分析单个人类胚胎干细胞通过定量RT-PCR

Biology

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Summary

单细胞基因表达分析是需要了解干细胞的异质性。

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Lim, H., Choi, I. Y., Lee, G. Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR. J. Vis. Exp. (87), e51408, doi:10.3791/51408 (2014).

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Abstract

干细胞群的异质性阻碍了干细胞生物学的详细了解,如他们的分化倾向朝着不同的谱系。单细胞转录组分析可以为解剖的个体差异的新方法。我们已经开发了单细胞定量RT-PCR法,并证实了该方法在几个基因表达谱效果很好。在单细胞水平上,每一个人类胚胎干细胞,按OCT4 :: EGFP阳性细胞,具有较高的表达OCT4,但不同级别NANOG的表达。我们的单细胞基因表达分析应该是有用的审问人口异质性。

Introduction

大多数高等真核生物的人群是异质从而汇集与人口分析,它往往是难以解释其细胞的功能。在一个人口单个细胞可能是细微的差别,而这些差别能有重要影响整个人群1,2的特性和功能。特别是,人胚胎干细胞(胚胎干细胞)被称为是异质的,这会导致不同程度的多能性和多样化的电位,以微妙独特的方式3,4谱系规范。例如,不同的细胞表面抗原,可用于分类的未分化的多能干细胞,5和奥斯汀史密斯组建议在小鼠胚胎干细胞不同级别的多能性,根据其形态,分化倾向和信号转导通路6的依赖性。这种现象被推测在人类胚胎NIC干细胞7。而整体的研究,不同的干细胞系,而不是单个单个干细胞中进行的,它可能是非常有趣的,分析不同层次的多能性的在单细胞水平,这可能会影响其分化能力,向全体细胞谱系。

细胞和分子异质性可以通过转录分析来决定的,这就是所谓的“单细胞转录组”,并强调定量基因表达水平8-10新方法。用于在单个细胞的基因表达水平的分析,我们开发了单细胞定量RT-PCR的一个简单的,但健壮的协议。我们证实了我们的协议的有效性和可行性通过比较单个细胞裂解物各一半以及人类胚胎干细胞的连续稀释的总RNA,产生最小的技术的变化和差异。进一步,我们使用了遗传记者线隔离同质population利用基因打靶系统的人类胚胎干细胞。用于靶向OCT4基因座(OCT4-2A-EGFP-PGK-迪普 ​​罗构造)和一对TALEN质粒的供体载体被用来11。供体载体和一对TALEN质粒导入人类胚胎干细胞(H9,WA09)使用我们的核转染和克隆选择协议和维护人类胚胎干细胞是基于我们的日常协议12进行的。我们证实了这OCT4基因记者一行表达绿色荧光蛋白的表达OCT4 :: EGFP的胚胎干细胞。

我们的结果表明,个体的胚胎干细胞(排序OCT4 :: EGFP强阳性细胞)保持高水平的OCT4的表达,但不同层次的NANOG的表达。所以,我们的单细胞基因表达分析应该对学习多能干细胞的人口异质性是有用的。

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Protocol

一个96孔板的1。下游

  1. 混合1μL单细胞DNase1至9微升单细胞裂解液。
  2. 把10μl的混合溶液中的96孔PCR板各孔中。

2,拆卸人类胚胎干细胞的分离纯化流式细胞仪

  1. 从60毫米培养皿用1ml的Accutase 20分钟,在37℃,这是中和人ES介质分离OCT4 :: EGFP的胚胎干细胞系。
  2. 制备的细胞群体在1ml的FACS缓冲液和细胞调整至1×10 6细胞/ ml。
  3. 通过一个35微米的细胞过滤帽筒通过细胞样本。
  4. 细胞分选之前存储管冰。

的FACS纯化的单细胞在96孔平板的每个孔3。裂解

  1. 排序的样品用于在细胞分选器与受过训练的操作者的EGFP阳性细胞。把单细胞成单细胞Lysis/DNase1解决方案在96孔PCR板。如果有必要,96孔板与样本可以被存储在一个-80℃的冰柜少于一个月。
  2. 孵育样品5分钟,在室温下细胞裂解。
  3. 加入1μl终止液终止反应溶解。
  4. 孵育2分钟,在室温。

4,反转录

  1. 添加到20μm的SMA-T15,SMA-A中的每个0.5微升等分。
  2. 加4μl的5X缓冲液,2微升DTT,1μl的逆转录酶,和1μl的dNTP各孔中。
  3. 在热循环仪中进行反转录。
    1. 在42℃下将热节目×90分钟,灭活逆转录酶在85℃×5分钟。

5,扩增

  1. 加入4微升ExoSAP-IT试剂到每个反转录样品。
    1. 孵育的样品在37℃下15分钟,80℃15分钟以灭活ExoSAP-IT试剂。
  2. 准备PCR反应混合物瓦特第i个SMA-P2(2纳米)
  3. 加入10μlPCR反应混合物中各逆转录样品。
  4. 进行放大,由20个循环(94℃,30秒),退火(57℃,30秒),延伸(68℃,10分钟)。

6,实时定量RT-PCR检测性能

  1. 加10μl的2倍的SYBR Green PCR主要混合液,1微升扩增的cDNA,2 nM的引物,和7微升水的每个孔中。
    1. 设置程序随后95℃3秒,60℃30秒×40个循环。
  2. 执行一式两份的技术错误。

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Representative Results

高效率和强大的单细胞RNA扩增

为了尽量减少人类胚胎干细胞中的转录变化,我们使用的OCT4 :: EGFP的胚胎干细胞克隆流式细胞仪净化。 OCT4 :: EGFP阳性细胞分选入96孔板后,每个小区被裂解在裂解缓冲液中,并用SMA-T15(GACATGTATCCGGATGTTTTTTTTTTTTTTTT)引物和具有SMA-A(ACATGTATCCGGATGTGGG锚固转换的poly(A)+ RNA到cDNA全长)通过使用智能模板切换技术。多余的寡核苷酸消化ExoSAP-IT试剂,再其次是cDNA的PCR扩增带SMA-P2(GACATGTATCCGGATGT)13 18-20周期。我们所用的扩增的cDNA,以使该模板用于定量RT-PCR( 图1)。有几项研究对全长RNA测序和RNA变性的测量通过使用数量细胞的低和单个电池单元3,14,15。到O乌尔知识,我们人类胚胎干细胞稀释的总RNA(微克量)下降到纳米和微微克水平和应用我们的协议,以评估低量的总RNA差异的技术变化和检测。我们从稀释的RNA和单个细胞产生的基因表达水平确定的重现性。将稀释的RNA分析显示了串行相关各样品之间和定量RT-PCR结果与一些单细胞显示在GAPDH基因( 图2)相似的Ct值。

单细胞基因谱的定量评估

为了验证逆转录反应不同批次之间的一致性,我们分FACS纯化的单细胞裂解液成半,并分别应用于我们的协议,以裂解液各一半一批比较。我们的排序条件强EGFP阳性细胞用流式细胞仪分选器( 图3),所以OCT4的表达水平是高的EGFP阳性细胞,但NANOG的表达水平是不同的。结果表明单细胞裂解物各一半( 图4)OCT4 Ct值之间显著相关。

胚胎干细胞基因谱分析

我们整理个人胚胎干细胞,并利用我们的协议,这表明OCT4的表达水平一致分析了它们的基因表达水平,然后我们在人类胚胎干细胞检查另一个干细胞标记基因Nanog的 。其结果是,OCT4基因表达水平高的每一个细胞,但NANOG显示不同的图案( 图5)。

图1
图1:单人胚胎干细胞定量RT-PCR检测流式细胞仪纯化后的总体示意图。

图2
2。GAPDH的使用合并的人胚胎干细胞的连续稀释的mRNA的实时RT-PCR,每个点表示连续稀释mRNA的Ct值和单个细胞的mRNA排序通过FACS。总RNA稀释从10纳克/微升至0.1皮克/ UL。我们重复相同的实验进行比较,并提出线性关系。

