Gelijktijdige meting van de pH in Endocytische en Cytosolic compartimenten in levende cellen met behulp van confocale microscopie

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lucien, F., Harper, K., Pelletier, P. P., Volkov, L., Dubois, C. M. Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (86), e51395, doi:10.3791/51395 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. Bereiding van oplossingen voor Cellulaire pH kalibratie

  1. De volgende verbindingen vijf afzonderlijke 50 ml conische buizen 5 oplossingen worden gebruikt voor kalibratie bereiden:
    • NaCl (1 ml 1 M NaCl) (1 M NaCl = 0,58 g in 10 ml H2 0)
    • KCl (6,75 ml van 1 M KCl) (1 M KCl = 0,75 g in 10 ml H2 0)
    • Glucose (1 ml 1 M D-glucose) (1 M D-glucose = 1,80 g in 10 ml H2 0)
    • MgS0 4 (0,05 ml 1 M MgSO4) (1 M MgSO4 = 1,20 g in 10 ml H2 0)
    • 20 mM HEPES (1 ml 1 M HEPES) (1 M HEPES = 2,38 g in 10 ml H2 0)
    • CaCl2 (0,05 ml 1 M CaCl2) (1 M CaCl2 = 1,47 g in 10 ml H2 0)
      Bereid alle oplossingen met tweemaal gedestilleerd H 2 O (DDH 2 O).
  2. Voltooi elke oplossing met 35 ml van DDH 2 O en meng met een magneetroerder tot zolutie wordt bereikt.
  3. Stel de pH van elke oplossing met 1 N KOH of 1 N HCl tot pH-waarden van 5,5, 6,0, 6,5, 7,0 en 7,5 te verkrijgen. Pas vervolgens het volume met gedeïoniseerd water tot een eindvolume van 50 ml.
  4. Maatregel 5 mg nigericine toevoegen aan 670 ul van absolute EtOH een 10 mM bereiden nigericine stamoplossing.
    Let op: nigericine is zeer giftig en moet met grote zorg (handschoenen, een veiligheidsbril en masker) worden behandeld. Meng de oplossing door omkeren totdat de nigericine volledig is opgelost.
  5. Voeg 0,05 ml 10 mM nigericine (eindconcentratie 10 uM) aan elk van de ijkoplossingen. Nigericine een ionofoor die celmembraan permeabiliteit verhoogt en veroorzaakt equilibratie van intracellulaire en extracellulaire pH in de aanwezigheid van een depolariserende concentratie extracellulair K +.
  6. Kalibratieoplossingen kan worden opgeslagen tot 1 maand bij 4 ° C

2. Celpreparaat

  1. Onder een biologische Safety kap zaad cellen in 35 mm x 10 mm kweekschalen in 2 ml kweekmedium gesupplementeerd met 10% foetaal runderserum en antibiotica. Gebruik de hoeveelheid cellen die nodig is om ongeveer 50% confluentie waarborgen na 24 uur.
    OPMERKING: In onze experimenten gebruiken we de HT-1080-cellijn en plaat 1 x 10 5 cellen per cultuur schotel.
  2. Bepaal het aantal kweekschalen nodig voor het experiment en plaat 5 extra kweekplaten worden gebruikt voor kalibratie.
  3. Plaats kweekschalen in een 37 ° C / 5% CO2 incubator gedurende ten minste 24 uur.

3. Bereiding van pH-gevoelige probes

  1. Bereid een 1M voorraad oplossing van het fluorescerende pH sonde 8-hydroxypyreen-1, 3,6 trisulfonzuur, trinatriumzout (HPTS / pyranine) in DDH 2 0. Deze oplossing moet worden bewaard bij kamertemperatuur en beschermd tegen licht.
  2. Bereid een voorraadoplossing van 1 mM 5 - (en-6)-carboxyl seminaphthorhodafluor acetoxymethylester acetaat (C-SNARF-01:00; genoemd thereafter SNARF-1) door het oplossen van 1 mg SNARF-1 in 1,76 ml DMSO. Meng grondig door herhaald pipetteren. SNARF-1 oplossing moet worden bewaard bij -20 ° C en beschermd tegen licht.

