कैद यौगिक मास स्पेक्ट्रोमेट्री - उपन्यास सी-डि-जीएमपी effector के प्रोटीन की पहचान के लिए एक शक्तिशाली उपकरण

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Biology

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Laventie, B. J., Nesper, J., Ahrné, E., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins. J. Vis. Exp. (97), e51404, doi:10.3791/51404 (2015).

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Abstract

काफी प्रगति दूसरा दूत सी-डि-जीएमपी के संश्लेषण (diguanylate cyclases) और गिरावट (phosphodiesterases) में शामिल एंजाइमों की पहचान और लक्षण वर्णन की दिशा में पिछले दशक के दौरान किया गया है। इसके विपरीत, कम जानकारी इस संकेत अणु सेलुलर प्रक्रियाओं की एक विविध रेंज को नियंत्रित करता है, जिसके माध्यम से आणविक तंत्र और सेलुलर घटकों के बारे में उपलब्ध है। नाम से जाना जाता प्रेरक प्रोटीन के अधिकांश PILZ परिवार के हैं या कटैलिसीस पर दे दिया है और प्रेरक समारोह को अपनाया है कि diguanylate cyclases या phosphodiesterases degenerated कर रहे हैं। इस प्रकार, बेहतर प्रयोगात्मक विधियों सिलिको भविष्यवाणियों में विश्वसनीय असफल जिसके लिए उपन्यास प्रभावोत्पादक की पहचान करने और मान्य करने के लिए आवश्यक हैं बैक्टीरिया की एक विस्तृत श्रृंखला में सेलुलर सी-डि-जीएमपी नेटवर्क को परिभाषित करने के लिए।

हमने हाल ही में करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में एक उपन्यास कैद यौगिक मास स्पेक्ट्रोमेट्री (CCMS) आधारित तकनीक विकसित की हैbiochemically की पहचान करने और सी-डि-जीएमपी बंधनकारी प्रोटीन की विशेषताएँ। इस तकनीक को पहले से जीवों 1 की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू होने की सूचना दी गई है। यहाँ हम हम इस तरह के संकेत घटकों की जांच के लिए उपयोग कि प्रोटोकॉल का विस्तृत विवरण देते हैं। एक उदाहरण के रूप में, हम Pseudomonas aeruginosa, सी-डि-जीएमपी डाह और biofilm नियंत्रण करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, जिसमें एक अवसरवादी रोगज़नक़ का उपयोग करें। CCMS सी-डि-जीएमपी नेटवर्क के नाम से जाना जाता है या भविष्यवाणी घटकों के 74% (38/51) की पहचान की। इस अध्ययन में विस्तार से CCMS प्रक्रिया बताते हैं, और छोटे अणु संकेतन में शामिल उपन्यास घटकों की पहचान करने के लिए एक शक्तिशाली और बहुमुखी उपकरण के रूप में स्थापित करता है।

Introduction

सी-डि-जीएमपी उनके विकास और व्यवहार के विभिन्न पहलुओं को नियंत्रित करने के लिए सबसे बैक्टीरिया द्वारा इस्तेमाल के लिए एक चाबी दूसरे के दूत है। उदाहरण के लिए, C-डि-जीएमपी कोशिका चक्र प्रगति, गतिशीलता और exopolysaccharides और सतह adhesins 2-4 की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है। ऐसी प्रक्रियाओं के समन्वय के माध्यम से सी-डि-जीएमपी biofilm गठन, रोगजनक बैक्टीरिया 5 की एक सीमा के जीर्ण संक्रमण के साथ जुड़ा हुआ है जो एक प्रक्रिया को बढ़ावा देता है। सी-डि-जीएमपी एक उत्प्रेरक GGDEF डोमेन 4 बंदरगाह कि diguanylate cyclases (DGCs) नामक एंजाइमों द्वारा synthetized है। कुछ DGCs नीचे सी-डि-जीएमपी बाध्यकारी पर साइक्लेस गतिविधि को नियंत्रित करता है कि एक निरोधात्मक साइट के पास है। सी-डि-जीएमपी की गिरावट एक उत्प्रेरक EAL या HD-ढकोसला या तो डोमेन 6,7 शरण phosphodiesterases की दो अलग-अलग वर्गों (PDEs) द्वारा उत्प्रेरित कर रहा है।

सीधे सी-डि-जीएमपी कि बाँध में जाना जाता प्रेरक प्रोटीन का बहुमत प्रोटीन की केवल तीन वर्गों में से एक हैं: उत्प्रेरकसहयोगी निष्क्रिय GGDEF या EAL डोमेन और PILZ डोमेन, सी-डि-जीएमपी 8 बाध्यकारी पर गठनात्मक परिवर्तन से गुजरना है कि छोटे आणविक स्विच। DGCs, PDEs और PILZ प्रोटीन अच्छी तरह से विशेषता है और उनकी डोमेन के अपेक्षाकृत सुरक्षित रूप से सिलिको में भविष्यवाणी की जा सकती है। एक विशेष रुचि अब सी-डि-जीएमपी effectors के नए वर्गों की पहचान पर केंद्रित है। विभिन्न बाध्यकारी रूपांकनों के साथ कुछ सी-डि-जीएमपी प्रभावोत्पादक Burkholderia cenocepacia में सीआरपी / एफ एन आर प्रोटीन परिवार Bcam1349 या पी में ट्रांसक्रिप्शनल नियामक FleQ के रूप में हाल ही में इस तरह वर्णित किया गया aeruginosa 9,10। इसके अलावा, सी-डि-जीएमपी-विशिष्ट riboswitches हाल ही में पहचान की है और एक सी-डि-जीएमपी-निर्भर तरीके से 11 में जीन की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए दिखाया गया था। विभिन्न effectors के सी-डि-जीएमपी बाध्यकारी रूपांकनों ही खराब संरक्षित ऐसे प्रोटीन की पहले से पंजीकृत भविष्यवाणियों मुश्किल बना रहे हैं। इस मुद्दे के समाधान के लिए, हम एक सी-डि-जीएमपी spe के उपयोग पर आधारित है, जो एक जैव रासायनिक विधि विकसित की है,cific कैद यौगिक मास स्पेक्ट्रोमेट्री 1,12,13 के साथ संयुक्त।

हमने हाल ही में (CDG-सीसी, चित्रा 1) एक उपन्यास त्रिसंयोजक सी-डि-जीएमपी कैद यौगिक इंजीनियर है 1। इस रसायन पाड़ से बना है: प्रोटीन बाध्यकारी सी-डि-जीएमपी कब्जा करने के लिए चारे के रूप में प्रयोग किया जाता है 1) एक सी-डि-जीएमपी आधा भाग, 2) एक यूवी photoactivatable प्रतिक्रियाशील समूह लिंक को पार करने के लिए इस्तेमाल के लिए बाध्य प्रोटीन के लिए CDG-सीसी और 3) एक बायोटिन streptavidin लेपित चुंबकीय मोतियों का उपयोग कर लिया प्रोटीन को अलग-थलग करने के लिए। CDG-सीसी सीधे और विशेष रूप से सेल lysates के रूप में अणुओं की जटिल मिश्रण से सी-डि-जीएमपी प्रभावोत्पादक कब्जा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। कैद यौगिक आधारित हैं और रासायनिक प्रोटिओमिक्स आधारित दृष्टिकोण पहले से जीवों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू होने की सूचना दी गई है, जैसे Caulobacter crescentus, सैल्मोनेला एन्ट्रिका serovar ताकि और पी aeruginosa 1,14।