图3
图3。十月阳性细胞的流式细胞仪分析 , 我们整理EGFP阳性细胞用流式细胞仪分选机。OCT4 :: EGFP报告人类胚胎干细胞线显示大约60%的EGFP阳性人口与人口负(B)进行比较。我们选择了强大的EGFP阳性细胞(A)。

图4
图4的比较中的单细胞裂解物各一半基因表达水平。要验证的逆转录和扩增反应的不同批次之间的一致性,我们将单细胞裂解物中的一半,并应用于我们的协议,用于批处理的比较。

图5
图5。60;通过FACS纯化的单人胚胎干细胞的基因表达的热图介绍单细胞基因表达分析显示强劲表达OCT4,但在Nanog的不同表达水平。

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Discussion

单细胞基因分析可能是一个主要的工具来预测一个单细胞的功能或整个人口。由于技术的限制,全基因谱分析已经被限制人口的平均水平。中的基因表达模式和个体的细胞和亚群之间的水平的变化已经被提出来引起错误的解释。这些不同的细胞方面可以在人类胚胎干细胞被发现和他们的异质性造成微妙的不同能力维持多能性和命运规范的过程。

我们开发并验证了单细胞定量RT-PCR方法,这对于在单个细胞的基因表达研究提供了简单,但强大的方法。为了验证我们的协议,FACS纯化的单细胞裂解物分成一半,并应用到该方法中用于检查的精确度。我们与单细胞的结果被证实与连续稀释的总RNA样品,我们发现一致的结果between细胞裂解物的各一半( 图4)。但是,与我们的协议,有一些限制。我们可以检测到过40个基因的表达水平,但特异性转录信息( 非多聚腺苷酸化的mRNA,miRNA的,未知的成绩单等),可能无法检测到。此外,还有一些机会,以优化引物对靶基因。公认的引物长度通常为18-22个碱基对。的引物的退火温度一般工作在50-60℃的范围。引物的GC含量可以受引物的退火的能力。在本文中,我们取出在定量PCR的退火步骤来降低引物退火的误差。我们仅表现为GAPDH基因作为对照,但其他持家基因可以作为一个控制是有用的。目前,我们正在优化我们的协议,用于RNA测序的方法,这将揭开分离的单细胞在不久的将来,更详细的转录。另一个限制是准确活泼FACS净化分离单个细胞。 FACS机器大多分配​​单个细胞到每个孔中,但是我们不能排除每个孔中可能包含多于一个小区,它可以用FACS净化系统的技术提前想通的可能性。然而,我们的协议可以直接适用于以最小的努力,任何一个实验室和分析单细胞基因表达具有成本效益的方式。

如图5,OCT4 :: EGFP阳性单细胞通过FACS分类的维持OCT4基因表达的相似水平,但NANOG显示多样的表达模式,这可能表明人类胚胎干细胞或重编程过程的多能性的不同状态1 。人们可以在胚胎干细胞的使用不同的细胞表面标记物(TRA-1-60,SSEA3,ICAM1,CD44),和/或遗传报告基因系统(NANOG,RE单细胞的简介等多能性基因的表达X1,STELLA,ESRRB等) 5-7 。使用此协议,单细胞基因表达的方法是简单而强大的方法,不同的人群,如人类胚胎干细胞或其他类型的干细胞。

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Disclosures

作者什么都没有透露。

Acknowledgments

我们要感谢李实验室的成员对稿件有价值的讨论。在李的实验室工作是由纽约干细胞基金会罗伯逊研究奖和美国马里兰干细胞研究基金(TEDCO)资助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well PCR Plate USA scientific 1402-8900
Ambion Cell Lysis Kit Life Technologies 4458235
SMARTScribe Reverse Transcriptase Clonetech 639536
ExoSAP-IT USB 78200
Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity Invitrogen 11304
10 mM dNTP Mix, PCR Grade Invitrogen 18427
SYBR Universal 2X Master Mix Kapa biosystem KR0389
Accutase Innovative Cell Tech S-1100-1
FACS buffer 45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 μl DNase, filter sterilized
35 μm cell strainer cap tubes BD Biosciences 352235

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References

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