4. Cell Labeling

  1. Zestien uur voor levende cellen beeldvorming, voeg 2 pl 1 M HPTS stamoplossing (eindconcentratie 1 mM) aan elke kweekschaal met 2 ml compleet medium.
  2. De terugkeer van de cultuur schalen in de broedstoof. De HPTS sonde cel-impermeant, dus label organellen de sonde moet door pinocytose worden genomen. Deze voorwaarde vereist dat de mobiele incubaties met HPTS worden uitgevoerd in-serum aangevuld kweekmedium.
  3. Na incubatie met HPTS Was de cellen tweemaal met steriele PBS en voeg 2 ml serumvrij medium gedurende minstens 2 uur. Incubatie met SNARF-1 heeft in serumvrij medium worden uitgevoerd omdat serum de opname van de probe kan voorkomen.
  4. Voeg 10 ul van een 1 mM SNARF-1 stock oplossing af te verkrijgenspronkelijke concentratie van 5 uM en laat cellen geïncubeerd gedurende 20 min bij 37 ° C, bij schemering. C-SNARF-1 concentratie en incubatietijd kan variëren afhankelijk van celtype.
  5. Aan het einde van de incubatie, wassen cellen tweemaal in steriel PBS en voeg 2 ml serumvrij medium.

Toevoeging van pH modulatoren 5.

  1. Om te beoordelen of de methode pH veranderingen kan detecteren in cellen kunnen verschillende reagentia die intracellulaire pH moduleren worden gebruikt:
    • Bafilomycine A1, een specifieke remmer van V-ATPase 5
    • Na + / H + exchanger isovorm 1 (NHE-1) 6
    • NH4Cl, een zwakke base die intracellulaire pH 7 verhoogt
    1. Bereid voorraadoplossingen van de bovengenoemde reagentia:
      • Bafilomycine A1: voeg 10 ug bafilomycine A1 tot 160 pl van DMSO om een ​​voorraad oplossing van 100 urn
      • EIPA: voeg 25 mg van het EIB naar 1,67 ml methanol aan obtaina eindconcentratie van 50 mM
      • NH4Cl: Los 0,53 g ammoniumchloride in 10 ml DDH 2 O tot een eindconcentratie van 1 mM te verkrijgen.

      Opmerking: Alle stockoplossingen moeten bij 4 ° C bewaard behalve bafilomycine A1 die moeten worden opgeslagen bij -20 ° C en beschermd tegen licht.
    2. In afzonderlijke kweekschalen, voeg een van de reagentia zoals hieronder beschreven:
      • 2 ui 100 uM bafilomycine A1 (eindconcentratie 100 nM)
      • 1 ui 50 mM EIB (eindconcentratie 25 uM)
      • 40 gl 1 M NH4CI (eindconcentratie 20 mM)
    3. Incubeer de cellen gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
  2. Ga verder met beeldopname.

