון 40 mW (458 ננומטר, 488 ננומטר, 515 ננומטר)
    • לייזר ניאון הליום (543 ננומטר)
    • מטרת פלואוריט 10X, NA0.4
    • מטרת LUCPLFLN 40X, NA0.60
    • מטרת שמן PLAPONSC תכנית APO 60x, NA1.4
    • DM מראה dichroic 405/458/488/543
    • SDM 560 וSDM 640 מסננים dichroic
    • מסנן מחסום BA655-755
    • BS20/80 מפצל קרן
    • תוכנה לניתוח נתונים לרכישת תמונה וניתוח,
  3. ברגע חממת השלב התחממה ל37 מעלות צלזיוס ומיקרוסקופ מוגדר, מניח צלחת תרבות מודגרות בעבר עם HPTS וsnarf-1 לחדר ההדמיה שלב confocal.
  4. חרי איתור שטח של עניין, התאם את הגדרות רכישת תוכנת איור 1.
    • הגדר את שני סטי ערוץ וירטואליים.
    • ליזום את השלב הראשון שמתאים לעירור HPTS ב405 ננומטר ואוסף פליטה ב 505-525 ננומטר ועירור snarf-1 ב543 ננומטר ואוסף פליטה ב 570-600 ננומטר.
    • ליזום את השלב השני שמתאים לעירור HPTS ב458 ננומטר ואוסף פליטה ב 505-525 ננומטר ועירור snarf-1 ב543 ננומטר ואוסף פליטה ב 640-650 ננומטר.
    • צמצם confocal מוגדר 175 מיקרומטר כברירת מחדל וצמצם אופטימלי צריך להיות מוגדר באופן ידני ב300 מיקרומטר.
    • קח את התמונה על ידי ערמת חלקים סידוריים אופקיים אופטיים (800 800 פיקסלים) של 0.4 מיקרומטר עובי.

הערה: מטרת 40X היא שימושית כדי לבחון כמה תאים בו זמנית ועובדת היטב לצפייה אברון. עם זאת, ברזולוציה מרחבית ועוצמת אות הן בטr המושג באמצעות אובייקטיבי שמן 60x. בנוסף, אין שום עירור או פליטת הצטלבות בין שני הצבעים.

7. כיול של בדיקות pH חישה

  1. לפני הכיול, להסיר בינוני ממנת התרבות מודגרות בעבר עם HPTS וsnarf-1, לשטוף פעמיים עם PBS סטרילי ולאחר מכן להוסיף 2 מיליליטר של אחד מפתרוני הכיול חמש.
  2. מניחים את צלחת התרבות לתוך תא שלב confocal.
  3. המשך לרכישת הזמן לשגות תמונה בהתאם להגדרות הבאות:
    1. הגדר את מספר התמונות ופעמים משך מרווח לניסוי.
      הערה: אנו משתמשים בדרך כלל מרווח 1 דקות בין תמונות עד 30 דקות.
    2. לתכנת את התריס כדי לסגור בין הרכישה של כל תמונה.
  4. רשום את עוצמת הקרינה לדקות בתוכנת גיליון אלקטרוני ולקבוע את הזמן שבו עוצמת הקרינה היא יציבה. ה-pH תאיים היא בדרך כלל יציבה לאחר 15-20 דקות.
  5. REPEAT צעדים 7.1-7.4 באמצעות צלחת תרבות חדשה עבור כל פתרון כיול הנותר.

8. רכישת נתונים

  1. ברגע שהכיול נעשה, לרכוש נתונים לדוגמה 4-5 שדות שנבחרו באקראי המכילים 15-20 תאים לכל תחום. שתי תמונות מתקבלות עבור כל שדה: אחד לתיוג HPTS (שלפוחית) והשני עבור תיוג snarf-1 (cytosol).
  2. הקרינה רקע (אזור תאי) היא הופחתה באופן דיגיטלי מתמונות ניאון של שני הבדיקות. שלפוחית ​​שהכותרת וcytosol מהתמונות המאוחסנות שלהם נבחרו באמצעות מסיכה בינארי. עבור כל בדיקה pH חישה, עוצמות הקרינה נמדדות בקנה מידה מספרי (0-4,095 קנה מידה ברמה אפורה). עוצמה ממוצעת של כל הפיקסלים באברון או ציטופלסמה מחושבת וערכים משמשים לחישוב יחס הקרינה.

9. ניתוח נתונים

  1. חבילות תוכנה שונות זמינות באופן מסחרי לניתוח נתונים. כלומרתוכנת FluoView.
  2. בגיליון אלקטרוני, ערכי שיא ולחשב יחס הקרינה באופן הבא: במקרה של HPTS, R = (F 458 ננומטר / F 405 ננומטר), ובמקרה של snarf-1, R = (ננומטר F 644 ננומטר / F 584 ).
  3. להתוות את הנתונים באמצעות תוכנת גרפים מדעית כגון GraphPad פריזמה. העלילה צריכה לשרטט יחסי הקרינה (ציר ה-Y) כפונקציה של ה-pH (ציר ה-X). התאמת עקומות מושגת באמצעות רגרסיה שאינה ליניארי.
  4. לאסוף עוצמות הקרינה של הדגימות כמתואר בשלב 8.2 ולחשב יחס הקרינה. השתמש עקומות כיול להפוך יחסים לערכי ה-pH.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

למדידה בו זמנית של ה-pH בשני תאית ותאי תאי endosomal / lysosomal, בדיקות ratiometric ניאון pH חישת snarf-1 וHPTS היו בשימוש. Snarf-1 מוגבל לתא cytosolic אילו HPTS מאפשר מדידת pH ratiometric של תא endosomal / lysosomal. תא טעינה עם HPTS ל16 שעות מאפשרת הלוקליזציה סלקטיבית שלה בendosomes / lysosomes 4. דוגמא אופיינית של הקרינה נרשמה מתאי HT-1080 עמוסים בבדיקות pH חישה מוצגת באיור 2 א. ראיות לכך שHPTS תוויות תאי שני endosomal וlysosomal הושגו על ידי שיתוף מכתים עם transferrin Alexa 546 מצומדות (endosomes) או בדיקה ניאון lysotrophic (Lysotracker העמוק Reddye). הנתונים הראו בבירור כי HPTS מוכתם שני תאי איור 2 א.

באמצעות המתודולוגיה שתוארה לעיל, ערכי ה-pH תאיים בתאים חיים נקבעו באמצעותעקומת כיול עבור כל 2B דמויות בדיקה ו2C, המבוססת על מאפייני ratiometric של כל צבע pH רגיש. פתרונות הכיול חמישה שימשו להמיר עוצמות הקרינה ליחידות ה-pH. נתונים משלושה כיולים עצמאיים מדווחים עבור כל 2C איור הבדיקה pH חישה. כל נקודת נתונים מייצגת יחס בין עוצמת הקרינה באורכי גל עירור של 458/405 ננומטר לHPTS או אורכי גל פליטה של ​​644/584 ננומטר לsnarf-1 ב-pH נתון. עקומות הכיול עבור שני הבדיקות הראו קשר לא ליניארי שהיה מצויד הטוב ביותר עם ​​משוואה מעריכית איור 2C. היעילות של השיטה לאיתור שינויי pH הקשורים תא סלולריים הוערכה בתאי HT-1080 חיים באמצעות NH 4 Cl, בסיס חלש, שמגביר את רמת חומציות תוך תאית, bafilomycin A1, מעכב תרופתי של ה-V-ATPases וEIPA, NHE- מעכב 1. NH 4 Cl מופעל intravesicular וציטומגלווירוסעליות pH solic 6.35-7.10 ו7.00-7.40, בהתאמה איורים 3 א ו 3 ב. Bafilomycin A1 מושרה alkalinization של תאי endosomal וlysosomal מבלי לשנות pH cytosolic. לעומת זאת, EIPA מושרה החמצה של cytosol לכת ערך ה-pH של 6.62 לעומת 7.00 ב3A דמויות תאים שלא טופל ו3B.

איור 1
איור 1. תרשימים של הגדרות רכישה לליזר הסריקה מיקרוסקופ confocal. (א) השלב הראשון הוא להגדיר לרגש HPTS ב405 ננומטר וsnarf-1 ב543 ננומטר בו זמנית באמצעות מראה dichroic (DM405/488/543/633). פליטת הקרינה נרשמת ראשונה לHPTS ב505-525 ננומטר באמצעות מראה dichroic (SDM560). פליטת הקרינה של snarf-1 ולאחר מכן פיקוח באמצעות bandpaמסנן ss הפרעות בטווח של 570-600 ננומטר. (ב) השלב השני מוגדר לאסוף פליטת הקרינה של HPTS (exc, 458 ננומטר) וsnarf-1 (exc, 543 ננומטר) בו זמנית. עירור בדיקה שנוצר על ידי קרן הלייזר עובר דרך מפצל אלומה (BS20/80) ופליטת הקרינה עבור כל בדיקה שנאסף באמצעות מראות dichroic משמשות בשלב הראשון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. בכיול באתרו של בדיקות pH חישה. (א) נציג תמונות של HPTS ולוקליזציה משנה הסלולר snarf-1 בHT-1080 תאי fibrosarcoma. תמונות העליונות מראות כי snarf-1 תוויות ציטופלסמה ואילו HPTהקרינה קשורה-S מציגה לוקליזציה intravesicular. תאי HT-1080 הודגרו למשך 30 דקות עם transferrin Alexa 546 מצומדות (5 מיקרוגרם / מיליליטר) או לצבוע lysotrophic (Lysotracker העמוק Reddye) (100 ננומטר), בהתאמה. תמונות תחתונה מראות כי HPTS colocalizes עם transferrin ולצבוע lysotrophic (60x). (ב) נציג תמונות של שני בדיקות pH חישה בתאים טופחו במשך דקות 15 עם פתרונות כיול ב-pH 6.0 וpH 7.5. (ג) מערכת יחסים של עוצמת הקרינה יחסים לHPTS וsnarf-1 נקבעו באמצעות פתרונות הכיול כפונקציה של pH. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. אפנון של i ntpH racellular ידי bafilomycin A1, EIPA וNH 4 Cl. מעכבים תרופתי (bafilomycin A1, EIPA) ומאפנן pH תאיים NH 4 Cl שימשו כדי לאמת את המתודולוגיה. גרפים מראים את ערכי ה-pH שנרשמו בתא endosomal / lysosomal (א) או ציטופלסמה (B) של תאי HT-1080 עמוסים HPTS וsnarf-1 וטופחו במשך 30 דקות בנוכחותו או היעדריו (שליטה) של NH 4 Cl ( 20 מ"מ), EIPA (25 מיקרומטר) או bafilomycin A1 (100 ננומטר). הנתונים מיוצגים כממוצע + SEM (** p 0.005, *** p 0.0001).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

יש צורך במדידת pH כמותי בתחום ההדמיה לחיות תאים של תאים סלולריים שונים כדי למדוד במדויק את שינויי ה-pH בתגובות תא לאתגרים חיצוניים. עם זאת, אחד המכשולים העיקריים שנותר הוא בקלות ובאופן ספציפי כדי למקד את התאים סלולריים. מבחינה זו, מספר מחקרים הדגישו את השימוש בHPTS כאינדיקטור pH תאיים שהוכנס לתאים על ידי electroporation או microinjection 8-10. טכניקות אלה סובלות מחסרונות רציניים, כלומר electroporation גורם לניזקים רבים לתאים, וmicroinjection דורש ציוד מיוחד וכישורים טכניים. של עניין, הינטון et al., דיווחו בעבר כי HPTS יכול להילקח על ידי תאים בתהליך של pinocytosis וכי שילוב של snarf-1 וHPTS יכול לשמש כדי לפקח על ה-pH של cytosol וendosomal תאי lysosomal / 3 . יש לנו להשתמש במאפיין זה כדי להקליט וריאציות pH בcompartm lysosomal / endosomalאף אוזן גרון של תאי HT-1080 חיים. ראיות לכך שHPTS היה ממוקם בתא הזה, ולכן יכול לשמש כמדד לרמת חומציות אמין הושגו על ידי שיתוף מכתים עם transferrin fluorophore מצומדות, סמן של תא lysosomal / endosomal, או עם צבע אסידופילוס שבעיקר תוויות lysosomes איור 2. בנוסף, השימוש במאפנני pH תאיים שונים מיקוד תאים סלולריים שונים הצביע על כך שbafilomycin A1 מוגבר pH intravesicular במיוחד מבלי לשנות pH cytoplasmic. לעומת זאת, EIPA שינה בעיקר pH cytosolic אבל הייתה השפעה קטנה או לא על endosomal וpH lysosomal בעוד אמוניום כלוריד מושפע pH של שני התאים. תוצאות אלו סיפקו ראיות לכך snarf-1 וHPTS יכולים לשמש כדי לפקח בו זמנית שינויי pH בשני תאים סלולריים שונים.

מאפיין חשוב של השיטה המתוארת כאן הוא השימוש במיקרוסקופ לייזר confocal סריקה. הריפו המחקרים ביותרrted בספרות העוסק במדידות pH תאיים נעשה על ידי spectrofluorometry. אמנם קל לשימוש ומתן רכישת נתונים מהיר, גישה זו אינה מאפשרת תצפית של תאים במהלך הניסוי. חסרון זה יכול להיות בעל משמעות שכן הוא כבר הניסיון שלנו כי במהלך שלב הכיול, דגירה ממושכת תחת חומצי (pH 5.5) או בסיסי (pH 8.0) תנאים עלולה להשפיע לרעה על סוגי תאים שונים ולעורר אפופטוזיס. במקרה של תאי HT-1080, מוביל לאפופטוזיס autofluorescence האדום, ובכך מפריע לקרינת pH תלוי של snarf-1 (מידע לא מוצג). כדי לעקוף בעיה זו, יש לנו להשתמש בצלחת נפרדת תרבות עבור כל כיול וניסויים שהושלכו בו סימנים של אפופטוזיס או שינויי תא אחרים נצפו. השימוש במיקרוסקופ confocal למדידות pH גם עושה את הניתוח של נתונים קלים יותר. לדוגמא, ניתוח של תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal יכול לשמש כדי להשליך חפצים, apoptotiג תאים ורעשי רקע, מה שהופך את חישובים קלים יותר ומדויקים יותר.

למרות שהשיטה המתוארת כאן מציעה יתרונות רבים על פני גישות אחרות, יש לו כמה מגבלות. אחד מהם קשור לתנאי העמסה השונים הנדרשים לכל בדיקה. עם כל הכבוד לHPTS, הצבע צריך להיות נלקח על ידי pinocytosis. הגבלה זו דורשת כי תאים חייבים להישמר לתקופה ארוכה של זמן (HR למשל 12) בבינוני בתוספת סרום לקדם pinocytosis ובכך תיוג של תא endocytic. לעומת זאת, תא permeant snarf-1 צריך להיות הודגרו במדיום סרום ללא כדי למנוע את האפשרות של acetoxymethyl אסתר הידרוליזה (AM) על ידי esterases שאינו ספציפי המכיל סרום. הגבלות אלה לא תכלולנה פרוטוקולי ניסוי שדורשים תנאי תרבית תאי העמסה שאינה תואמת. בנוסף, הרגישות של HPTS עד בינוני חומצי היא מגבלה חשובה. כפי שניתן לראות באיור 2, fעוצמות luorescence של HPTS נרגש ב458 ננומטר להראות וריאציה מינימאלית ב-pH 6.0 או נמוכים יותר, עם יחס קרוב לערכי רקע. נכס מהותי זה של HPTS צריך להילקח בחשבון במקרה של מחקרים של תאים סלולריים מאוד חומציים כגון lysosomes שיש ערכי ה-pH נמוכים כמו 4.0-5.0. עם זאת, למיטב ידיעתנו, HPTS הוא לצבוע ratiometric זמינה רק שניתן להשתמש בם כדי למדוד את ה-pH intraendosomal. לדוגמא, יהיה צבע lysosensor הנפוץ בעיקר מחיצה בתוך תא lysosomal יותר חומצי. בתוך תא endosomal היקף המחיצה של צבע זה יהיה תלוי בערכי ה-pH בתוך שלפוחית ​​אלה, אשר הוא חסרון עיקרי בעת מדידת pH intravesicular בתאים שבם הומאוסטזיס pH endosomal משתנה.

לסיכום, אנו מתארים בזאת גישה למדוד בו זמנית ערכי pH cytosolic וendosomal בתאים בודדים. זה חשוב במיוחד ללימוד הומאוסטזיס pH בתאי wherמוטציות דואר או תרופות יכולות להשפיע על זרימה וזרם של פרוטונים בendosomes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Solutions for calibration
Sodium chloride Fischer L-11621
Potassium chloride Fischer M-12445
D-Glucose (dextrose) Fischer D16-1
Magnesium sulfate Fischer M65-500
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Calcium chloride dihydrate Fischer M-1612
Deionized water N/A N/A
Nigericin Calbiochem 481990 Toxic by inhalation or in contact with skin
Keep protected from the light at 4 °C
Culture dishes ∅ 35mm BD Biosciences 354456
pH-sensing probes
8-Hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid (HPTS) Life technologies H-348 Keep away from the light at room temperature
5-(and-6)-Carboxy SNARF®-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate Life technologies C-1271 Keep away from the light and humidity at -20 °C
Dimethyl Sufoxide (DMSO) Fischer BP231-1  Harmful
Phosphate buffered saline (PBS) 100X
Potassium chloride Fischer M-12445 20 g
Sodium phosphate monobasic Fischer S369-1 115 g
Potassium phosphate monobasic J.T Baker 3246-01 20 g
Deionized water N/A N/A Bring to 1 L
Autoclave and adjust pH to 7.4
Phosphate buffered saline (PBS) 1X
PBS 100X N/A N/A 50 ml
Sodium chloride Fischer L-11621 40.5 g
Deoinized water N/A N/A Bring to 5 L
pH modulators
Bafilomycin A1 Sigma-Aldrich B-1793
5-(N-Ethyl-N-isopropyl)amiloride (EIPA) Sigma-Aldrich A3085
Ammonium chloride Fischer A649-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Demaurex, N. pH Homeostasis of cellular organelles. News Physiol Sci. 17, 1-5 (2002).
  2. Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression. Nat Rev Cancer. 11, 671-677 (2011).
  3. Hinton, A., et al. Function of a subunit isoforms of the V-ATPase in pH homeostasis and in vitro invasion of MDA-MB231 human breast cancer cells. J Biol Chem. 284, 16400-16408 (2009).
  4. Overly, C. C., Lee, K. D., Berthiaume, E., Hollenbeck, P. J. Quantitative measurement of intraorganelle pH in the endosomal-lysosomal pathway in neurons by using ratiometric imaging with pyranine. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 3156-3160 (1995).
  5. Drose, S., Altendorf, K. Bafilomycins and concanamycins as inhibitors of V-ATPases and P-ATPases. J Exp Biol. 200, 1-8 (1997).
  6. Pedersen, S. F., King, S. A., Nygaard, E. B., Rigor, R. R., Cala, P. M. NHE1 inhibition by amiloride- and benzoylguanidine-type compounds. Inhibitor binding loci deduced from chimeras of NHE1 homologues with endogenous differences in inhibitor sensitivity. J Biol Chem. 282, 19716-19727 (2007).
  7. Alfonso, A., Cabado, A. G., Vieytes, M. R., Botana, L. M. Calcium-pH crosstalks in rat mast cells: cytosolic alkalinization, but not intracellular calcium release, is a sufficient signal for degranulation. Br J Pharmacol. 130, 1809-1816 (2000).
  8. Han, J., Burgess, K. Fluorescent indicators for intracellular pH. Chem Rev. 110, 2709-2728 (2010).
  9. Giuliano, K. A., Gillies, R. J. Determination of intracellular pH of BALB/c-3T3 cells using the fluorescence of pyranine. Anal Biochem. 167, 362-371 (1987).
  10. Willoughby, D., Thomas, R., Schwiening, C. The effects of intracellular pH changes on resting cytosolic calcium in voltage-clamped snail neurones. J Physiol. 530, 405-416 (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics