Medición pH simultánea en Endocítica y citosólicas compartimentos en las células vivas usando microscopía confocal

Biology

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Lucien, F., Harper, K., Pelletier, P. P., Volkov, L., Dubois, C. M. Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (86), e51395, doi:10.3791/51395 (2014).

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Abstract

Protocol

1. Preparación de las soluciones de calibración pH celular

  1. Agregue los siguientes compuestos de cinco tubos de 50 ml cónicos separados para preparar 5 soluciones que se utilizarán para la calibración:
    • De NaCl (1 ml de 1 M de NaCl) (1 M de NaCl = 0,58 g en 10 ml de H 2 0)
    • KCl (6,75 ml de KCl 1 M) (1 M KCl = 0,75 g en 10 ml de H 2 0)
    • La glucosa (1 ml de 1 M de D-glucosa) (1M D-glucosa = 1,80 g en 10 ml de H 2 0)
    • MgS0 4 (0,05 ml de 1 M MgSO4) (1 M MgSO4 = 1,20 g en 10 ml de H 2 0)
    • HEPES 20 mM (1 ml de HEPES 1 M) (1 M HEPES = 2,38 g en 10 ml de H 2 0)
    • CaCl2 (0,05 ml de CaCl2 1 M) (1 M de CaCl 2 = 1,47 g en 10 ml de H 2 0)
      Preparar todas las soluciones en doble destilada H 2 O (ddH2O).
  2. Complete cada solución con 35 ml de ddH2O y mezclar con un agitador magnético hasta que por lolución se logra.
  3. Ajuste el pH de cada solución con KOH 1 N o HCl 1 N para obtener valores de pH de 5,5, 6,0, 6,5, 7,0 y 7,5. A continuación, ajuste el volumen con agua desionizada hasta un volumen final de 50 ml.
  4. Medida 5 mg de nigericina y agregarlo a 670 l de EtOH absoluto para preparar a 10 mM nigericina solución madre.
    Precaución: nigericina es altamente tóxica y debe manejarse con mucho cuidado (guantes, gafas de seguridad y mascarilla). Mezclar la solución por inversión hasta que la nigericina se haya disuelto completamente.
  5. Añadir 0,05 ml de 10 mM de nigericina (concentración final 10 mM) a cada solución de calibración. Nigericina es un ionóforo que aumenta la permeabilidad de la membrana celular y causa de equilibrado del pH intracelular y extracelular en presencia de una concentración de despolarización de K + extracelular.
  6. Soluciones de calibración se pueden almacenar hasta 1 mes a 4 ° C

2. Preparación de la célula

  1. Bajo un safet biológicaY capó, en células de semillas 35 mm de placas de cultivo de 10 mm x en 2 ml de medio de crecimiento suplementado con suero bovino fetal al 10% y antibióticos. Utilice la cantidad de células necesaria para asegurar aproximadamente el 50% de confluencia después de 24 horas.
    NOTA: En nuestros experimentos, utilizamos la línea celular HT-1080 y 1 x 10 5 células por placa de cultivo en placa.
  2. Determinar el número de placas de cultivo necesarios para el experimento y la placa 5 placas de cultivo adicionales que se utilizarán para la calibración.
  3. Platos sitúan la cultura en el C / 5% de CO 2 incubadora a 37 º durante al menos 24 horas.

3. Preparación de sondas de sensor de pH

  1. Preparar una solución madre 1 M de la sonda de pH fluorescente 8-hidroxipireno-1, 3,6 trisulfónico, sal trisódica (HPTS / piranina) en ddH 2 0. Esta solución debe ser almacenada a temperatura ambiente y protegido de la luz.
  2. Preparar una solución madre de 1 mM 5 - (y-6)-carboxilo seminaphthorhodafluor acetoximetil éster de acetato (C-SNARF-1 am; llamado thereâespués de SNARF-1) por disolución de 1 mg de SNARF-1 en 1,76 ml de DMSO. Mezcle bien con la pipeta repetido. SNARF-1 solución deberá conservarse a -20 ° C y protegido de la luz.

4. Etiquetado Celular

  1. Dieciséis horas antes de imágenes de células vivas, añadir 2 l de solución madre 1 M de HPTS (concentración final 1 mM) a cada placa de cultivo que contiene 2 ml de medio completo.
  2. Vuelva a poner las placas de cultivo a la incubadora. La sonda HPTS es celular-impermeant, por lo tanto, a la etiqueta organelos la sonda debe ser tomado por pinocitosis. Esta condición requiere que las incubaciones de células con HPTS se llevan a cabo en medio de cultivo suplementado con suero.
  3. Tras la incubación con HPTS, se lavan las células dos veces con PBS estéril y añadir 2 ml de medio libre de suero durante al menos 2 horas. La incubación con SNARF-1 necesita ser realizada en medio libre de suero, porque el suero puede prevenir la absorción de la sonda.
  4. Añadir 10 l de una SNARF-1 de solución madre 1 mM para obtener afconcentración inal de 5 M y permiten a las células se incuban durante 20 minutos a 37 ° C, bajo luz tenue. C-SNARF-1 concentración y tiempo de incubación pueden variar según el tipo de célula.
  5. Al final de la incubación, lavar las células dos veces en PBS estéril y añadir 2 ml de medio libre de suero.

5. La adición de pH Moduladores

  1. Para evaluar si el método puede detectar cambios de pH en las células, diferentes reactivos que modulan el pH intracelular se pueden utilizar:
    • Bafilomicina A1, un inhibidor específico de la V-ATPasa 5
    • De Na + / H + intercambiador de isoforma 1 (NHE-1) 6
    • NH 4 Cl, una base débil que aumenta intracelular pH 7
    1. Preparar las soluciones madre de los reactivos mencionados anteriormente:
      • Bafilomicina A1: añadir 10 g de bafilomicina A1 a 160 l de DMSO para obtener una solución madre de 100 mM
      • EIPA: añadir 25 mg de EIPA a 1,67 ml de metanol para obtena concentración final de 50 mM
      • NH4Cl: disolver 0,53 g de cloruro de amonio en 10 ml de ddH2O para obtener una concentración final de 1 mM.

      Nota: Todas las soluciones madre deben mantenerse a 4 ° C con excepción de bafilomicina A1, que deben ser almacenados a -20 ° C y protegido de la luz.
    2. En placas de cultivo separadas, agrega uno de los reactivos como se indica a continuación:
      • 2 l de 100 mM bafilomicina A1 (concentración final 100 nM)
      • 1 l de 50 mM EIPA (concentración final 25 mM)
      • 40 l de 1 M NH4Cl (concentración final 20 mM)
    3. Se incuban las células durante 30 min a 37 ° C.
  2. Proceder a la adquisición de imágenes.

6. Especificaciones del microscopio Células vivas imágenes y ajustes de adquisición

  1. Realizar imágenes de células vivas utilizando un objetivo de 40x montada en un escaneo confocal espectral invertida microscópicape equipado con una platina motorizada XY, una cámara que acomoda vidrio placas de cultivo de fondo en un ambiente controlado (temperatura, humedad, CO 2) etapa incubadora.
  2. El instrumento confocal (Olympus FV1000) usado aquí está equipado con:
    • Un láser de diodo de 405 nm
    • Un láser de argón de 40 mW (458 nm, 488 nm, 515 nm)
    • Un láser de helio-neón (543 nm)
    • Fluorita objetivo 10X, NA0.4
    • Un objetivo LUCPLFLN 40X, NA0.60
    • Un objetivo aceite PLAPONSC PLAN APO 60X, NA1.4
    • Un espejo dicroico 405/458/488/543 DM
    • Un SDM 560 y un SDM 640 filtros dicroicos
    • Un filtro de barrera BA655-755
    • A BS20/80 divisor de haz
    • Software de análisis de datos para la adquisición y análisis de imágenes,
  3. Una vez que la etapa incubadora se ha calentado a 37 ° C y el microscopio está establecido, coloque una placa de cultivo previamente incubados con HPTS y SNARF-1 en la cámara de imagen confocal etapa.
  4. Laespués de la localización de un área de interés, ajustar la configuración de adquisición de software Figura 1.
    • La creación de dos conjuntos de canales virtuales.
    • Iniciar la primera fase que corresponde a HPTS excitación a 405 nm y recogida de emisión a 505-525 nm y SNARF-1 excitación a 543 nm y recogida de emisión a 570-600 nm.
    • Iniciar la segunda fase que corresponde a HPTS excitación a 458 nm y recogida de emisión a 505-525 nm y SNARF-1 excitación a 543 nm y recogida de emisión a 640-650 nm.
    • La apertura confocal se establece en 175 micras por defecto y apertura óptimos debe configurarse manualmente a 300 micras.
    • Tome imagen apilando secciones ópticas horizontales en serie (800 x 800 píxeles) de 0,4 m de espesor.

NOTA: Un objetivo de 40X es útil observar varias celdas a la vez y funciona bien para la visualización orgánulo. Sin embargo, la resolución espacial y la intensidad de la señal son better logra utilizando un objetivo de aceite de 60X. Además, no hay ninguna excitación o de emisión de la diafonía entre los dos colorantes.

7. Calibración de sondas de pH con sensor

  1. Antes de la calibración, retire medio de la placa de cultivo previamente incubadas con HPTS y SNARF-1, lavar dos veces con PBS estéril y luego añadir 2 ml de una de las cinco soluciones de calibración.
  2. Coloque la placa de cultivo en la cámara etapa confocal.
  3. Proceda a la adquisición de la imagen de lapso de tiempo de acuerdo a los siguientes parámetros:
    1. Configure el número de imágenes y de los tiempos de duración de intervalo para el experimento.
      NOTA: Por lo general utilizan un intervalo de 1 minuto entre las imágenes para un máximo de 30 min.
    2. Programar el obturador para cerrar entre la adquisición de cada imagen.
  4. Anote la intensidad de fluorescencia por minuto en un software de hoja de cálculo y determinar el momento en el que la intensidad de fluorescencia es constante. PH intracelular es generalmente estable después del 15 - 20 min.
  5. REPEAT pasos 7.1 a 7.4 usando una nueva placa de cultivo para cada solución de calibración restante.

8. Adquisición de Datos

  1. Una vez que la calibración se ha hecho, la adquisición de datos de la muestra 4-5 campos elegidos al azar que contienen 15 a 20 células por campo. Dos imágenes se obtienen para cada campo: uno para el etiquetado de HPTS (vesículas) y la segunda para SNARF-1 etiquetado (citosol).
  2. La fluorescencia de fondo (zona extracelular) se resta digitalmente de imágenes fluorescentes de ambas sondas. Vesículas etiquetadas y citosol de sus respectivas imágenes almacenadas se seleccionan usando una máscara binaria. Para cada sonda de pH con sensor de intensidad de fluorescencia se miden en una escala numérica (0-4,095 escala de nivel de gris). Una intensidad media para todos los píxeles en el orgánulo o citoplasma se calcula y valores se utilizan para calcular los coeficientes de fluorescencia.

9. Análisis de Datos

  1. Distintos paquetes de software disponibles en el mercado para el análisis de datos. IeSoftware Fluoview.
  2. En una hoja de cálculo, valores de registro y cálculo de coeficientes de fluorescencia de la siguiente manera: En el caso de HPTS, R = (F 458 nm / F 405 nm) y, en el caso de SNARF-1, R = (F 644 nm / F 584 nm ).
  3. Grafica los datos utilizando software de gráficos científico como GraphPad Prism. La trama debe representar coeficientes de fluorescencia (eje Y) como una función del pH (eje X). El ajuste de curvas se consigue mediante regresión no lineal.
  4. Recoger la intensidad de fluorescencia de las muestras como se describe en el paso 8.2 y calcular los coeficientes de fluorescencia. Utilice las curvas de calibración para transformar relaciones en valores de pH.

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Representative Results

Para la medición simultánea de pH en tanto intracelular y compartimentos celulares endosomal / lisosomales, se utilizaron las sondas fluorescentes de pH de detección ratiometric SNARF-1 y HPTS. SNARF-1 está limitada al compartimiento citosólico de HPTS mientras que permite la medición del pH radiométrica del compartimiento endosomal / lisosomal. Carga celular con HPTS durante 16 horas permite su localización selectiva en endosomas / lisosomas 4. Un ejemplo típico de fluorescencia registrada a partir de células HT-1080 cargados con las sondas de sensor de pH se muestra en la Figura 2A. La evidencia de que las etiquetas de HPTS tanto endosomal y lisosomales compartimentos se obtuvo por la co-tinción con Alexa 546-conjugado de transferrina (endosomas) o una sonda fluorescente lysotrophic (Lysotracker profundo Reddye). Los datos mostraron claramente que HPTS manchada ambos compartimentos Figura 2A.

Usando la metodología descrita anteriormente, los valores de pH intracelulares en células vivas se determinaron utilizandouna curva de calibración para cada sonda Figuras 2B y 2C, sobre la base de las propiedades radiométricas de cada colorante sensible al pH. Las cinco soluciones de calibración se utilizan para convertir las intensidades de fluorescencia a unidades de pH. Los datos de tres calibraciones independientes son reportados para cada pH con sensor de sonda de la figura 2C. Cada punto de datos representa una relación de intensidad de fluorescencia a longitudes de onda de excitación de 458/405 nm para HPTS o longitudes de onda de emisión de 644/584 nm para SNARF-1 a un pH dado. Las curvas de calibración para ambas sondas mostraron una relación no lineal que fue mejor equipado con una ecuación exponencial Figura 2C. La eficiencia del método para la detección de cambios de pH del compartimiento asociada celulares se evaluó en células HT-1080 en vivo usando NH4Cl, una base débil que aumenta el pH intracelular, bafilomicina A1, un inhibidor farmacológico de V-ATPasas y EIPA, un NHE- 1 inhibidor. NH 4 Cl desencadenó intravesicular y citoSolic pH aumenta 6,35-7,10 y 7,00-7,40, respectivamente Figuras 3A y 3B. Bafilomicina A1 induce alcalinización de los compartimentos endosomal lisosomales y sin alterar el pH citosólico. En contraste, EIPA induce la acidificación del citosol alcanzar un valor de pH de 6,62 en comparación con 7,00 en las células sin tratar las figuras 3A y 3B.

Figura 1
Figura 1. Diagrama de configuración de adquisición para el microscopio de escaneo láser confocal. (A) La primera fase se ajusta para excitar HPTS a 405 nm y SNARF-1 a 543 nm de forma simultánea a través de un dicroico (DM405/488/543/633) espejo. La emisión de fluorescencia se registra por primera vez para HPTS a 505-525 nm usando un espejo dicroico (SDM560). La emisión de fluorescencia de SNARF-1 se controla a continuación a través de un bandpafiltro de SS interferencia en la gama de 570-600 nm. (B) La segunda fase se establece para recoger simultáneamente la emisión de fluorescencia de HPTS (EXC, 458 nm) y SNARF-1 (EXC, 543 nm). Excitación de la sonda generada por el rayo láser pasa a través de un divisor de haz (BS20/80) y la emisión de fluorescencia para cada sonda se recoge a través de los espejos dicroicos utilizados en la primera fase. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. En la calibración in situ de sondas de pH con sensor. (A) Imágenes representativas de HPTS y SNARF-1 subcelular localización en HT-1080 células de fibrosarcoma. Imágenes superiores muestran que SNARF-1 etiqueta el citoplasma mientras que HPTFluorescencia asociada-S muestra la localización intravesicular. Células HT-1080 se incubaron durante 30 min con Alexa 546-conjugado de transferrina (5 mg / ml) o un colorante lysotrophic (Lysotracker profundo Reddye) (100 nM), respectivamente. Imágenes inferiores muestran que HPTS colocaliza con la transferrina y el colorante lysotrophic (60X). (B) Imágenes representativas de ambas sondas sensor de pH en las células incubadas durante 15 minutos con soluciones de calibración a pH 6,0 y pH 7,5. (C) Relación de intensidad de fluorescencia ratios para HPTS y SNARF-1 determinados utilizando las soluciones de calibración en función del pH. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3. Modulación de i ntracellular pH por bafilomicina A1, EIPA y NH4Cl. inhibidores farmacológicos (bafilomicina A1, EIPA) y el modulador intracelular pH NH 4 Cl se utilizaron para validar la metodología. Los gráficos muestran valores de pH registrados en el compartimiento endosomal / lisosomal (A) o el citoplasma (B) de células HT-1080 cargados con HPTS y SNARF-1 y se incubaron durante 30 min en presencia o ausencia (control) de NH4Cl ( 20 mM), EIPA (25 M) o bafilomicina A1 (100 nM). Los datos se representan como la media ± SEM (** p 0,005, *** p 0,0001).

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Discussion

Es necesaria la medición cuantitativa de pH en imágenes de células vivas de diferentes compartimentos celulares para medir con precisión las variaciones de pH en las respuestas celulares a los desafíos externos. Sin embargo, uno de los principales obstáculos que queda es para apuntar fácilmente y, específicamente, los compartimentos celulares. A este respecto, algunos estudios han puesto de relieve el uso de HPTS como un indicador de pH intracelular introducido en las células mediante electroporación o microinyección 8-10. Estas técnicas tienen serios inconvenientes, a saber, la electroporación provoca grandes daños a las células, y la microinyección requiere equipo especial y habilidades técnicas. De interés, Hinton et al., Han informado anteriormente de que HPTS puede ser captado por las células por un proceso de pinocitosis y que la combinación de SNARF-1 y HPTS se puede utilizar para controlar el pH de la citosol y / endosomal compartimentos lisosomales 3 . Hemos utilizado esta propiedad para registrar las variaciones de pH en el compartm lisosomal / endosomalENT de las células HT-1080 en vivo. La evidencia de que HPTS se encuentra en este compartimiento y, por lo tanto, podría servir como un indicador de pH fiable se obtuvo por la co-tinción con transferrina conjugado con fluoróforo, un marcador del compartimento lisosomal / endosomal, o con un colorante acidófilas que etiqueta mayoría lisosomas figura 2. Además, el uso de diferentes moduladores intracelulares de pH dirigidas a compartimentos celulares distintos indicó que la bafilomicina A1 aumentó específicamente pH intravesicular sin alterar el pH citoplasmático. En contraste, EIPA alterado principalmente del pH citosólico pero tuvo poco o ningún efecto sobre endosomal y pH lisosomal mientras que el cloruro de amonio afectada pH de ambos compartimentos. Estos resultados proporcionan evidencia de que SNARF-1 y HPTS se podrían utilizar para monitorizar simultáneamente los cambios de pH en estos dos compartimentos celulares diferentes.

Una característica importante del método descrito aquí es el uso de microscopía confocal de barrido láser. La mayoría de estudios de reposrted en la literatura sobre las mediciones de pH intracelular se han realizado por espectrofluorometría. Aunque fácil de usar y proporcionar la adquisición de datos rápida, este enfoque no permite la observación de las células durante el experimento. Este inconveniente puede llegar a ser de importancia, ya que ha sido nuestra experiencia que durante la etapa de calibración, la incubación prolongada bajo condiciones ácidas (pH 5.5) o alcalino (pH 8,0) que puede afectar negativamente a diversos tipos de células y provocar la apoptosis. En el caso de células HT-1080, la apoptosis conduce a la autofluorescencia roja, interfiriendo así con la fluorescencia dependiente del pH de SNARF-1 (datos no mostrados). Para evitar este problema, hemos utilizado una placa de cultivo separado para cada calibración y experimentos desechados donde se observaron signos de apoptosis o otras alteraciones celulares. El uso de la microscopio confocal para mediciones de pH también hace que el análisis de datos más fácil. Por ejemplo, el análisis de imágenes de microscopía de fluorescencia confocal se puede utilizar para descartar artefactos, apoptotic células y el ruido de fondo, hacer cálculos más fácil y precisa.

Aunque el método descrito aquí ofrece muchas ventajas sobre otros enfoques, tiene algunas limitaciones. Uno de ellos es el relacionado con las diferentes condiciones de carga requeridos para cada sonda. Con respecto a HPTS, el colorante tiene que ser tomado por pinocitosis. Esta restricción requiere que las células deben mantenerse durante un período prolongado de tiempo (por ejemplo, 12 horas) en un medio suplementado con suero para promover la pinocitosis y por lo tanto el etiquetado del compartimiento endocítica. En contraste, las células permeante SNARF-1 necesita ser incubado en un medio libre de suero para evitar la posibilidad de acetoximetil éster (AM) hidrólisis por esterasas no específicas que contienen suero. Estas restricciones se excluirán los protocolos experimentales que requieren condiciones de cultivo de células de carga incompatible. Además, la sensibilidad de HPTS al medio ácido es una limitación importante. Como se muestra en la Figura 2, fintensidades luorescence de HPTS excitados a 458 nM muestran una variación mínima a pH 6,0 o inferior, con relaciones cercanas a los valores básicos. Esta propiedad intrínseca de HPTS debe ser tenido en cuenta en el caso de los estudios de los compartimentos celulares muy ácidos, tales como los lisosomas que tienen valores de pH tan bajos como 4,0 a 5,0. Sin embargo, para nuestro conocimiento, HPTS es el único tinte radiométrica disponible que puede ser utilizado para medir el pH intraendosomal. Por ejemplo, el colorante LysoSensor comúnmente utilizados serán en su mayoría de partición dentro del compartimento lisosomal más ácida. La extensión de la partición de este colorante en el compartimiento endosomal dependerá de los valores de pH dentro de estas vesículas, que es un gran inconveniente cuando se mide el pH intravesicular en las células donde se altera la homeostasis del pH endosomal.

En conclusión, se describe en este documento un método para medir simultáneamente los valores de pH citosólico y endosomales en células individuales. Esto es especialmente importante para el estudio de la homeostasis del pH en las células where mutaciones o las drogas pueden afectar flujo de salida y el influjo de protones en endosomas.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Solutions for calibration
Sodium chloride Fischer L-11621
Potassium chloride Fischer M-12445
D-Glucose (dextrose) Fischer D16-1
Magnesium sulfate Fischer M65-500
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Calcium chloride dihydrate Fischer M-1612
Deionized water N/A N/A
Nigericin Calbiochem 481990 Toxic by inhalation or in contact with skin
Keep protected from the light at 4 °C
Culture dishes ∅ 35mm BD Biosciences 354456
pH-sensing probes
8-Hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid (HPTS) Life technologies H-348 Keep away from the light at room temperature
5-(and-6)-Carboxy SNARF®-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate Life technologies C-1271 Keep away from the light and humidity at -20 °C
Dimethyl Sufoxide (DMSO) Fischer BP231-1  Harmful
Phosphate buffered saline (PBS) 100X
Potassium chloride Fischer M-12445 20 g
Sodium phosphate monobasic Fischer S369-1 115 g
Potassium phosphate monobasic J.T Baker 3246-01 20 g
Deionized water N/A N/A Bring to 1 L
Autoclave and adjust pH to 7.4
Phosphate buffered saline (PBS) 1X
PBS 100X N/A N/A 50 ml
Sodium chloride Fischer L-11621 40.5 g
Deoinized water N/A N/A Bring to 5 L
pH modulators
Bafilomycin A1 Sigma-Aldrich B-1793
5-(N-Ethyl-N-isopropyl)amiloride (EIPA) Sigma-Aldrich A3085
Ammonium chloride Fischer A649-500

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References

  1. Demaurex, N. pH Homeostasis of cellular organelles. News Physiol Sci. 17, 1-5 (2002).
  2. Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression. Nat Rev Cancer. 11, 671-677 (2011).
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