इस पद्धति पत्र में,हम पी के अर्क का उपयोग कर CCMS प्रक्रिया का गहराई से वर्णन में एक प्रदान एक उदाहरण के रूप aeruginosa। इस अध्ययन को biochemically छोटे अणु संकेतन में शामिल उपन्यास घटकों की पहचान करने के लिए एक शक्तिशाली और बहुमुखी उपकरण के रूप में CCMS स्थापित करता है।

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Protocol

1. Lysate तैयारी

  1. पी बढ़ो वांछित आयुध डिपो के लिए लेग में aeruginosa कोशिकाओं।
    नोट: मार्गदर्शन के लिए: प्रवेश चरण संस्कृतियों के लिए स्थिर चरण संस्कृतियों के लिए ≈ 100 मिलीलीटर संस्कृति / नमूना और ≈ 500 मिलीलीटर संस्कृतियों / नमूना (आयुध डिपो 600nm = 0.5) का उपयोग करें।
  2. 5000 x जी पर 20 मिनट के लिए centrifugation द्वारा गोली।
  3. Resuspend 0.5-1 1 मिलीलीटर lysis बफर में गोली की जी (6.7 मिमी एमईएस, 6.7 मिमी HEPES, 200 मिमी NaCl, 6.7 मिमी KAC, डीडीटी 1 मिमी, पीएच 7.5) और protease अवरोध करनेवाला (पूरा मिनी, EDTA के मुक्त) जोड़ने के रूप में अच्छी तरह से DNaseI के रूप में।
  4. Lyse 20,000 साई में एक फ्रांसीसी दबाव सेल के माध्यम से तीन मार्ग द्वारा कोशिकाओं, (सामग्री की सूची देखें)।
  5. अल्ट्रा अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 100,000 x जी पर सेल lysate।
  6. सतह पर तैरनेवाला सहेजें (2 कदम करने के लिए जाने के लिए)।
  7. ऊपर और नीचे pipetting द्वारा lysis बफर 1x 1 मिलीलीटर के साथ गोली धो लें।
  8. Ultracentrifuge 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए एक लाख x जी पर।
  9. में गोली फ्लैश फ्रीजझिल्ली प्रोटीन (चरण 3 देखें) के कब्जा करने के लिए प्रयोग किया जाता है जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर तरल नाइट्रोजन और दुकान।

सी-डि-जीएमपी नि: शुल्क और अन्य न्यूक्लियोटाइड 2. निकालना (घुलनशील अंश केवल)

  1. ठंड lysis बफर के 10 एमएल के साथ एक PD10 desalting स्तंभ (देखें सामग्री सूची) धो लें।
  2. न्यूक्लियोटाइड को दूर करने के क्रम में PD10 पर सतह पर तैरनेवाला (≈ 1 मिलीलीटर) डालो।
  3. 4 मिलीलीटर ठंड lysis बफर (500 μl कदम) के साथ elute।
  4. ब्रैडफोर्ड परख द्वारा निर्धारित रूप में सबसे अधिक ध्यान केंद्रित किया अंशों का चयन करें, और उन्हें पूल।

3. गोली Resuspension और solubilization (झिल्ली अंश केवल)

  1. (डिटर्जेंट के बिना) 1x कब्जा बफर के 500 से 1000 μl में गोली Resuspend (1 टेबल देखें)।
    नोट: गोली resuspend के लिए मुश्किल है। मोटे तौर पर अच्छी तरह से समाधान homogenize करने के लिए एक सिरिंज 27 जी उपयोग करने के लिए, फिर गोली resuspend करने के लिए यह एक विंदुक के साथ पहली बार पिपेट अप करने के लिए और नीचे की सलाह दी है।
  2. 1% जोड़ें (w / v) एन dodecyl-β-डी-maltopyranoside (DDM)।
  3. एक घूर्णन पहिया पर कम से कम दो घंटा (या हे / एन) के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  4. Ultracentrifuge 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए एक लाख x जी पर।
  5. सतह पर तैरनेवाला हार्वेस्ट।

4. प्रोटीन एकाग्रता मापन

  1. (झिल्ली अंश के लिए बीसीए परख करके) ब्रैडफोर्ड परख द्वारा प्रोटीन एकाग्रता उपाय।
  2. 10 मिलीग्राम / एमएल के लिए कुल प्रोटीन एकाग्रता सेट करें।

5. कैद

  1. सकल घरेलू उत्पाद, जीटीपी, एटीपी, CTP की एक मिमी, और 5x कब्जा बफर (100 मिमी HEPES, 250 मिमी KAC, 50 मिमी MgAc, 5% ग्लिसरॉल, पीएच 7.5) (तालिका 1) के 20 μl के साथ प्रोटीन की 300 माइक्रोग्राम प्रति मिलाएं। एच 2 ओ के साथ 100 μl की प्रतिक्रिया मात्रा समायोजित
    नोट: कुल मात्रा प्रतियोगिता नियंत्रण के मामले में CDG-सीसी और सी-डि-जीएमपी की मात्रा भी शामिल है (कदम 5.3 और 2 टेबल देखें)।
    नोट: सभी प्रयोगों 200 & में प्रदर्शन किया गया# 181; एल 12-ट्यूब पीसीआर स्ट्रिप्स (थर्मो वैज्ञानिक)।
    नोट: झिल्ली अंश के लिए, हमेशा महत्वपूर्ण मिसेल एकाग्रता 8 एम यूरिया में प्रोटीन solubilization कदम तक (7.1 चरण) (वी / डब्ल्यू 0.01%) ऊपर DDM एकाग्रता रखने के लिए सुनिश्चित करें।
  2. एक घूर्णन पहिया पर 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  3. 10 माइक्रोन CDG-सीसी (अंतिम एकाग्रता) जोड़ें।
    नोट: ("मनका नियंत्रण" के रूप में कहा गया है) CDG-सीसी के बिना एक नियंत्रण है, और 1 मिमी सी-डि-जीएमपी ("प्रतियोगिता नियंत्रण") के साथ पूरक एक नियंत्रण शामिल हैं (तालिका 2 देखें)।
    नोट: CDG-सीसी एकाग्रता 1 से 10 माइक्रोन के लिए समायोजित किया जा सकता है।
  4. अंधेरे में, एक घूर्णन पहिया पर कम से कम दो घंटा (हे / N के लिए झिल्ली अंश) के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  5. एक CaproBox का उपयोग करते हुए चार मिनट के लिए यूवी प्रकाश के साथ CDG-सीसी की प्रतिक्रियाशील आधा भाग की सक्रियता से एक छोटी स्पिन, पार से लिंक, के बाद (स्रोत से = 310 एनएम, विकिरण ≥10 मेगावाट / सेमी ², दूरी सामग्री की सूची देखने के लिए, λ = 2 सेमी)। नोट: स्ट्रिप्स से पहले पार से जोड़ने के ढक्कन हटा दें।
  6. धीरे homogenize, 25 μl 5x धोने बफर (5 एम NaCl, 250 मिमी Tris, पीएच 7.5) और अच्छी तरह से resuspended streptavidin चुंबकीय मोतियों की 50 μl जोड़ें।
  7. एक घूर्णन पहिया पर 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।

6. धोने कदम

नोट: (चुंबक: माल की सूची देखें)। चुंबक के साथ पीसीआर पट्टी ढक्कन में चुंबकीय मोतियों की एक पर कब्जा, साथ शुरू करो। फिर अगले धोने समाधान युक्त एक नया एक से पीसीआर पट्टी की जगह। चुंबक निकालें और मोती resuspend, और 2 मिनट सेते हैं। नीचे स्पिन और एक ताजा ढक्कन द्वारा ढक्कन की जगह।

  1. धोने कदम (घुलनशील अंश केवल)
    1. 200 μl 1x धोने बफर में छह बार धोएं।
    2. 200 μl एचपीएलसी ग्रेड एच 2 ओ में एक बार धोएं
    3. 200 μl 80% acetonitrile में छह बार धोएं।
    4. 200 μl एचपीएलसी ग्रेड एच 2 ओ में दो बार धोएं
  2. धोने कदम (MEMBRAपूर्वोत्तर के अंश केवल)
    1. 0.1% DDM 200 μl 1x धोने बफर में 5 बार धोएं।
    2. + 0.05% DDM 200 μl 1x धोने बफर में दो बार धोएं।
    3. + 0.025% DDM 200 μl 1x धोने बफर में एक बार धोएं।
    4. + 0.0125% DDM 200 μl 1x धोने बफर में एक बार धोएं।
    5. 200 μl 100 मिमी एबीसी में तीन बार धोएं (अमोनियम बाइकार्बोनेट, एनएच 4 सीओ 3) + 2 एम यूरिया।

7. एमएस नमूना तैयार

  1. 20 μl 100 मिमी एबीसी (झिल्ली अंश के लिए + 8 एम यूरिया 100 मिमी एबीसी) में (सीधे ढक्कन में) मोती Resuspend और 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों में हस्तांतरण।
  2. झिल्ली अंश केवल: 500 rpm पर मिलाते हुए, 5 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  3. 200 मिमी TCEP (Tris (2 carboxyethyl) phosphine) μl 0.5 जोड़ें और 500 rpm पर मिलाते हुए, 1 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। 25 डिग्री सेल्सियस के लिए शांत हो जाओ।
  4. एक मिलाते हुए, iodoacetamide हौसले से तैयार 400 मिमी के 0.5 μl जोड़ें और 30 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर सेते500 rpm और अंधेरे में टी।
  5. 0.5 μl 0.5 एम एन -acetyl-सिस्टीन जोड़ें और 500 rpm पर मिलाते हुए, 10 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  6. झिल्ली अंश केवल: 1 μl लिस-सी जोड़ने के लिए और 37 डिग्री सेल्सियस, ओ / एन पर सेते हैं।
  7. 2 माइक्रोग्राम प्रति ट्रिप्सिन जोड़ें और 500 आरपीएम (सुखाने को रोकने के लिए Parafilm में लपेट) में मिलाते हुए, 37 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन सेते हैं।
    नोट: नमूने इस चरण में -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है।
    नोट: झिल्ली अंश केवल: trypsin के अलावा पहले <2 एम को यूरिया एकाग्रता समायोजित करने के लिए 100 मिमी एबीसी जोड़ें।
  8. संक्षेप में ट्यूबों नीचे स्पिन और चुंबक के साथ मोती इकट्ठा।
  9. एक नया 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण (मोती छोड़ दिया जाता है तो इस चरण को दोहराएँ)।
  10. 5 μl 5% TFA (trifluoroacetic एसिड) + 1 μl 2 एम एचसीएल (झिल्ली अंश के लिए 15 μl 5% TFA के 5 μl 2 एम एचसीएल) जोड़ें।
  11. हालत C18 MicroSpin कॉलम μl acetonitrile 150 के साथ (नेस्ट समूह, एमए, संयुक्त राज्य अमरीका) (स्पिन 2400 rpm पर 20 सेकंड)।
  12. सम0.1% TFA (स्पिन 20 सेकंड, 2400 आरपीएम) μl C18 कॉलम 150 के साथ 2 बार librate।
  13. नमूना लोड और 2 मिनट, 2000 RPM स्पिन।
  14. प्रवाह के माध्यम से स्तंभ पर पुनः लोड और कताई कदम (2 मिनट, 2000 आरपीएम) दोहराएँ।
  15. 0.1% TFA के μl 150 के साथ तीन बार धोएं, 5% acetonitrile (20 सेकंड, 2400 आरपीएम)।
  16. एक नया ट्यूब ले लो और 150 μl 0.1% TFA के साथ दो बार elute, 50% acetonitrile (2 मिनट, 2000 आरपीएम)।
  17. एक गति-VAC में पेप्टाइड्स सूखी।
  18. 40 μl 98% एच 2 हे, 2% acetonitrile, 0.15% चींटी एसिड में resuspend।
  19. Sonicate 20 सेकंड (पल्स चक्र 0.5, आयाम 100%; माल की सूची देखें) और 5 सेकंड, 12,000 आरपीएम (benchtop अपकेंद्रित्र) नीचे स्पिन। भंवर 10 सेकंड, और 5 सेकंड, 12,000 आरपीएम नीचे स्पिन। नियंत्रण रेखा-एमएस / एमएस विश्लेषण के लिए एक एचपीएलसी शीशी में स्थानांतरण।
  20. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर।
    नोट: नमूने इस चरण में -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है।

8. नियंत्रण रेखा-एमएस / एमएस विश्लेषण

  1. एक नैनो नियंत्रण रेखा भागो (नैनो नियंत्रण रेखा सिस्टम) equippएक आरपी-एचपीएलसी स्तंभ (75 माइक्रोन एक्स 37 सेमी) C18 राल के साथ पैक के साथ एड (जादू C18 ए क्यू 3 माइक्रोन) 95% विलायक ए (0.15% चींटी एसिड, 2% acetonitrile) और 5% विलायक बी से एक रेखीय ढाल का उपयोग कर ( 0.2 μl / मिनट की एक प्रवाह दर पर 60 मिनट से अधिक 35% विलायक बी करने के लिए 98% acetonitrile, 0.15% चींटी एसिड)।
  2. (एक electrospray आयन स्रोत से जुड़ा दोहरे दबाव LTQ-Orbitrap Velos मास स्पेक्ट्रोमीटर,) नियंत्रण रेखा-एमएस / एमएस का उपयोग कर पेप्टाइड्स का विश्लेषण करें।
    नोट: डाटा अधिग्रहण मोड एमएस 20 सबसे तीव्र आयनों के रैखिक आयन जाल में एमएस / एमएस स्कैन द्वारा पीछा 60,000 FWHM के एक प्रस्ताव पर मास स्पेक्ट्रोमीटर की एफटी भाग में स्कैन एक उच्च संकल्प प्राप्त करने के लिए स्थापित किया गया था। एमएस / एमएस के प्रयास की दक्षता बढ़ाने के लिए, आरोप लगाया कि राज्य स्क्रीनिंग ढंग असाइन नहीं की गई बाहर करने के लिए सक्षम है और अकेले आयनों के आरोपों की गई थी। अग्रदूत 100 आयन मायने रखता पार हो गई जब मिलीभगत प्रेरित हदबंदी शुरू हो गया था। गतिशील अपवर्जन अवधि 30 सेकंड के लिए स्थापित किया गया था। आयन संचय समय 300 मिसे (एमएस) और 50 के लिए स्थापित किया गया थामिसे (एमएस / एमएस)।

9. डेटाबेस खोज

  1. पी डाउनलोड aeruginosa एन सी बी आई-डेटाबेस एन सी बी आई होमपेज के माध्यम से ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ )।
  2. MassMatrix रूपांतरण उपकरण (का उपयोग शुभंकर सामान्य फाइलों में एमएस कच्चे स्पेक्ट्रा (MGF) कन्वर्ट http://www.massmatrix.net/mm-cgi/downloads.py )।
  3. पी के खिलाफ शुभंकर संस्करण 2.3 का उपयोग कर इस एमजीएफ फ़ाइल खोज आगे युक्त और रिवर्स फंदा प्रोटीन प्रविष्टियों aeruginosa एन सी बी आई-डेटाबेस।
  4. दो पूरी तरह से tryptic पेप्टाइड्स में चोली याद किया सहन (प्रोलाइन द्वारा पीछा किया जब तक) लाइसिन और arginine के बाद सिलिको ट्रिप्सिन पाचन में एक प्रदर्शन करना।
  5. चर संशोधनों और तय संशोधन के रूप में सिस्टीन अवशेषों की carboxyamidomethylation (+57.021464 दा) के रूप में ऑक्सीकरण methionines (१५.९९,४९१ डीए) की अनुमति देने के लिए डेटाबेस खोज मापदंडों सेट करें। शुभंकर हमें खोजों के लिएउच्च संकल्प स्कैन आईएनजी, 15 पीपीएम के अग्रदूत बड़े पैमाने पर सहिष्णुता की स्थापना की और दा 0.6 टुकड़ा बड़े पैमाने पर सहिष्णुता की स्थापना की। अंत में, 1% प्रोटीन एफडीआर निर्धारित किया है।
  6. पी के शुभंकर खोजों आयात करें पाड़ (Proteomesoftware, संस्करण 3) में aeruginosa CCMS प्रयोगों, 1% करने के लिए एक प्रोटीन एफडीआर करीब प्राप्त है, और कुल वर्णक्रमीय मायने रखता है निकालने के लिए मानकों सेट।
  7. प्रतिनिधि परिणाम इस अखबार में प्रस्तुत करने के लिए, हम प्रतियोगिता के नियंत्रण के साथ प्रयोग तुलना करने के लिए एक बनती टी परीक्षण का इस्तेमाल किया है, और केवल 0.1 नीचे एक पी मूल्य, और 2 (वर्णक्रमीय मायने रखता प्रयोग / प्रतियोगिता नियंत्रण वर्णक्रम के ऊपर एक वर्णक्रमीय गिनती अनुपात के साथ हिट माना मायने रखता है)।
  8. डाटा आगे के विश्लेषण के लिए किसी भी स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर में निर्यात किया जा सकता है।

10 लेबल मुक्त मात्रा

  1. Progenesis नियंत्रण रेखा एमएस सॉफ्टवेयर (Nonlinear गतिशीलता, संस्करण 4.0) में कच्चे फ़ाइलों को आयात करें।
  2. डिफ़ॉल्ट setti में नियंत्रण रेखा एमएस संरेखण और सुविधा का पता लगाने सम्पन्नNGS।
  3. Progenesis नियंत्रण रेखा-एमएस से एमजीएफ स्वरूप में डेटा निर्यात करें।
  4. एन सी बी आई पी खिलाफ शुभंकर का उपयोग करते हुए एमएस / एमएस स्पेक्ट्रा खोजें आगे युक्त और रिवर्स फंदा प्रोटीन प्रविष्टियों aeruginosa डेटाबेस।
  5. Progenesis नियंत्रण रेखा-एमएस में डेटाबेस खोज परिणामों आयात और MS1 सुविधाओं के लिए पेप्टाइड्स पहचान नक्शा।
  6. (: 0.1 नीचे क्यू मूल्य, 2 से ऊपर वर्णक्रमीय गिनती अनुपात दहलीज) के आंकड़ों के मूल्यांकन (महत्व के स्तर की गणना, गुना परिवर्तन अनुपात) के लिए SafeQuant की ProteinSQAnalysis स्क्रिप्ट का इस्तेमाल किया गया था।

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Representative Results

पी में उपन्यास सी-डि-जीएमपी प्रभावोत्पादक की पहचान करने के लिए aeruginosa हम व्यवस्थित पी के घुलनशील और झिल्ली अंशों का विश्लेषण करने के CCMS इस्तेमाल किया एक लॉग चरण संस्कृति से aeruginosa तनाव PAO1 (= 0.5 आयुध डिपो 600)। यहाँ हम संक्षेप में प्रस्तुत करना है और इस मछली पकड़ने के अभियान के प्रतिनिधि परिणामों पर चर्चा की। चार स्वतंत्र जैविक प्रतिकृतियां इस्तेमाल किया गया। एक प्रयोग के लिए दो अलग अलग CDG-सीसी सांद्रता (5 माइक्रोन और 10 माइक्रोन) का इस्तेमाल किया गया था। विशिष्टता के लिए जांच करने के लिए, प्रयोगों (तालिका 1) (यानी CDG-सीसी) के बिना एक मनका नियंत्रण के साथ, अंत में 1 मिमी प्रतियोगी के रूप में सी-डि-जीएमपी और, की उपस्थिति या अनुपस्थिति में किए गए थे।

(चित्रा 2) के ऊपर विस्तार से वर्णित विधि निम्नलिखित जब हम एक पाड़ प्रारूप में कब्जा प्रोटीन की एक सूची का उत्पादन किया। संभावना contaminants को हटा दिया गया। इस राइबोसोमल प्रोटीन, streptavidin, ट्रिप्सिन, सीरम albumin, केरातिन और अन्य मानव प्रोटीन शामिल थे। प्रोटीनपहचान झूठे खोज की दर (एफडीआर) पाड़ सॉफ्टवेयर का उपयोग करके 1% करने के लिए स्थापित किया गया था, और डेटा उत्कृष्टता प्राप्त करने के लिए निर्यात किया। पाड़ द्वारा प्रदान की परिग्रहण संख्या एक्सेल में VLOOKUP समारोह का उपयोग ठिकाना संख्या में परिवर्तित किया जा सकता पी की एक सूची से जुड़ा हुआ aeruginosa ठिकाना संख्या। इस स्तर पर, हिट लिस्ट में घुलनशील अंश के लिए 768 प्रोटीन और झिल्ली अंश के लिए 433 प्रोटीन शामिल हैं। हालांकि, ज्यादातर प्रोटीन काफी कब्जा प्रयोग में समृद्ध नहीं कर रहे हैं। इस प्रकार, संभावना गैर-विशेष रूप से कब्जा कर रहे हैं कि प्रोटीन (मनका नियंत्रण में सकारात्मक या केवल सी-डि-जीएमपी प्रतियोगी की उपस्थिति में) हटा दिया गया। हम दो से बड़ा अनुपात के साथ कब्जा प्रयोग और प्रतियोगिता नियंत्रण और केवल माना प्रोटीन के बीच एक वर्णक्रमीय गिनती अनुपात की गणना की। इसके अलावा हम पर कब्जा प्रयोग और प्रतियोगिता नियंत्रण के बीच एक महत्व उपाय प्रदान करते हैं, और 0.1 का एक अनुमोदक सीमा निर्धारित करने के लिए वर्णक्रमीय मोर्चों पर एक बनती टी परीक्षण कार्यरत हैं। अन्त में, हम पूरी तरह से लिया 2 कब्जा यौगिक सांद्रता के लिए चार प्रयोगों में पहचान की कम से कम चार पेप्टाइड्स के साथ ही मजबूत हिट माना जाता है। इन मानदंडों को जरूरत के अनुसार और सत्यापित का उपयोग कर समायोजित और सी-डि-जीएमपी सीमा निर्धारित करने के लिए मानक के रूप में प्रोटीन बाध्यकारी भविष्यवाणी की जानी चाहिए। छँटाई करने के बाद, इस सूची में घुलनशील अंश के लिए 76 मारता है, और झिल्ली अंश के लिए 133 प्रोटीन के लिए कम था। यह घुलनशील 13 और पी से 21 झिल्ली प्रोटीन शामिल ज्ञात या सी-डि-जीएमपी (तालिका 2) बाइंड करने के लिए भविष्यवाणी कर रहे हैं कि aeruginosa। अन्य घुलनशील 63 और 112 झिल्ली प्रोटीन जाना जाता सी-डि-जीएमपी बाध्यकारी डोमेन में से एक को नियंत्रित नहीं है कि नई ख्यात सी-डि-जीएमपी बाध्यकारी प्रोटीन होते हैं। ये हिट उनकी विशिष्ट सी-डि-जीएमपी के लिए बाध्य परीक्षण द्वारा मान्य किया जा करने के लिए अब है।

पिछले एक स्क्रीन में हम GlyA2 (PA2444), GlyA3 (PA4602) और Gsp69 (PA1127) 1 निकाला। इन 3 प्रोटीन, क्लोन overexpressed, और से शुद्ध गयाई कोलाई और 33 पी का प्रयोग यूवी जोड़ने पार प्रयोगों में सी-डि-जीएमपी बाध्य करने के लिए मान्य किया जा सकता है सी-डि-जीएमपी 15 लेबल। कश्मीर डी एस वास्तव में उपन्यास प्रभावोत्पादक CCMS का उपयोग करके पहचाना जा सकता है यह दर्शाता है कि क्रमश: 1.0, 2.0 और 6.9 माइक्रोन के लिए निर्धारित किया गया है।

इस प्रतिनिधि उदाहरण के लिए इसके अलावा, हम अलग अलग विकास की स्थिति से काटा कोशिकाओं के निष्कर्षों के साथ और विभिन्न इंट्रासेल्युलर सी-डि-जीएमपी सांद्रता (एन = 24) के साथ CCMS इस्तेमाल किया। कुल मिलाकर हम जानते हैं की 74% (38/51) पर कब्जा कर लिया या पी की भविष्यवाणी की aeruginosa PAO1 सी-डि-जीएमपी संकेत घटकों (24/32 घुलनशील प्रोटीन, 14/19 झिल्ली प्रोटीन)। इन जीनों में से कम से कम नौ विशेष परिस्थितियों (oxidative तनाव, कोरम संवेदन, biofilms) 16 के तहत लिखित होना दिखाया गया है कि यह देखते हुए और कुछ बिल्कुल सी-डि-जीएमपी बाध्य नहीं कर सकता है कि, कवरेज के इस डिग्री संतृप्ति के करीब हो सकता है। एक साथ अवलोकन के साथ यह है कि डब्ल्यू इन घटकों के सबसेअरे उच्च विशिष्टता (तालिका 2) के साथ कब्जा कर लिया दृढ़ता से इस तकनीक को प्रभावी और शक्तिशाली है कि तर्क है।

चित्र 1
चित्रा 1: सी-डि-जीएमपी कैद यौगिक की रासायनिक संरचना।

चित्र 2
चित्रा 2:। CCMS कार्यप्रवाह सारांश मैकेनिकल सेल के बाद मुक्त न्यूक्लियोटाइड एक PD10 बहिष्कार स्तंभ का उपयोग कर हटा रहे हैं। घुलनशील या झिल्ली अंशों से प्रोटीन CDG-सीसी के साथ incubated हैं और मिश्रण पार से लिंक पर कब्जा कर लिया प्रोटीन के लिए यूवी विकिरण के संपर्क में है। कठोर धोने के कदम लेपित चुंबकीय मोतियों streptavidin करने के लिए बाध्य यौगिकों के साथ किया जाता है। पर मनका tryptic पाचन पेप्टाइड्स प्रदान करता है,फिर मोती से अलग कर दिया और उनके मास स्पेक्ट्रोमेट्री की पहचान के लिए protonated जो कर रहे हैं। आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: पी के Volcanoplots aeruginosa प्रोटीन काफी CCMS से समृद्ध। पाठ में वर्णित के रूप में नियंत्रण रेखा-एमएस / एमएस विश्लेषण और लेबल से मुक्त मात्रा का ठहराव के बाद, प्रोटीन हल किया गया। कब्जा है और प्रतियोगिता के प्रयोगों के बीच पाया पेप्टाइड की log2 तीव्रता अनुपात की गणना और महत्व विश्लेषण (संशोधित टी चलता है, अनुभवजन्य Bayes विधि 17) से प्राप्त मान बनाम साजिश रची थे। पी-मूल्यों <0.05 और तीव्रता अनुपात> के लिए महत्व थ्रेसहोल्ड के भीतर प्रोटीन 1.5 गुना indicat हैंएक ग्रे बॉक्स में एड। 4 घुलनशील अंश (ए) और झिल्ली अंश (बी) 10 माइक्रोन सी-डि-जीएमपी-सीसी की उपस्थिति में प्रदर्शन किया गया है, और 1 मिमी सी-डि-जीएमपी के साथ प्रतियोगिता के प्रयोग के लिए replicates। परिक्रमा डॉट्स जाना जाता सी-डि-जीएमपी बंधनकारी प्रोटीन के अनुरूप हैं। आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

कब्जा: बफर रासायनिक स्रोत कंसंट्रेशन
बैक्टीरियल lysis बफर 10x एमईएस सिग्मा 67 मिमी
पीएच 7.5 HEPES सिग्मा 67 मिमी
NaCl मुझसेRCK 2 एम
ना एसीटेट मर्क 67 मिमी
डीटीटी Fluka 10 मिमी
DNaseI रॉश 20 यू / मिलीलीटर
पूरा protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल रॉश एक टैब / 10 मिलीलीटर
बफर 5x पर कब्जा HEPES सिग्मा 100 मिमी
KAC सिग्मा 250 मिमी
MgAc (निर्जल) सिग्मा 50 मिमी
ग्लिसरॉल सिग्मा 50% (v / v)
सकल घरेलू उत्पाद, जीटीपी, एटीपी, CTP सिग्मा 1 मिमी प्रत्येक धो बफर 5x Tris-एचसीएल मर्क 1 एम
(घुलनशील अंश के लिए) EDTA सिग्मा 0.5 एम
पीएच 7.5 NaCl सिग्मा 5 एम
एन octyl-β-डी-glucopyranoside Anagrade (Affymetrix) 42.5 माइक्रोन
धो बफर 5x Tris-एचसीएल मर्क 1 एम
(झिल्ली अंश के लिए) EDTA सिग्मा 0.5 एम
पीएच 7.5 NaCl सिग्मा 5 एम
अन्य रसायन: अमोनियम बिकारबोनिट (एबीसी) Fluka
यूरिया Applichem
एमएस नमूना तैयार: बफर रासायनिक स्रोत कंसंट्रेशन
C18 बफर TFA प्रवेश करना 0.1% (v / v)
एच 2 ओ एचपीएलसी ग्रेड 99.9% (v / v)
C18 बफर बी TFA प्रवेश करना 0.1% (v / v)
Acetonitrile Biosolve 49.9% (v / v)
एच 2 ओ एचपीएलसी ग्रेड 50% (v / v)
C18 बफरसी TFA प्रवेश करना 0.1% (v / v)
Acetonitrile Biosolve 5% (v / v)
एच 2 ओ एचपीएलसी ग्रेड 94.9% (v / v)
नियंत्रण रेखा बफर चींटी का तेजाब सिग्मा 0.15% (v / v)
Acetonitrile Biosolve 2%
एच 2 ओ एचपीएलसी ग्रेड 97.85%
अन्य रसायन: Tris (2 carboxyethyl) phosphine (TCEP) सिग्मा
iodoacetamide (आई ए ए) सिग्मा
एन -acetyl-सिस्टीन सिग्मा
Endoproteinase लिस-सी मदद
Trypsin Promega

तालिका 1:। बफ़र्स रचना, रसायन और आपूर्तिकर्ताओं की रचना सारांश buffers। सी-डि-जीएमपी कब्जा यौगिक (प्रतियोगिता नियंत्रण के लिए) सी-डि-जीएमपी, streptavidin लेपित चुंबकीय मोती, कब्जा बफर, और वाशिंग बफर caproKit में शामिल किए गए हैं।

मनका नियंत्रण कैद प्रयोग प्रतियोगिता नियंत्रण
प्रोटीन निकालने (10 मिलीग्राम / एमएल) 30 μl 30 μl 30 μl
सी-डि-जीएमपी (10 मिमी) 0 μl 0 μl 10 μl
न्यूक्लियोटाइड (प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड की 10 मिमी) 10 μl 10 μl 10 μl
कब्जा बफर 5x 20 μl 20 μl 20 μl
एच 2 42 μl 32 μl 22 μl
30 मिनट ऊष्मायन
सी-डि-जीएमपी ~ सीसी (शेयर 100 माइक्रोन) 0 μl 5-10 μl 5-10 μl
अंतिम सांद्रता: मनका नियंत्रण कैद प्रयोग प्रतियोगिता नियंत्रण
सी-डि-जीएमपी ~ सीसी (माइक्रोन) 0 माइक्रोन 5-10 माइक्रोन 5-10 माइक्रोन
प्रतियोगी सी-डि-जीएमपी (माइक्रोन) 0 माइक्रोन 0 माइक्रोन 1000 माइक्रोन

तालिका 2:। मनका नियंत्रण के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण की कैद प्रतिक्रिया मिश्रण सारांश (यानी कब्जा यौगिक के बिना) (सी-डि-जीएमपी-सीसी के साथ), कब्जा प्रयोग, और सी की एक बड़ी अतिरिक्त होता है जो प्रतियोगिता नियंत्रण डि-जीएमपी। सी-डि-जीएमपी-सीसी अंतिम एकाग्रता समायोजित किया जा सकता है, और आमतौर पर 5 और 10 माइक्रोन के बीच निर्धारित है।

प्रोटीन का नाम लोकस आईडी डोमेन वास्तुकला कब्जा प्रयोग / प्रतियोगिता प्रयोग 1
क) घुलनशील अंश CDG-सीसी = 5 माइक्रोन CDG-सीसी = 10 माइक्रोन
- PA4843 आरईसी आरईसी-GGEEF * 14/0 14/0 13/0 11/0 14/0 12/0 14/0 14/0
WspR PA3702 आरईसी-GGEEF * 9/0 9/0 10/0 9/0 11/0 10/0 11/0 11/0
- PA2567 GAF-SPTRF-EAL 8/0 4/0 9/0 0/0 7/0 3/0 8/0 8/0
- PA3353 PILZ 11/0 12/0 13/0 12/0 12/0 10/0 11/0 12/0
- PA0290 पीए-GGDEF 5/0 </ टीडी> 3/0 6/0 5/0 8/0 5/0 6/0 6/0
- PA5295 GDDEF-EAL 3/0 3/0 3/0 1/0 6/0 6/0 5/0 4/0
FimX PA4959 पीए-GDSIF-EVL 23/1 21/0 21/0 11/0 24/3 23/2 22/0 20/0
- PA4608 PILZ 3/0 3/0 3/0 0/0 3/0 2/0 3/0 3/0
- PA0012 PILZ 3/0 2/0 2/0 2/0 2/0 2/0 4/0 2/0
- PA2989 PILZ 1/0 2/0 1/0 1/0 2/0 3/0 3/0
- PA4324 PILZ 2/0 2/0 1/0 1/0 2/0 2/0 1/0 2/0
- PA3177 GGEEF 2/0 1/0 3/0 0/0 1/0 1/0 3/0 1/0
- PA4396 आरईसी-DEQHF 0/0 1/0 4/0 0/0 1/0 0/0 5/0 1/0
- PA0169 GGEEF * 3/0 2/0 6/0 7/0 7/1 6/2 9/1 7/1
- PA2799 PILZ 1/0 0/0 2/0 0/0 0/0 0/0 3/0 1/0
- PA5017 पीए-GAF-पीए-ASNEF-EAL 1/0 2/0 1/0 0/0 1/0 3/2 0/0 0/0
- PA5487 GGEEF * 0/0 0/0 0/0 1/0 1/0 0/0 1/0 1/0
ख) झिल्ली अंश CDG-सीसी = 5 माइक्रोन CDG-सीसी = 10 माइक्रोन
- PA2072 CHASE4-टीएम-पीए-GGDEF-EAL 13/1 25/0 27/0 19/0 36/0 36/0 31/0 23/0
- PA0861 टीएम-पीए-GGDEF-पक्ष 6/1 14/0 13/0 10/0 17/0 18/0 13/0 8/0
- PA3353 PILZ 6/0 10/0 9/0 7/0 10/0 10/0 6/0 5/0
- PA3343 5TM-GGDEF 3/0 7/0 7/0 4/0 12/0 10/0 7/0 7/0
- PA1181 MASE1-पीए-पीए-पीए-पीए-GGDEF-पक्ष 3/0 6/0 9/0 3/0 12/0 12/0 5/0 2/0
- PA0847 टीएम-CHASE4-HAMP-पीए-GGDEF 0/0 4/0 4/0 1/0 15/0 13/0 8/0 6/0
- PA0575 PBPb-टीएम-पीए-पीए-पीए-PAS-GGDEF-EAL 1/0 7/0 6/0 3/0 10/0 10/0 6/0 2/0
yfiN PA1120 2TM-HAMP-GGDEF 2/0 4/0 3/0 3/0 5/0 4/0 3/0 1/0
- PA0290 पीए-GGDEF 1/0 4/0 3/0 2/0 1/0 5/0 1/0 2/0
- PA4929 7TMR: DISMED2-7TMR: DISMED2-GGDEF 2/0 4/0 2/0 2/0 2/0 2/0 2/0 1/0
मोरा PA4601 टीएम-टीएम-पीए-पीए-पीए-पीए-GGDEF-EAL 3/0 7/0 7/3 5/0 9/0 10/0 5/0 4/0
- PA1851 5TM-GGDEF 1/0 2/0 1/0 2/0 4/0 3/0 1/0 1/0
- PA2870 टीएम-GGDEF 0/0 0/0 1/0 0/0 4/0 4/0 4/0 2/0
- PA3311 टीएम-MHYT-MHYT-MHYT-AGDEF-EAL 1/1 5/0 7/1 4/0 8/0 8/0 5/1 3/0
Bifa PA4367 टीएम-GGDQF-EAL 1/0 2/0 1/0 2/0 1/0 2/0 2/1 1/0
- PA4608 PILZ 0/0 1/0 1/0 0/0 3/0 3/0 2/0 2/0
- PA4332 5TM-GGEEF 1/0 3/0 2/0 1/0 1/0 1/0 2/0 0/0
- PA0012 PILZ 1/0 1/0 1/0 1/0 1/0 1/0 1/0 0/0
- PA2989 PILZ 4/0 8/0 7/0 7/0 5/2 11/2 7/2 8/3
- PA1433 HAMP-RGGEF-KVL 0/0 0/0 0/0 0/0 1/0 1/0 1/0 1/0
- PA4843 आरईसी आरईसी-GGEEF 0/0 0/0 1/1 1/0 0/0 1/0 1/0 0/0 * = GGDEF डोमेन एक मैं इस साइट से युक्त
पहचान पेप्टाइड्स के वर्णक्रमीय गिनती के एक नंबर

तालिका 3: पी पाठ में वर्णित के रूप में विशेष रूप से कब्जा कर लिया घटकों संकेत aeruginosa जाना जाता सी-डि-जीएमपी। पहचान प्रोटीन पहले हल किया गया। प्रोटीन उनके नाम और ठिकाना नंबर के लिए साथ की पहचान की है, और हम उनके वास्तुकला कब्जा विशिष्टता और reproducibility दिखाने के क्रम में (एन = 4, CDG-सीसी = 5 माइक्रोन या 10 माइक्रोन) एन सी बी आई संरक्षित डोमेन डेटाबेस ऑनलाइन उपकरण के साथ की भविष्यवाणी का संकेत कर रहे हैं विधि की।

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Discussion

विशेष देखभाल प्रोटोकॉल के कई चरणों में लिया जाना चाहिए। प्रोटीन एकाग्रता 10 मिलीग्राम की एक एकाग्रता के साथ एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है / एमएल कोशिकाओं विशिष्ट विकास की स्थिति (जैसे biofilms या छोटे कॉलोनी वेरिएंट) के तहत बड़े हो रहे हैं जब तक पहुँचने के लिए मुश्किल हो रहा है। इस प्रकार, गोली मेजबान lysis बफर के एक कम मात्रा में किया जाना चाहिए। प्रोटीन सांद्रता 8 मिलीग्राम / मिलीलीटर तक की कमी की जा सकती है। Nesper एट अल। एक द्वारा प्रकाशित विधि की तुलना में, हम न्यूक्लियोटाइड बंधनकारी प्रोटीन की गैर विशिष्ट कैप्चरिंग को कम से कम करने के लिए कब्जा प्रतिक्रिया करने के लिए विभिन्न न्यूक्लियोटाइड गयी। न्यूक्लियोटाइड के अलावा विशिष्टता में सुधार हुआ है, यह एक ही समय में एक ही स्थल पर विभिन्न न्यूक्लियोटाइड कि बाँध प्रोटीन का कब्जा रोक सकता है। उदाहरण के लिए हाल ही में दिखाया गया था जो प्रेरक FleQ, एटीपी बाध्य करने के लिए और सी-डि-जीएमपी 18 डी में अब और हमारे पिछले प्रयोग एक में एटीपी के अभाव में विशेष रूप से निकाला, लेकिन नहीं किया गया थाअता एटीपी की एक अतिरिक्त की उपस्थिति में यहां प्रस्तुत किया।

CDG-सीसी ध्यान से प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए। परिवेश प्रकाश यूवी का केवल एक छोटा सा अंश होता है, यद्यपि यह एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटा कब्जा यौगिक स्टॉक है, साथ ही यूवी विकिरण द्वारा सक्रियण करने से पहले कब्जा मिश्रण रखने के लिए सिफारिश की है। का पालन करें कि धोने कदम पर कब्जा कर लिया प्रोटीन covalently CDG-सीसी के लिए बाध्य कर रहे हैं, के रूप में विशिष्टता को बढ़ाने के लिए बहुत कठोर हो सकता है। नियंत्रण रेखा-एमएस / एमएस विश्लेषण के बारे में, प्रयोगों के लिए एक साफ केरातिन मुक्त वातावरण में किया जाना चाहिए। इसके अलावा, एचपीएलसी संगत बफ़र्स विशेष रूप से धोने कदम के बाद, इस्तेमाल किया जाना चाहिए। उम्मीदवार सूची आम तौर पर प्रतिकृति (एक उदाहरण के रूप में 2 टेबल देखें) के बीच कम बदलाव के साथ (एक चार प्रतियों के लिए) 300 और 800 के बीच प्रोटीन, शामिल हैं।

प्रोटीन और CDG-सीसी एकाग्रता जैसे कुछ मापदंडों एक जीवों के आधार पर अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती हैnalyzed। केवल विशेष परिस्थितियों में व्यक्त कम प्रचुर मात्रा में प्रोटीन या प्रोटीन को आसानी से याद किया जा सकता है, देखभाल कार्यरत संस्कृति की स्थिति के संबंध में लिया जाना चाहिए। यह समस्या एक ही संस्कृति की स्थिति के लिए एकत्र एक वैश्विक प्रोटीन एटलस के साथ हिट लिस्ट तुलना करके दूर किया जा सकता है। यह झिल्ली प्रोटीन solubilize करने की क्षमता के लिए सम्मान के साथ अनुकूलित किया जाना चाहिए और भी एमएस संगत की जरूरत के रूप में अंत में, डिटर्जेंट का अनुकूलन, चुनौतीपूर्ण हो सकता है।

एक यह पाड़ के आराम करने के लिए एक राइबोज़ की 2'OH समूह के माध्यम से जुड़ा हुआ है के रूप में सीसी की सी-डि-जीएमपी अणु रासायनिक, संशोधित किया गया है कि मन में रखने की जरूरत है। इस संशोधन जिससे झूठी नकारात्मक उपलब्ध कराने के कुछ प्रभावोत्पादक करने के लिए बाध्य करने के लिए अपनी क्षमता को बदल सकता है। इस संदर्भ में यह है कि हम एक EAL डोमेन बंदरगाह लेकिन पी में एक GGDEF डोमेन कमी है कि प्रोटीन पर कब्जा कर लिया है कि कभी उल्लेखनीय है aeruginosa, EAL प्रोटीन कोल की तरह, अन्य प्रजातियों में कब्जा कर लिया गया है, हालांकिobacter crescentus। यह एक गरीब का उपयोग या बाध्यकारी साइट के लिए, या EAL प्रोटीन द्वारा CDG-सीसी का क्षरण करने के लिए CDG-सीसी के एक कम आत्मीयता के कारण हो सकता है। इसके विपरीत, कई न्यूक्लियोटाइड बाध्यकारी प्रोटीन एक बड़ी हद तक, शायद झूठी सकारात्मक हैं, एक अपेक्षाकृत कम विशिष्टता के साथ कब्जा कर लिया और कर रहे थे। ऐसे DRaCALA 20 के रूप में तकनीक का उपयोग करते हुए सी-डि-जीएमपी के लिए बाध्य विशिष्ट के आगे मान्यता, यूवी 15 पार से जोड़ने की स्कैनिंग अंतर fluorimetry (DSF) 21, microscale thermophoresis (मासिक सीजन टिकट) 22, इज़ोटेर्माल उष्मामिति (आईटीसी) 23-24 है ... इस प्रकार आवश्यक।

यह कब्जा परिसर के सी-डि-जीएमपी आधा भाग का एक अंश सेल lysate से phosphodiesterases द्वारा अपमानित किया जाता है कि यह भी संभव है। यह इसलिए पार से जोड़ने पहले phosphodiesterases गतिविधि को सीमित करने, प्रक्रिया 4 डिग्री सेल्सियस पर बाहर किया जाना है क्यों कारणों में से एक है।

proceduफिर से कई बैक्टीरियल प्रजातियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, और सफलतापूर्वक बहुत मामूली संशोधनों के एक साथ 3 अलग बैक्टीरियल प्रजातियों के लिए इस्तेमाल किया गया है। कैद यौगिक आधारित तकनीक पूरी तरह से धोने का उपयोग करके झूठी सकारात्मक कम कर सकते हैं (उदाहरण के लिए 1 एम नमक, उच्च डिटर्जेंट एकाग्रता, झिल्ली प्रोटीन, 80% acetonitrile के मामले में 2 एम यूरिया) सहसंयोजक बंधन पर भरोसा नहीं है कि अन्य तकनीकों की तुलना में,। उम्मीदवारों के सत्यापन के लिए एक कठिन और समय लेने वाली प्रक्रिया हो सकती है यह देखते हुए कि, इस आधार पर रासायनिक प्रोटिओमिक्स जैसे वैकल्पिक तरीकों के लिए एक प्रमुख लाभ 14 दृष्टिकोण है।

इस सचित्र वीडियो विधि की पहचान करने और छोटे अणु संकेतन में शामिल उपन्यास घटकों को चिह्नित करने के लिए एक शक्तिशाली और बहुमुखी उपकरण के रूप में CCMS स्थापित करता है। भविष्य में, अन्य चयनात्मकता समूहों को शरण देने के समान कैद यौगिकों ऐसे उपन्यास सी-डि-एएमपी प्रभावोत्पादक के रूप में छोटे अणु संकेतन में शामिल प्रोटीन, कब्जा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
caproBox caprotec bioanalytics 1-5010-001 (220 V) UV lamps coupled to a cooling 96-plate cooling block, for the photoactivation
caproMag caprotec bioanalytics included in the CCMS Starter Kit For easy handling of magnetic particles without pipetting
c-di-GMP caproKit caprotec bioanalytics upon request The kit contains the c-di-GMP-capture compound, c-di-GMP (for the competition control), streptavidin coated magnetic beads, capture buffer, and washing buffer
Disposable PD-10 Desalting Columns GE Healthcare 17-0851-01 
12-tube PCR strips Thermo Scientific AB-1114
UIS250v sonicator with VialTweeter Hielscher ultrasound technology UIS250v and VialTweeter
Miniature French Pressure Cell Thermo Electron Corporation FA-003

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References

  1. Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins. J Proteomics. 75, 4874-4878 (2012).
  2. Hengge, R. Principles of c-di-GMP signalling in bacteria. Nature reviews. Microbiology. 7, 263-273 (2009).
  3. Sondermann, H., Shikuma, N. J., Yildiz, F. H. You've come a long way: c-di-GMP signaling. Curr. Opin. Microbiol. 15, 140-146 (2012).
  4. Schirmer, T., Jenal, U. Structural and mechanistic determinants of c-di-GMP signalling. Nature reviews. Microbiology. 7, 724-735 (2009).
  5. Furukawa, S., Kuchma, S., O'Toole, G. Keeping their options open: acute versus persistent infections. J. Bacteriol. 188, 1211-1217 (2006).
  6. Christen, M., Christen, B., Folcher, M., Schauerte, A., Jenal, U. Identification and characterization of a cyclic di-GMP-specific phosphodiesterase and its allosteric control by GTP. J. Biol. Chem. 280, 30829-30837 (2005).
  7. Ryan, R. P., Fouhy, Y., Lucey, J. F., Dow, J. M. Cyclic di-GMP signaling in bacteria: recent advances and new puzzles. J. Bacteriol. 188, 8327-8334 (2006).
  8. Habazettl, J., Allan, M. G., Jenal, U., Grzesiek, S. Solution structure of the PilZ domain protein PA4608 complex with cyclic di-GMP identifies charge clustering as molecular readout. J. Biol. Chem. 286, 14304-14314 (2011).
  9. Fazli, M., et al. The CRP/FNR family protein Bcam1349 is a c-di-GMP effector that regulates biofilm formation in the respiratory pathogen Burkholderia cenocepacia. Molecular Microbiology. 82, 327-341 (2011).
  10. Hickman, J. W., Harwood, C. S. Identification of FleQ from Pseudomonas aeruginosa as a c-di-GMP-responsive transcription factor. Molecular Microbiology. 69, 376-389 (2008).
  11. Sudarsan, N., et al. Riboswitches in eubacteria sense the second messenger cyclic di-GMP. Science. 321, 411-413 (2008).
  12. Lenz, T., et al. Profiling of methyltransferases and other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS). J Vis Exp. (2010).
  13. Köster, H., et al. Capture compound mass spectrometry: a technology for the investigation of small molecule protein interactions. Assay Drug Dev Technol. 5, 381-390 (2007).
  14. Düvel, J., et al. A chemical proteomics approach to identify c-di-GMP binding proteins in Pseudomonas aeruginosa. Journal of Microbiological Methods. 88, 229-236 (2012).
  15. Christen, B., et al. Allosteric control of cyclic di-GMP signaling. J. Biol. Chem. 281, 32015-32024 (2006).
  16. Balasubramanian, D., Mathee, K. Comparative transcriptome analyses of Pseudomonas aeruginosa. Human genomics. 3, 349-361 (2009).
  17. Smyth, G. K. Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments. Stat Appl Genet Mol Biol. 3, (3), (2004).
  18. Baraquet, C., Harwood, C. S. Cyclic diguanosine monophosphate represses bacterial flagella synthesis by interacting with the Walker A motif of the enhancer-binding protein FleQ. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18478-18483 (2013).
  19. Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins. J Proteomics. 75, 4874-4878 (2012).
  20. Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15528-15533 (2011).
  21. DeSantis, K., Reed, A., Rahhal, R., Reinking, J. Use of differential scanning fluorimetry as a high-throughput assay to identify nuclear receptor ligands. Nuclear receptor signaling. 10, e002 (2012).
  22. Seidel, S. A., et al. Microscale thermophoresis quantifies biomolecular interactions under previously challenging conditions. Methods. 59, 301-315 (2013).
  23. Merighi, M., Lee, V. T., Hyodo, M., Hayakawa, Y., Lory, S. The second messenger bis-(3‘-5’)-cyclic-GMP and its PilZ domain-containing receptor Alg44 are required for alginate biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 65, 876-895 (2007).
  24. Qi, Y., et al. Binding of cyclic diguanylate in the non-catalytic EAL domain of FimX induces a long-range conformational change. J. Biol. Chem. 286, 2910-2917 (2011).

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