6. Specificaties van de live-cell imaging microscoop en Acquisitie Instellingen

  1. Live-cell imaging met behulp van een 40x objectief gemonteerd op een spectrale omgekeerde scanning confocale microscope uitgerust met een gemotoriseerde XY podium, een kamer die glazen bodem cultuur gerechten biedt in een gecontroleerde omgeving (temperatuur, luchtvochtigheid, CO 2) stage incubator.
  2. De confocale instrument (Olympus FV1000) die hier gebruikt is uitgerust met:
    • Een diodelaser 405 nm
    • Een 40 mW argon laser (458 nm, 488 nm, 515 nm)
    • Een helium neon laser (543 nm)
    • Fluoriet 10x objectief, NA0.4
    • Een LUCPLFLN 40X objectief, NA0.60
    • Een PLAPONSC PLAN APO 60x olie doelstelling, NA1.4
    • Een dichroïsche spiegel DM 405/458/488/543
    • Een SDM 560 en een SDM 640 koudlichtfilters
    • Een BA655-755 barrièrefilter
    • Een beam splitter BS20/80
    • Data analyse software voor het verwerven en analyseren,
  3. Zodra het podium couveuse opgewarmd is tot 37 ° C en de microscoop is ingesteld, plaats een cultuur schotel eerder geïncubeerd met HPTS en SNARF-1 in de confocale fase beeldvorming kamer.
  4. Eenfter lokaliseren van een gebied van belang, past u de aanschaf van software instellingen Figuur 1.
    • Instellen van twee virtueel kanaal sets.
    • Inleiding van de eerste fase die overeenkomt met HPTS excitatie bij 405 nm en emissie collectie bij 505-525 nm en SNARF-1 excitatie bij 543 nm en emissie collectie van 570-600 nm.
    • Inleiding van de tweede fase die overeenkomt met HPTS excitatie bij 458 nm en emissie collectie bij 505-525 nm en SNARF-1 excitatie bij 543 nm en emissie collectie van 640-650 nm.
    • De confocale diafragma wordt ingesteld op 175 urn standaard en optimale diafragma moet handmatig worden ingesteld op 300 pm.
    • Neem Afbeelding door het stapelen van seriële horizontale optische secties (800 x 800 pixels) van 0,4 micrometer dik.

OPMERKING: Een 40X doelstelling is handig om meerdere cellen tegelijk te observeren en werkt goed voor organel bekijken. Echter, ruimtelijke resolutie en de intensiteit van het signaal zijn better bereikt door een 60X objectief olie. Bovendien is er geen excitatie of emissie overspraak tussen de twee kleurstoffen.

7. Kalibratie van pH-sensing Probes

  1. Alvorens te kalibreren, verwijder medium van de cultuur schotel eerder geïncubeerd met HPTS en SNARF-1, twee keer wassen met steriele PBS en voeg vervolgens 2 ml van een van de vijf ijkoplossingen.
  2. Plaats de cultuur schotel in de confocale fasekamer.
  3. Ga verder met time-lapse beeldacquisitie volgens de volgende instellingen:
    1. Stel het aantal beelden en intervalduur tijden voor het experiment.
      OPMERKING: We gebruiken meestal een 1 min interval tussen opnamen maximaal 30 minuten.
    2. Programmeer de sluiter te sluiten tussen de verwerving van elk beeld.
  4. Noteer de fluorescentie-intensiteit per min in een spreadsheet software en bepaalt het tijdstip waarop fluorescentie-intensiteit is stabiel. Intracellulaire pH meestal stabiel na 15 - 20 minuten.
  5. Repeat stappen 7,1-7,4 met behulp van een nieuwe cultuur schotel voor elke resterende kalibratie-oplossing.

8. Data Acquisition

  1. Na kalibratie is uitgevoerd verkrijgen voorbeeldgegevens 4-5 willekeurige velden met 15-20 cellen per veld. Twee beelden worden verkregen voor elk veld: een voor HPTS etikettering (blaasjes) en de tweede voor SNARF-1 etikettering (cytosol).
  2. Achtergrond fluorescentie (extracellulair gebied) wordt digitaal afgetrokken van fluorescerende beelden van beide sondes. Gelabelde blaasjes en cytosol van hun opgeslagen beelden worden geselecteerd met een binair masker. Voor elke pH-sonde, worden fluorescentie-intensiteiten gemeten op een numerieke schaal (0-4,095 grijswaarde schaal). Een gemiddelde intensiteit voor pixels in het organel of cytoplasma wordt berekend en de waarden worden gebruikt om fluorescentie ratio te berekenen.

9. Data Analysis

  1. Verschillende software pakketten zijn commercieel beschikbaar voor data-analyse. DwzFluoView Software.
  2. In een spreadsheet plaat waarden en berekent fluorescentie verhoudingen als volgt: Bij HPTS, R = (V 458 nm / 405 nm F) en, bij SNARF-1, R = (V 644 nm / 584 nm F ).
  3. Plot de gegevens met behulp van wetenschappelijke grafische software zoals GraphPad Prism. De curve moet fluorescentie ratio's (Y-as) te beelden als functie van de pH (X-as). Curve fitting wordt bereikt met behulp van niet-lineaire regressie.
  4. Verzamel fluorescentie-intensiteiten van de monsters zoals beschreven in stap 8.2 en bereken fluorescentie ratio. Gebruik kalibratiecurven verhoudingen transformeren tot pH-waarden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Voor de gelijktijdige meting van pH in zowel intracellulaire en endosomale / lysosomale compartimenten cel, werden de ratiometrische fluorescentie pH-sensing probes Snarf-1 en HPTS gebruikt. SNARF-1 is beperkt tot de cytosolische compartiment terwijl HPTS laat ratiometric pH-meting van de endosomale / lysosomale compartiment. Cel laden met HPTS 16 uur laat zijn selectieve lokalisatie in endosomes / lysosomen 4. Een typisch voorbeeld van fluorescentie opgenomen van HT-1080 cellen opgeladen met de pH-gevoelige probes wordt getoond in Figuur 2A. Het bewijs dat HPTS etiketten zowel endosomale en lysosomale compartimenten werd verkregen door co-kleuring met Alexa 546-geconjugeerde transferrine (endosomes) of een fluorescente probe lysotrophic (Lysotracker Deep Reddye). Gegevens bleek duidelijk dat HPTS gekleurd beide compartimenten figuur 2A.

Met de hierboven beschreven methode, werden intracellulaire pH in levende cellen bepaald onder gebruikmakingeen kalibratiecurve voor elke probe figuren 2B en 2C, gebaseerd op ratiometrische eigenschappen van elke pH-gevoelige kleurstof. De vijf ijkoplossingen werden gebruikt om fluorescentie-intensiteiten zetten in pH-eenheden. Gegevens van drie onafhankelijke kalibraties worden gerapporteerd voor elke pH-sonde figuur 2C. Elk gegevenspunt vertegenwoordigt een verhouding van fluorescentie-intensiteit bij golflengten van 458/405 nm voor HPTS of emissie golflengten van 644/584 nm voor SNARF-1 bij een bepaalde pH. De kalibratiekrommen beide probes vertoonde een niet-lineaire relatie die het best uitgerust met een exponentiële vergelijking figuur 2C. De efficiëntie van de werkwijze voor het detecteren cellulaire compartimenten geassocieerde pH veranderingen geëvalueerd in levende HT-1080 cellen met NH4 Cl, een zwakke base die intracellulaire pH toeneemt, bafilomycine A1, een farmacologische remmer van V-ATPases, het EIB, een NHE- 1 remmer. NH 4 Cl getriggerd intravesicular en cytosolic pH stijgt 6,35-7,10 en 7,00-7,40 respectievelijk figuren 3A en 3B. Bafilomycine A1 geïnduceerde basisch de endosomale en lysosomale compartimenten zonder dat cytosole pH. In tegenstelling, EIB geïnduceerde verzuring van het cytosol tot een pH van 6,62 in vergelijking met 7,00 in onbehandelde cellen Figuren 3A en 3B.

Figuur 1
Figuur 1. Schema's van de overname instellingen voor de confocale laser scanning microscoop. (A) De eerste fase is ingesteld op HPTS wekken bij 405 nm en SNARF-1 bij 543 nm gelijktijdig door een dichroic (DM405/488/543/633) spiegel. Fluorescentie-emissie wordt eerst geregistreerd voor HPTS bij 505-525 nm met behulp van een dichroïsche spiegel (SDM560). Fluorescentie-emissie van SNARF-1 wordt vervolgens gecontroleerd door een bandpass interferentie filter in het bereik van 570-600 nm. (B) De tweede fase is ingesteld om gelijktijdig verzamelen fluorescentie-emissie van HPTS (exc, 458 nm) en SNARF-1 (exc, 543 nm). Probe excitatie gegenereerd door de laserstraal gaat door een beam splitter (BS20/80) en fluorescentie-emissie voor elke probe wordt verzameld via de dichroïsche spiegels gebruikt in de eerste fase. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. In situ kalibratie van pH-gevoelige probes. (A) Vertegenwoordiger beelden van HPTS en SNARF-1 sub-cellulaire lokalisatie in HT-1080 fibrosarcomacellen. Boven-beelden tonen dat SNARF-1 labelt de cytoplasma terwijl HPTS-geassocieerde fluorescentie toont intravesicular lokalisatie. HT-1080 cellen werden gedurende 30 minuten met Alexa 546-geconjugeerde transferrine (5 ug / ml) of lysotrophic kleurstof (Lysotracker Deep Reddye) (100 nM), respectievelijk. Lagere beelden tonen dat HPTS colocalizes met transferrine en lysotrophic kleurstof (60X). (B) Representatieve beelden van beide pH-gevoelige probes in cellen geïncubeerd gedurende 15 minuten met ijkoplossingen bij pH 6,0 en pH 7,5. (C) Verbindingen van de fluorescentie-intensiteit ratio's voor HPTS en SNARF-1 bepaald met behulp van de ijkoplossingen als functie van de pH. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3. Modulatie van intracellular pH van bafilomycine A1, EIB en NH4CI. Farmacologische remmers (bafilomycine A1, EIB) en de intracellulaire pH modulator NH4Cl werden gebruikt om te valideren. Grafieken pH-waarden die in het endosomale / lysosomale compartiment (A) of het cytoplasma (B) van HT-1080 cellen opgeladen met HPTS en SNARF-1 en gedurende 30 minuten in aanwezigheid of afwezigheid (controle) van NH4 Cl ( 20 mM), EIB (25 uM) of bafilomycine A1 (100 nM). Gegevens worden weergegeven als het gemiddelde + SEM (** p 0,005, *** p 0,0001).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kwantitatieve meting van de pH in levende cellen beeldvorming van verschillende cellulaire compartimenten nodig pH variaties in celreacties op externe uitdagingen te meten. Een van de belangrijkste hindernissen die overblijft is gemakkelijk en specifiek richten cellulaire compartimenten. In dit verband hebben enkele studies gewezen op het gebruik van HPTS als intracellulaire pH indicator geïntroduceerd in cellen door elektroporatie of microinjectie 8-10. Deze technieken lijden aan ernstige nadelen, namelijk elektroporatie veroorzaakt uitgebreide schade aan cellen en micro-injectie vereist speciale apparatuur en technische vaardigheden. Van belang Hinton et al.. Hebben eerder gemeld dat HPTS door cellen kunnen worden gemaakt door een proces van pinocytosis en dat de combinatie van SNARF-1 en HPTS kunnen worden gebruikt om de pH van het cytosol en endosomale / lysosomale compartimenten 3 bewaken . We hebben deze eigenschap gebruikt om schommelingen in de pH in het lysosomale / endosomale compartm opnemenent van live-HT-1080 cellen. Bewijs dat HPTS was in dit compartiment en dus kan een betrouwbare pH-indicator dienen werd verkregen door co-kleuring met fluorofoor geconjugeerd transferrine, een marker van het lysosomale / endosomale compartiment of een acidofiele kleurstof die meestal etiketten lysosomen figuur 2. Bovendien is het gebruik van verschillende intracellulaire pH modulatoren targeting verschillende cellulaire compartimenten aangegeven bafilomycine A1 intravesicular pH specifiek verhoogd zonder dat cytoplasmatische pH. In tegenstelling, EIB hoofdzakelijk gewijzigd cytosolische pH maar had weinig of geen effect op endosomale en lysosomale pH tijdens ammoniumchloride beïnvloed pH van beide compartimenten. Deze resultaten heeft aangetoond dat SNARF-1 en HPTS kunnen worden gebruikt om pH-veranderingen in deze twee verschillende cellulaire compartimenten kan waarnemen.

Een belangrijk kenmerk van de hier beschreven werkwijze is het gebruik van confocale laser scanning microscopie. De meeste studies reported in de literatuur over intracellulaire pH metingen zijn gedaan door spectrofluorometrie. Hoewel eenvoudig te gebruiken en het leveren van snelle data-acquisitie, is deze benadering niet observatie van de cellen mogelijk te maken tijdens het experiment. Dit nadeel kan van betekenis geworden, omdat het is onze ervaring dat tijdens de kalibratie stap uitgebreid incubatie onder zure (pH 5,5) of alkalisch (pH 8,0) omstandigheden kunnen een negatieve invloed hebben op verschillende celtypes en activeren apoptose. In het geval van HT-1080 cellen, apoptose leidt tot rode autofluorescentie, waardoor interferentie met de pH-afhankelijke fluorescentie van SNARF-1 (gegevens niet getoond). Om dit probleem te omzeilen, hebben wij een aparte kweekschaal voor elke kalibratie en weggegooid experimenten waarbij tekenen van apoptose of andere cel veranderingen waargenomen gebruikt. Het gebruik van de confocale microscoop voor pH-metingen maakt analyse van de gegevens vergemakkelijken. Zo kan analyse van confocale fluorescentiemicroscopie beelden worden gebruikt om artefacten te verwijderen, apoptotic cellen en achtergrondgeluiden, waardoor berekeningen gemakkelijker en nauwkeuriger.

Hoewel de hier beschreven werkwijze biedt vele voordelen boven andere benaderingen heeft wat beperkingen. Een van deze is gerelateerd aan de beladingstoestand voor elke probe. Wat HPTS, de kleurstof door pinocytose worden genomen. Deze beperking vereist dat cellen worden gedurende een langere periode (bijvoorbeeld 12 uur) in een serum aangevuld medium tot pinocytosis en daardoor etikettering van de endocytische compartiment bevorderen. Daarentegen cel-doordringende SNARF-1 heeft in een serumvrij medium geïncubeerd worden om de mogelijkheid van acetoxymethylester (AM) hydrolyse door serumbevattende niet-specifieke esterasen voorkomen. Deze beperkingen zullen uitsluiten experimentele protocollen die laad-onverenigbaar celcultuur omstandigheden dit vereisen. Bovendien is de gevoeligheid van HPTS zure medium een ​​belangrijke beperking. Zoals getoond in figuur 2, fluorescence intensiteiten van HPTS geëxciteerd bij 458 nM tonen minimale variatie bij een pH van 6,0 of lager, met een ratio dicht bij achtergrondwaarden. Deze intrinsieke eigenschap van HPTS moeten bij studies van zeer zure cellulaire compartimenten zoals lysosomen die pH-waarden zo laag als 4,0-5,0 rekening moet worden gehouden. Echter, voor zover wij weten, HPTS de enige beschikbare ratiometrische kleurstof die kan worden gebruikt om intraendosomal pH meten. Bijvoorbeeld, de gebruikte lysosensor kleurstof meestal partitie in de meer zure lysosomale compartiment. De mate van verdeling van de kleurstof in het endosomale compartiment zal afhangen pH in deze blaasjes, hetgeen een groot nadeel bij het meten intravesicular pH in cellen waarin endosomale pH homeostase wordt veranderd.

Tot slot, we hierin beschrijven een aanpak om in enkele cellen gelijktijdig meten cytosole en endosomal pH-waarden. Dit is vooral belangrijk voor de studie van pH homeostase in cellen Where mutaties of drugs kunnen beïnvloeden uitstroom en instroom van protonen in endosomes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Solutions for calibration
Sodium chloride Fischer L-11621
Potassium chloride Fischer M-12445
D-Glucose (dextrose) Fischer D16-1
Magnesium sulfate Fischer M65-500
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Calcium chloride dihydrate Fischer M-1612
Deionized water N/A N/A
Nigericin Calbiochem 481990 Toxic by inhalation or in contact with skin
Keep protected from the light at 4 °C
Culture dishes ∅ 35mm BD Biosciences 354456
pH-sensing probes
8-Hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid (HPTS) Life technologies H-348 Keep away from the light at room temperature
5-(and-6)-Carboxy SNARF®-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate Life technologies C-1271 Keep away from the light and humidity at -20 °C
Dimethyl Sufoxide (DMSO) Fischer BP231-1  Harmful
Phosphate buffered saline (PBS) 100X
Potassium chloride Fischer M-12445 20 g
Sodium phosphate monobasic Fischer S369-1 115 g
Potassium phosphate monobasic J.T Baker 3246-01 20 g
Deionized water N/A N/A Bring to 1 L
Autoclave and adjust pH to 7.4
Phosphate buffered saline (PBS) 1X
PBS 100X N/A N/A 50 ml
Sodium chloride Fischer L-11621 40.5 g
Deoinized water N/A N/A Bring to 5 L
pH modulators
Bafilomycin A1 Sigma-Aldrich B-1793
5-(N-Ethyl-N-isopropyl)amiloride (EIPA) Sigma-Aldrich A3085
Ammonium chloride Fischer A649-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Demaurex, N. pH Homeostasis of cellular organelles. News Physiol Sci. 17, 1-5 (2002).
  2. Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression. Nat Rev Cancer. 11, 671-677 (2011).
  3. Hinton, A., et al. Function of a subunit isoforms of the V-ATPase in pH homeostasis and in vitro invasion of MDA-MB231 human breast cancer cells. J Biol Chem. 284, 16400-16408 (2009).
  4. Overly, C. C., Lee, K. D., Berthiaume, E., Hollenbeck, P. J. Quantitative measurement of intraorganelle pH in the endosomal-lysosomal pathway in neurons by using ratiometric imaging with pyranine. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 3156-3160 (1995).
  5. Drose, S., Altendorf, K. Bafilomycins and concanamycins as inhibitors of V-ATPases and P-ATPases. J Exp Biol. 200, 1-8 (1997).
  6. Pedersen, S. F., King, S. A., Nygaard, E. B., Rigor, R. R., Cala, P. M. NHE1 inhibition by amiloride- and benzoylguanidine-type compounds. Inhibitor binding loci deduced from chimeras of NHE1 homologues with endogenous differences in inhibitor sensitivity. J Biol Chem. 282, 19716-19727 (2007).
  7. Alfonso, A., Cabado, A. G., Vieytes, M. R., Botana, L. M. Calcium-pH crosstalks in rat mast cells: cytosolic alkalinization, but not intracellular calcium release, is a sufficient signal for degranulation. Br J Pharmacol. 130, 1809-1816 (2000).
  8. Han, J., Burgess, K. Fluorescent indicators for intracellular pH. Chem Rev. 110, 2709-2728 (2010).
  9. Giuliano, K. A., Gillies, R. J. Determination of intracellular pH of BALB/c-3T3 cells using the fluorescence of pyranine. Anal Biochem. 167, 362-371 (1987).
  10. Willoughby, D., Thomas, R., Schwiening, C. The effects of intracellular pH changes on resting cytosolic calcium in voltage-clamped snail neurones. J Physiol. 530, 405-416 (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics