Gleichzeitige pH-Messung in endozytischen und Cytosolic Fächer in lebenden Zellen mittels konfokaler Mikroskopie

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lucien, F., Harper, K., Pelletier, P. P., Volkov, L., Dubois, C. M. Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (86), e51395, doi:10.3791/51395 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. Herstellung von Lösungen für Cellular pH-Kalibrierung

  1. Fügen Sie die folgenden Verbindungen zu fünf separate 50 ml konische Röhrchen bis 5 Lösungen für die Kalibrierung verwendet werden vorbereitet:
    • NaCl (1 ml von 1 M NaCl) (1 M NaCl = 0,58 g in 10 ml H 2 0)
    • KCl (6,75 ml 1 M KCl) (1 M KCl = 0,75 g in 10 ml H 2 0)
    • Glucose (1 ml von 1 M D-Glucose) (1 M D-Glucose = 1,80 g in 10 ml H 2 0)
    • MgS0 4 (0,05 ml von 1 M MgSO 4) (1 M MgSO 4 = 1,20 g in 10 ml H 2 0)
    • 20 mM HEPES (1 ml von 1 M HEPES) (1 M HEPES = 2,38 g in 10 ml H 2 0)
    • CaCl 2 (0,05 ml 1 M CaCl 2) (1 M CaCl 2 = 1,47 g in 10 ml H 2 0)
      Bereiten alle Lösungen in doppelt destilliertem H 2 O (ddH 2 O).
  2. Füllen Sie jede Lösung mit 35 ml ddH2O und mit einem Magnetrührer mischen, bis soLösung erreicht wird.
  3. Der pH-Wert jeder Lösung mit 1 N KOH oder 1 N HCl auf pH-Werte von 5,5, 6,0, 6,5, 7,0 und 7,5 erhalten. Dann wird das Volumen mit destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 50 ml einzustellen.
  4. Maßnahme 5 mg Nigericin und es auf 670 ul absolutem EtOH hinzufügen, um eine 10 mM Stammlösung Nigericin vorzubereiten.
    Achtung: Nigericin ist hochtoxisch und müssen mit großer Sorgfalt (Handschuhe, Schutzbrille und Maske) behandelt werden. Mische die Lösung durch Umdrehen bis die Nigericin vollständig gelöst ist.
  5. In 0,05 ml 10 mM Nigericin (Endkonzentration 10 uM), um die Eichlösungen. Ionophor Nigericin ist, die Permeabilität der Zellmembran erhöht und bewirkt Äquilibrierung von intrazellulären und extrazellulären pH-Wert in Gegenwart eines depolarisierenden Konzentration der extrazellulären K +.
  6. Eichlösungen kann bis zu 1 Monat bei 4 ° C gelagert werden,

2. Zellpräparation

  1. Unter einer biologischen safety Haube, Samenzellen in 35 mm x 10 mm Kulturschalen in 2 ml Wachstumsmedium mit 10% fötalem Rinderserum und Antibiotika ergänzt. Verwenden der Menge von Zellen benötigt wird, um ungefähr 50% Konfluenz nach 24 Stunden zu gewährleisten.
    HINWEIS: In unseren Experimenten verwenden wir die HT-1080-Zelllinie und Platte 1 x 10 5 Zellen pro Kulturschale.
  2. Bestimmen der Anzahl von Kulturschalen für das Experiment und die Platte 5 zusätzliche Kulturschalen für die Kalibrierung verwendet werden, benötigt.
  3. Ort Kulturschalen bei 37 ° C / 5% CO 2-Inkubator für mindestens 24 Stunden.

3. Herstellung von pH-Messsonden

  1. Bereiten Sie eine 1 M Stammlösung des fluoreszierenden pH-Sonde 8-Hydroxypyren-1, 3,6 trisulfonsäure, Trinatriumsalzes (HPTS / Pyranin) in ddH 2 0. Diese Lösung muss bei RT gelagert und vor Licht geschützt werden.
  2. Bereiten Sie eine Stammlösung von 1 mM 5 - (und-6)-Carboxy seminaphthorhodafluor Acetoxymethylester Acetat (C-SNARF-01.00; genannt Thereâach SNARF-1) durch Lösen von 1 mg SNARF-1 in 1,76 ml DMSO. Durch wiederholtes Pipettieren gründlich mischen. SNARF-1-Lösung muss bei -20 ° C gelagert und vor Licht geschützt werden.

4. Zellmarkierung

  1. Sechzehn Stunden vor der Live-Cell-Imaging, fügen 2 ul 1M HPTS Stammlösung (Endkonzentration 1 mM) zu jeder Kulturschale mit 2 ml Vollmedium.
  2. Bringen Sie die Kulturschalen in den Inkubator. Die HPTS Sonde zell impermeante, daher Label Organellen muss die Sonde durch pinocytosis genommen werden. Diese Bedingung erfordert, dass die Zell Inkubationen mit HPTS in serumhaltigem Kulturmedium durchgeführt.
  3. Nach der Inkubation mit HPTS, waschen Sie die Zellen zweimal mit sterilem PBS und 2 ml Serum-freiem Medium für mindestens 2 Stunden. Inkubation mit SNARF-1 benötigt, um in serumfreiem Medium durchgeführt, da Serum kann die Aufnahme der Sonde zu verhindern.
  4. In 10 ul einer 1 mM SNARF-1-Stammlösung zu erhalten afinal Konzentration von 5 uM und lassen Zellen für 20 min bei 37 ° C unter schwachem Licht inkubiert. C-SNARF-1-Konzentration und Inkubationszeit kann je nach Zelltyp variieren.
  5. Am Ende der Inkubation wurden die Zellen zweimal Waschen in sterilem PBS und 2 ml serumfreies Medium.

5. Zugabe von pH-Modulatoren

  1. Um zu beurteilen, ob die Methode können pH-Veränderungen in den Zellen erkennen können verschiedene Reagenzien, die intrazellulären pH-Modulation verwendet werden:
    • Bafilomycin A1, ein spezifischer Inhibitor der V-ATPase-5
    • Na + / H +-Austauscher Isoform 1 (NHE-1) 6
    • NH 4 Cl, eine schwache Base, die intrazelluläre pH 7 erhöht
    1. Stocklösungen der oben genannten Reagenzien:
      • Bafilomycin A1: 160 ul DMSO hinzufügen 10 ug Bafilomycin A1 um eine Stammlösung von 100 uM erhalten
      • EIPA: add 25 mg EIPA auf 1,67 ml Methanol obtaina Endkonzentration von 50 mM
      • NH 4 Cl: Man löst 0,53 g Ammoniumchlorid in 10 ml ddH 2 O auf eine Endkonzentration von 1 mM zu erhalten.

      Hinweis: Alle Stammlösungen sind bei 4 ° C aufbewahrt werden, außer Bafilomycin A1, die bei -20 ° C gelagert und vor Licht geschützt werden müssen.
    2. In getrennten Kulturschalen, fügen Sie eines der Reagenzien, wie unten beschrieben:
      • 2 ul 100 uM Bafilomycin A1 (Endkonzentration 100 nM)
      • 1 ul 50 mM EIPA (Endkonzentration 25 uM)
      • 40 ul 1 M NH 4 Cl-Lösung (Endkonzentration 20 mM)
    3. Die Zellen für 30 min bei 37 ° C.
  2. Fahren Sie mit der Bildaufnahme.

6. Technische Daten des Live-Cell-Imaging-Mikroskop und Akquisition Einstellungen

  1. Führen Sie Live-Cell-Imaging mit ein 40X-Objektiv auf einer spektralen invertierten konfokalen Mikroskopie montiertpe mit einem motorisierten XY-Tisch, eine Kammer, die mit Glasboden Kulturschalen in einer kontrollierten Umweltbedingungen (Temperatur, Luftfeuchtigkeit, CO 2)-Stufe Inkubator bietet Platz ausgestattet.
  2. Das konfokale Instrument (Olympus FV1000) verwendet, hier ist ausgestattet mit:
    • Ein Diodenlaser 405 nm
    • A 40 mW Argon-Laser (458 nm, 488 nm, 515 nm)
    • Ein Helium-Neon-Laser (543 nm)
    • Fluorit-10X-Objektiv, NA0.4
    • Ein LUCPLFLN 40X-Objektiv, NA0.60
    • Ein PLAPONSC PLAN APO 60x Öl-Objektiv, NA1.4
    • Ein dichroitischen Spiegel DM 405/458/488/543
    • Ein SDM 560 und ein SDM 640 dichroitischen Filter
    • Ein BA655-755-Sperrfilter
    • Ein Strahlteiler BS20/80
    • Datenanalyse-Software für die Bildaufnahme und-analyse,
  3. Sobald die Bühne Inkubator hat bis zu 37 ° C erwärmt und das Mikroskop aufgebaut ist, legen Sie eine Kulturschale zuvor mit HPTS und SNARF-1 in der konfokalen Imaging-Bühne Kammer inkubiert.
  4. Aach Ortung einen Bereich von Interesse, stellen die Anschaffungs Einstellungen Software Abbildung 1.
    • Richten Sie zwei virtuelle Kanalsätze.
    • Initiieren Sie die erste Phase, die HPTS Anregung bei 405 nm und Emission bei 505 entspricht Sammlung - 525 nm und SNARF-1-Anregung bei 543 nm und Emissions Kollektion bei 570 bis 600 nm auf.
    • Initiieren Sie die zweite Phase, die HPTS Anregung bei 458 nm und Emission bei 505 entspricht Sammlung - 525 nm und SNARF-1-Anregung bei 543 nm und Emissions Kollektion bei 640 bis 650 nm auf.
    • Das konfokale Blende ist standardmäßig auf 175 um eingestellt und optimale Blende muss auf 300 um manuell eingestellt werden.
    • Nehmen Bild von Stapelserien horizontale optische Schnitte (800 x 800 Pixel) von 0,4 um Dicke.

HINWEIS: Ein 40X-Objektiv ist sinnvoll, mehrere Zellen gleichzeitig zu beobachten und funktioniert gut für Organelle Betrachtung. , Räumliche Auflösung und Signalintensität sind jedoch better erreicht mit einem 60x Öl-Objektiv. Darüber hinaus gibt es keine Anregung oder Emission Übersprechen zwischen den beiden Farbstoffen.

7. Kalibrierung von pH-Messsonden

  1. Vor der Kalibrierung entfernen Medium von der Kulturschale zuvor mit HPTS und SNARF-1 inkubiert, zweimal mit sterilem PBS und dann 2 ml einer der fünf Kalibrierungslösungen.
  2. Legen Sie die Kulturschale in die konfokale Stufenkammer.
  3. Fahren Sie mit Zeitraffer-Bildaufnahme nach den folgenden Einstellungen:
    1. Stellen Sie die Anzahl der Bilder und Intervalldauer Zeiten für das Experiment.
      Hinweis: Wir verwenden in der Regel eine 1 min Intervall zwischen den Bildern für bis zu 30 min.
    2. Programmieren Sie den Auslöser, um zwischen dem Erwerb von jedem Bild zu schließen.
  4. Notieren Sie sich die Fluoreszenzintensität pro min in einem Tabellenkalkulationssoftware und bestimmen Sie die Zeit, in der Fluoreszenzintensität ist stabil. Die intrazelluläre pH-Wert in der Regel nach 15 stabil - 20 min.
  5. REPEAT Schritte 7.1 bis 7.4 mit einer neuen Kulturschale für jede verbleibende Kalibrierungslösung.

8. Datenerfassung

  1. Sobald die Kalibrierung durchgeführt wurde, zu erwerben Beispieldaten 4-5 zufällig ausgewählten Feldern mit 15-20 Zellen pro Feld. Zwei Bilder werden für jedes Feld erhalten: eine für HPTS Kennzeichnung (Vesikel) und die zweite für SNARF-1-Kennzeichnung (Cytosol).
  2. Hintergrundfluoreszenz (extrazellulären Bereich) ist digital von Fluoreszenzbilder der beiden Sonden abgezogen. Beschriftete Vesikel und Cytosol von ihren jeweiligen gespeicherten Bilder werden mit Hilfe eines binären Maske ausgewählt. Für jeden pH-Messfühler sind Fluoreszenzintensitäten auf einer numerischen Skala (0-4,095 Graustufenskala) gemessen. Eine mittlere Intensität aller Pixel in der Organelle oder Zytoplasma wird berechnet und die Werte werden verwendet, um Fluoreszenz-Verhältnisse zu berechnen.

9. Datenanalyse

  1. Verschiedene Software-Pakete sind für die Datenanalyse im Handel erhältlich. DhFluoView Software.
  2. In einer Tabellenkalkulation, Datensatzwerte und berechnen Fluoreszenzverhältnisse wie folgt: Im Fall von HPTS, R = (F 458 nm / F 405 nm) und, im Fall von SNARF-1, R = (F 644 nm / F 584 nm ).
  3. Zeichnen Sie die Daten mit Hilfe wissenschaftlicher Grafik-Software wie GraphPad Prism. Das Grundstück sollte Fluoreszenzverhältnisse (Y-Achse) in Abhängigkeit von pH-Wert (X-Achse) zu porträtieren. Kurvenanpassung unter Verwendung nicht-linearer Regression gelöst.
  4. Sammeln Fluoreszenzintensitäten der Proben, wie in Schritt 8.2 beschrieben und berechnen Fluoreszenzverhältnisse. Verwenden Eichkurven-Verhältnisse in pH-Werte zu transformieren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Für die gleichzeitige Messung von pH-Wert sowohl in der intrazellulären und der endosomalen / lysosomalen Zellkompartimenten wurden die ratiometrische Fluoreszenz-pH-Messfühler SNARF-1 und HPTS verwendet. SNARF-1 ist mit dem Zytosol beschränkt wohin HPTS ermöglicht ratiometrische pH-Messung der endosomalen / lysosomalen Kompartiment. Zellbeladung mit HPTS für 16 Stunden ermöglicht seine selektive Lokalisierung in Endosomen / Lysosomen 4. Ein typisches Beispiel der Fluoreszenz von HT-1080-Zellen mit den pH-Messfühler erfasst wird geladen in Fig. 2A gezeigt. Der Nachweis, dass HPTS Etiketten sowohl endosomalen und lysosomalen Kompartimenten wurde durch Co-Färbung mit Alexa 546-konjugierten Transferrin (Endosomen) oder eine fluoreszierende Sonde lysotrophic (Lysotracker Tief Reddye) erhalten. Die Daten zeigen deutlich, dass beide Fächer HPTS gefärbt 2A.

Unter Verwendung der oben beschriebenen Methodik wurden intrazelluläre pH-Wert in lebenden Zellen unter Verwendung bestimmteine Kalibrierungskurve für jede Sonde Fig. 2B und 2C, bezogen auf die ratiometrische Eigenschaften jeder pH-sensitiven Farbstoff. Die fünf Eichlösungen wurden verwendet, um Fluoreszenz-Intensitäten auf pH-Einheiten umzuwandeln. Daten aus drei unabhängigen Kalibrierungen für jeden pH-Messsonde 2C berichtet. Jeder Datenpunkt repräsentiert ein Verhältnis der Fluoreszenzintensität bei einer Anregungswellenlängen von 458/405 nm für HPTS oder Emissionswellenlängen von 644/584 nm für SNARF-1 bei einem bestimmten pH-Wert. Die Eichkurven für die beiden Proben zeigte eine nichtlineare Beziehung, die am besten mit einer exponentiellen Gleichung 2C ausgestattet war. Die Effizienz des Verfahrens zum Erfassen zellulären pH-assoziierten Veränderungen in lebenden HT-1080-Zellen unter Verwendung von NH 4 Cl, eine schwache Base, die intrazelluläre pH-Wert erhöht, Bafilomycin A1, eine pharmakologische Inhibitor der V-ATPasen und EIPA, einen NHE-bewertet 1-Inhibitor. NH 4 Cl ausgelöst intravesikulären und Zytosolic pH-Wert steigt von 6,35 bis 7,10 und 7,00 bis 7,40 bzw. 3a und 3b. Bafilomycin A1 induzierte Alkalisierung der endosomalen und lysosomalen Kompartimenten ohne Änderung cytosolischen pH-Wert. Im Gegensatz dazu induzierte EIPA Ansäuerung Cytosol Erreichen eines pH-Wert von 6,62 im Vergleich zu 7,00 in unbehandelten Zellen Figuren 3A und 3B.

Figur 1
Fig. 1 ist. Diagramme des Erwerbs Einstellungen für die konfokale Laser-Scanning-Mikroskop. (A) Die erste Phase wird durch einen dichroitischen (DM405/488/543/633) Spiegel eingestellt, HPTS bei 405 nm und SNARF-1 bei 543 nm erregt gleichzeitig. Fluoreszenzemission wird zuerst für HPTS bei 505-525 nm unter Verwendung eines dichroitischen Spiegels (SDM560) aufgezeichnet. Fluoreszenzemission von SNARF-1 wird dann durch eine bandpa überwachtss-Interferenz-Filter im Bereich von 570 bis 600 nm auf. (B) Die zweite Phase wird sich gleichzeitig sammeln Fluoreszenzemission HPTS (EXC, 458 nm) und SNARF-1 (EXC, 543 nm). Probe Anregung durch den Laserstrahl erzeugt läuft durch einen Strahlteiler (BS20/80) und Fluoreszenz-Emission ist für jeden Sonde durch die dichroitischen Spiegel in der ersten Phase verwendet gesammelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. In-situ-Kalibrierung von pH-Messfühler. (A) Repräsentative Bilder der HPTS und SNARF-1 subzellulärer Lokalisation in HT-1080 Fibrosarkomzellen. Ober Bilder zeigen, dass SNARF-1-Etiketten in das Zytoplasma der Erwägung, dass HPTS-assoziierte Fluoreszenz zeigt intravesikulären Lokalisierung. HT-1080 Zellen wurden für 30 min mit Alexa 546-konjugierte Transferrin (5 ug / ml) oder einem lysotrophic Farbstoff (Lysotracker Tief Reddye) (100 nM) jeweils inkubiert. Nieder Bilder zeigen, dass HPTS kolokalisiert mit Transferrin und dem lysotrophic Farbstoff (60X). (B) Repräsentative Bilder der beiden pH-Messfühler in den Zellen für 15 min mit Eichlösungen bei pH 6,0 und pH 7,5 inkubiert. (C) Beziehung der Fluoreszenzintensität Verhältnisse für HPTS und SNARF-1 bestimmt unter Verwendung der Kalibrierungslösungen als Funktion des pH-Wertes. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Fig. 3
Abbildung 3. Modulation von i ntracellular pH von Bafilomycin A1, EIPA und NH 4 Cl. Pharmakologische Inhibitoren (Bafilomycin A1, EIPA) und der intrazelluläre pH-Modulator NH 4 Cl wurden verwendet, um die Methode zu validieren. Diagramme zeigen pH-Werten im endosomalen / lysosomalen Kompartiment (A) oder dem Cytoplasma (B) von HT-1080-Zellen mit HPTS und SNARF-1 geladen und für 30 min in Anwesenheit oder Abwesenheit (Kontrolle) von NH 4 Cl inkubiert (zeichneten 20 mM), EIPA (25 uM) oder Bafilomycin A1 (100 nM). Daten sind als Mittelwert + SEM (** p 0,005, *** p 0,0001) dargestellt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Quantitative pH-Messung in lebenden Zellen von verschiedenen zellulären Kompartimenten wird benötigt, um pH-Schwankungen in Zell-Antworten auf externen Herausforderungen genau zu messen. Allerdings ist eine der größten Hürden, die bleibt, um einfach und gezielt zellulären Kompartimenten. In diesem Zusammenhang haben einige Studien den Einsatz von HPTS als intrazellulärer pH-Indikator durch Elektroporation oder Mikroinjektion in Zellen eingebracht 8-10 hervorgehoben. Diese Techniken leiden unter schwerwiegenden Nachteilen, nämlich die Elektroporation bewirkt umfangreiche Schäden an Zellen und die Mikroinjektion erfordert eine spezielle Ausrüstung und technischen Fähigkeiten. Von Interesse, Hinton et al. Haben zuvor berichtet, dass HPTS kann von Zellen durch einen Prozess der Pinozytose und entnommen werden, dass die Kombination von SNARF-1 und HPTS kann verwendet werden, um den pH der Cytosol und endosomalen / lysosomalen Kompartimenten 3 überwachen . Wir haben diese Eigenschaft verwendet, um pH-Schwankungen in der lysosomalen / endosomalen compartm aufnehmenHNO lebender HT-1080-Zellen. Beweise, dass HPTS wurde in diesem Fach befinden, und daher könnte als zuverlässiger Indikator dienen pH wurde durch Co-Färbung mit Fluorophor-konjugierten Transferrin erhalten wird, ein Marker des lysosomalen / endosomalen Kompartiment, oder mit einem Farbstoff, der meist acidophiler Etiketten Lysosomen Abbildung 2. Darüber hinaus ist die Verwendung von verschiedenen intrazellulären pH-Modulatoren gezielt verschiedene zelluläre Kompartimente angegeben, Bafilomycin A1 intravesikulären pH spezifisch erhöht, ohne dabei cytoplasmatische pH. Im Gegensatz dazu EIPA hauptsächlich cytosolischen pH verändert, aber wenig oder keine Wirkung auf endosomalen und lysosomalen pH während Ammoniumchlorid beeinflußt pH beider Kammern. Diese Ergebnisse lieferten Hinweise darauf, dass SNARF-1 und HPTS könnte verwendet werden, um den pH-Wert dieser beiden verschiedenen zellulären Kompartimenten gleichzeitig zu überwachen.

Ein wichtiges Merkmal des hier beschriebenen Verfahrens ist die Verwendung der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie. Die meisten Studien Repoin der Literatur auf die intrazelluläre pH-Messungen wurden rted spektrofluorometrisch getan. Obwohl einfach zu bedienen und bietet eine schnelle Datenerfassung, dieser Ansatz nicht Beobachtung der Zellen während des Experiments zu ermöglichen. Dieser Nachteil kann von Bedeutung geworden, da ist es unsere Erfahrung, dass während der Kalibrierung Schritt erweitert Inkubation unter sauren (pH 5,5) oder alkalischen (pH 8,0) Bedingungen können sich negativ auf verschiedene Zelltypen und Apoptose auslösen. Im Falle von HT-1080-Zellen, die Apoptose führt zu roten Autofluoreszenz, also mit dem pH-abhängige Fluoreszenz von SNARF-1 (Daten nicht gezeigt) stören. Um dieses Problem zu umgehen, haben wir eine separate Petrischale für die Eich und verworfen Experimenten, bei denen Zeichen der Apoptose oder andere Zellveränderungen wurden beobachtet wird. Die Verwendung des konfokalen Mikroskops für pH-Messungen ist auch die Analyse der Daten zu erleichtern. Zum Beispiel kann die Analyse der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie-Bilder verwendet werden, um Artefakte zu verwerfen, werden apoptotic Zellen und Hintergrundrauschen, so dass Berechnungen einfacher und genauer.

Obwohl das hier beschriebene Verfahren bietet viele Vorteile gegenüber anderen Ansätzen, hat es einige Einschränkungen. Eines davon ist im Zusammenhang mit den für jede Sonde erforderlich unterschiedlichen Beladungszuständen. Bezüglich HPTS, hat der Farbstoff durch Pinozytose ergriffen werden. Diese Einschränkung erfordert, dass Zellen müssen über einen längeren Zeitraum (z. B. 12 h) in einer Serum-ergänztem Medium zu Pinozytose und damit die Kennzeichnung des endocytic Fach Förderung aufrechterhalten werden. Im Gegensatz dazu braucht zelldurchdringenden SNARF-1 in Serum-freiem Medium inkubiert werden, um die Möglichkeit der Acetoxymethylester (AM) Hydrolyse von serumhaltigem unspezifische Esterasen verhindern. Diese Beschränkungen werden experimentelle Protokolle, die Be-und unvereinbar Zellkulturbedingungen erfordern auszuschließen. Darüber hinaus ist die Empfindlichkeit der HPTS zu saurem Medium eine wichtige Einschränkung. Wie in Fig. 2 dargestellt fluorescence Intensitäten HPTS bei 458 nm angeregt zeigen minimale Abweichung bei pH 6,0 oder niedriger, mit Verhältnissen in der Nähe der Hintergrundwerte. Diese intrinsische Eigenschaft HPTS sollte im Falle der Studien von sehr sauren zellulären Kompartimenten wie Lysosomen, die pH-Werte so niedrig wie 4,0 bis 5,0 haben, berücksichtigt werden. Jedoch nach unserer Kenntnis ist die einzige verfügbare HPTS ratiometrisch Farbstoff, der verwendet werden kann, um intraendosomal pH zu messen. Zum Beispiel wird die häufig verwendete Farbstoff LysoSensor meist Partition in der mehr sauer lysosomalen Kompartiment. Der Umfang der Trennwand dieses Farbstoffs im endosomalen Kompartiment auf pH-Werte innerhalb dieser Vesikel abhängen, was ein großer Nachteil ist, wenn die Messung intravesikulären pH in Zellen, in denen der endosomalen pH-Homöostase verändert wird.

Abschließend beschreiben wir hier einen Ansatz, um gleichzeitig die cytosolische und endosomalen pH-Werte in einzelnen Zellen. Dies ist besonders wichtig für die Untersuchung der pH-Homöostase in Zellen überall dorte Mutationen oder Medikamente können Ausstrom und Einstrom von Protonen in Endosomen beeinflussen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Solutions for calibration
Sodium chloride Fischer L-11621
Potassium chloride Fischer M-12445
D-Glucose (dextrose) Fischer D16-1
Magnesium sulfate Fischer M65-500
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Calcium chloride dihydrate Fischer M-1612
Deionized water N/A N/A
Nigericin Calbiochem 481990 Toxic by inhalation or in contact with skin
Keep protected from the light at 4 °C
Culture dishes ∅ 35mm BD Biosciences 354456
pH-sensing probes
8-Hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid (HPTS) Life technologies H-348 Keep away from the light at room temperature
5-(and-6)-Carboxy SNARF®-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate Life technologies C-1271 Keep away from the light and humidity at -20 °C
Dimethyl Sufoxide (DMSO) Fischer BP231-1  Harmful
Phosphate buffered saline (PBS) 100X
Potassium chloride Fischer M-12445 20 g
Sodium phosphate monobasic Fischer S369-1 115 g
Potassium phosphate monobasic J.T Baker 3246-01 20 g
Deionized water N/A N/A Bring to 1 L
Autoclave and adjust pH to 7.4
Phosphate buffered saline (PBS) 1X
PBS 100X N/A N/A 50 ml
Sodium chloride Fischer L-11621 40.5 g
Deoinized water N/A N/A Bring to 5 L
pH modulators
Bafilomycin A1 Sigma-Aldrich B-1793
5-(N-Ethyl-N-isopropyl)amiloride (EIPA) Sigma-Aldrich A3085
Ammonium chloride Fischer A649-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Demaurex, N. pH Homeostasis of cellular organelles. News Physiol Sci. 17, 1-5 (2002).
  2. Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression. Nat Rev Cancer. 11, 671-677 (2011).
  3. Hinton, A., et al. Function of a subunit isoforms of the V-ATPase in pH homeostasis and in vitro invasion of MDA-MB231 human breast cancer cells. J Biol Chem. 284, 16400-16408 (2009).
  4. Overly, C. C., Lee, K. D., Berthiaume, E., Hollenbeck, P. J. Quantitative measurement of intraorganelle pH in the endosomal-lysosomal pathway in neurons by using ratiometric imaging with pyranine. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 3156-3160 (1995).
  5. Drose, S., Altendorf, K. Bafilomycins and concanamycins as inhibitors of V-ATPases and P-ATPases. J Exp Biol. 200, 1-8 (1997).
  6. Pedersen, S. F., King, S. A., Nygaard, E. B., Rigor, R. R., Cala, P. M. NHE1 inhibition by amiloride- and benzoylguanidine-type compounds. Inhibitor binding loci deduced from chimeras of NHE1 homologues with endogenous differences in inhibitor sensitivity. J Biol Chem. 282, 19716-19727 (2007).
  7. Alfonso, A., Cabado, A. G., Vieytes, M. R., Botana, L. M. Calcium-pH crosstalks in rat mast cells: cytosolic alkalinization, but not intracellular calcium release, is a sufficient signal for degranulation. Br J Pharmacol. 130, 1809-1816 (2000).
  8. Han, J., Burgess, K. Fluorescent indicators for intracellular pH. Chem Rev. 110, 2709-2728 (2010).
  9. Giuliano, K. A., Gillies, R. J. Determination of intracellular pH of BALB/c-3T3 cells using the fluorescence of pyranine. Anal Biochem. 167, 362-371 (1987).
  10. Willoughby, D., Thomas, R., Schwiening, C. The effects of intracellular pH changes on resting cytosolic calcium in voltage-clamped snail neurones. J Physiol. 530, 405-416 (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics