인간 호중구 유량 용기 접착 분석

Immunology and Infection
 

Summary

호중구의 부착을 정량하는 방법이보고되어있다. 이 방법은 혈관에서 발생 된 것과 유사한 동적 흐름 환경을 생성한다. 그것은 허용 정제 부착 분자 (리간드) 또는 투명 스트레스 생체 환경 유사한 맥락에서 내피 세포 기질 (HUVEC) 중 하나에 호중구 부착 조사.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Zhou, Y., Kucik, D. F., Szalai, A. J., Edberg, J. C. Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay. J. Vis. Exp. (89), e51410, doi:10.3791/51410 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

내피 세포 호중구 회사 접착은 건강과 질병 모두 염증에 중요한 역할을합니다. 호중구 회사 접착 과정은 β 2 인테그린의 회원들과 ICAM 가족들의 반대 수용체 등 다양한 접착 분자를 포함한다. 최근에, 모두에서 자연적으로 발생하는 유전자 변종은 2 인테그린을 β 및 ICAMs은자가 면역 질환과 연관된 것으로보고있다. 따라서, 이러한 접착 분자의 다양한 대립 유전자 형태를 가진 사람에서 호중구의 양적 접착 능력은자가 면역의 개발을 기본 메커니즘과 관련하여 공부하는 것이 중요합니다. 흐름 챔버 시스템에서의 접착 연구는 생체 내에서 혈관 환경에서 관찰 된 것과 유사한 유체 전단 응력과 환경을 만들 수있다. 여기서, 우리는 인간 말초 혈액 호중구의 정량적 접착 특성을 연구하기 위해 유동 챔버 분석 시스템을 이용한 방법을 제시의 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)로 정제 리간드 기판에. 이 방법으로 접착 수용체 다른 대립 유전자 변형을 가진 기증자의 호중구 접착 능력을 평가하고 비교할 수 있습니다. 이 방법은 또한 다른 주 세포 유형 또는 세포주의 밀착성을 평가하기 위해 수정 될 수있다.

Introduction

모두 β 2 인테그린 및 ICAM 리간드의 유전자 변종은 현재자가 면역 질환의 1,2의 개발과 관련된 것으로 인식하고 있습니다. 이러한 변이를 가진 사람에서 파생 된 세포에서 이러한 변종의 기능적 결과의 결정은 이러한 변형은자가 면역 질환의 발병에 기여하는 방법에 대한 우리의 이해가 필요합니다. 이러한 기능적 연구는 자연적으로 발생하는 유전자 변종은 건강과 질병 모두에서 면역 반응을 형성하는기구의 판정을 허용. SLE의 구체적인 예에서, 우리는 지금 그 ITGAM (CD11b를) 변종 알고 리간드는, ICAM-1, 1,2 강하게 질환의 개발에 연결합니다. 호중구는 염증 반응에 중요하기 ​​때문에, 호중구 부착의 양적 연구는 ITGAM / ICAM의 유전자 변종이 염증을 변경하는 방법으로 기계적인 통찰력을 제공 할 수 있습니다.

Neutrop세포 (EC)를 내피 밀착성을 HIL은 매우 규제 과정 및 염증 반응 3,4에 필수적인 역할을한다. 호중구의 밀착성은 EC에 초기 호중구 압연 및 캡처를 다음과 궁극적으로 생체 내에서 윤회가 발생할 수 있습니다. 이러한 프로세스는 ICAM-1을 포함한 부착 분자의 많은 종류, ICAM-2, P-셀렉틴, E-셀렉틴 내피 세포 및 호중구 5-9이 인테그린을 β를 포함한다. 따라서, 접착 분자의 서로 다른 대립 유전자 변형을 가진 기증자로부터 호중구 부착주의 정량화이 유전자 변종의 기능 및 병리학 적 결과를 이해하는 것이 중요 할 것입니다.

유동 챔버의 사용은 생체 내 실험 10-12에서 혈관 환경에서 관찰 된 것과 유사한 유체 전단 응력으로 체외 환경을 만들 수있다. 실제로, 유량 용기의 분석은 인간의 umbili과 함께CAL 정맥 내피 세포 (HUVEC)는 혈관의 생체 내 환경을 모방 할 수있다. 이 방법을 사용하여, 하나는 내피 세포를 향해 전체 세포 접착 특성을 연구 할 수 있습니다. 또, 유동 챔버의 고도로 통제 된 환경은 또한 셀의 평가는 ICAM-1의 특정 수용체​​ - 리간드 상호 작용의 연구를 용이하게 정제 된 점착 리간드에 결합한다.

우리는 여기에서 HUVEC로 정제하여 리간드 기재에 인간 말초 혈액 호중구의 접착 특성을 연구하는 유동 챔버 접착 분석 시스템을 이용하는 방법을 제시한다. 다른 접착 분자의 대립 유전자의 변형을 표현하는 기증자의 세포로이 방법을 사용하면 우리가이 유전자 변종 인간 호중구 회사의 접착 성을 변경할 수있는 방법을 평가할 수 있습니다.

Protocol

이 연구를 위해 모집 모든 기증자가 서면 동의를 준 연구는 버밍엄 기관 평가위원회에서 알라바마의 대학에 의해 승인되었습니다.

1. HUVEC 초기 문화와 서브 컬쳐

  1. 내피 세포의 기초 배지 구성되어 완전한 성장 배지에서 체외 배양 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)는 내피 세포 성장 인자로 보충 (자재 목록 참조).
    참고 :이 연구에 사용 된 성장 요인은 다음을 포함한다 : 5 NG / ML 인간 재조합 표피 성장 인자 (hEGF), 1.0 ㎎ / ㎖의 하이드로 코티손, 50 ㎎ / ㎖ 겐타 마이신 및 50 NG / ML 암포 테리 신-B (GA-1000), 2 % 태아 소 혈청 (FBS), 0.5 NG / ML 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 10 NG / ML 인간 섬유 아세포 성장 헤파린 (hFGF-B)와 인자 - 기본, 20 NG / ML 인간 재조합 인슐린과 같은 성장 인자 ( R 3-IGF-1) / ㎖ 아스코르브 산 1 μg 및 22.5 ㎍ / ml의 헤파린. 완전 배지37 ° C에서 처음에 준비하고 준비 1 개월 이내에 사용하기 위해 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
  2. 세포의 플라스크를 준비하려면, 전체 성장 매체는 75 ㎠의 조직 배양 플라스크 (1 ㎖ / 5cm 2)에 다음 플라스크의 배양기에서 37 ° C / 5 % CO 2 평형을 허용 추가 적어도 30 분. 인간은 HUVEC / cm 2 2,500-5,000 세포의 밀도로 평형화이 배양 플라스크에 직접 파종한다.
  3. 미디어가 평형을하는 동안 신속하게 37 ° C의 물을 욕조에 주식 HUVEC의 cryovial을 해동. 볼 텍싱에 의해 일본어 저장 바이알 세포를 분산하고 / cm 2 2,500-5,000 세포 밀도를 달성하기 위해 미리 평형화 HUVEC 완전 성장 배지를 함유하는 배양 플라스크에 직접 추가. 부드럽게 골고루 세포를 배포 한 후 인큐베이터에 플라스크를 반환하는 플라스크 바위. 이 세포는 현재 1 차 통과를 나타냅니다.
  4. <세포를 70 ~ 80 % 년 합류 할 때까지 리> 보통은 이틀마다 변경해야합니다.
  5. HUVEC를 지금 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 문화 플라스크에서 수확 할 수있다. 배양 배지는 세포에서 남아있는 단백질과 칼슘을 제거하는 PBS 린스 다음에 배양 플라스크에서 흡입됩니다. 0.25 % 트립신-EDTA 용액을 첨가하고, 광학 현미경에 의해 평가로 2-6 분의 세포 분리에서 분명해야한다.
  6. 세포의 90 %가 플레이트 오프 반올림되는 경우, 2X 트립신 억제제의 동량을 첨가함으로써 트립신을 멈춘다. 세포 수확을 용이하게하기 위해, 완전 성장 배지의 다른 동등한 양을 추가한다. 멸균 15 ML의 원심 분리기 튜브에 분리 된 세포를 전송합니다.
  7. 실온에서 5 분 동안 225 XG에서 분리 된 세포를 원심 분리기. 뜨는을 대기음하고 완전한 성장 매체의 2 ~ 3 ㎖의 세포를 재현 탁. hemacytometer와 트리 판 블루를 사용하여 세포 농도 및 생존 능력을 결정합니다.
  8. 일을 사용하려면전자 연구를위한 세포, 다시 씨앗 추가 75cm / 10,000 세포의 밀도로 세포 2 플라스크를 수확하고 2.2 단계로 진행합니다. 또한, 세포는 미래의 연구를 위해이 시점에서 고정 할 수 있습니다. 냉동 세포를 들어, 실온에서 5 분 동안 225 XG에서 원심 분리하여 세포를 펠렛. 상등액 대기음하고 1 × 106 세포 / ml의 농도에서 10 %의 DMSO를 함유 FBS에서 세포 펠렛을 재현 탁. 세포 현탁액을 세포 냉동 컨테이너에 세포를 고정한 후 cryovials에 옮기고 -80 ° C에 저장된다.

2. HUVEC 계층 준비

  1. 냉동 2 차 통과 된 HUVEC의 사용 : 부흥과 문화. 적극적으로 성장하는 세포를 사용하는 경우, 2.2 단계로 진행합니다.
    1. 37 ° C의 물을 욕조에 신속하게 단계를 1.8에서 2 차 통과 된 HUVEC을 포함하는 cryovial을 해동. 15 ㎖의 멸균 원심 분리 관에 cryovial 세포를 전송하고 10 ㎖ 성장 메디 추가음.
    2. 상온에서 5 분 200 XG에서 세포를 원심 분리기 및 잔류 DMSO를 제거 뜨는을 대기음.
    3. 완전 성장 배지로 세포 펠렛을 재현 탁하고 75cm 2 플라스크에 세포를 옮긴다. 전체 볼륨에 대한 20 ~ 25 ml로 성장 매체를 추가하고 37 ° C / 5 % CO 2에서 품어.
  2. 시각 매체의 변화 이틀에 하루에 합류하기위한 세포 배양을 검사합니다. 보통 2 ~ 4 일 이내에, 세포들은 흐름 챔버 분석에 사용하기위한 준비가 될 것입니다 어떤 시간에 80~90% 합류에 도달 할 것입니다.
  3. 유량 용기에 사용되는 배양 접시를 준비하려면 (5 장 참조), 수 있도록 10 ㎍ / ml의 피브로넥틴 1 ㎖와 0.05 % 35mm 조직 문화 요리와 피펫 (w / v)의 젤라틴을 여러 번 추가 확인 전체 플레이트 표면은 코팅되어있다. 단백질 매트릭스 형성을 최적화하기 위해 최소 30 분 동안 접시를 건조 과도한 피브로넥틴과 젤라틴 용액과 공기를 제거합니다. Fibronectin 젤라틴 용액을 10 배까지 재사용 할 수있다.
  4. 단계 1.5-1.7의 설명에 따라 트립신-EDTA를 이용하여 단계 2.2에서 HUVEC 세포를 수확. 각 코팅 조직 배양 접시에 50 만 셀을 시드. 각 접시에 2 ㎖ 성장 매체를 추가하고 37 ° C / 5 % CO 2에서 품어.
  5. 세포 단계 2.2에서와 같이 합류로 성장할 수 있습니다. 세포는 시각 매체의 변화 이틀 매일 점검해야한다. 이전 유량 용기의 분석에, 접착 분자 발현을 상향 조절하고 자극하는 4 ~ 6 시​​간 동안 20 NG / ML 인간 TNF-α와 HUVEC 총리.

3. 정화 리간드 코팅

  1. 35mm 조직 배양 접시의 중앙에 마커 또는 펜으로 0.5 cm 직경의 원을 그립니다.
  2. 표시된 지역에서 20 ㎍ / ㎖의 단백질의 판 (20) μL. 단백질에게 0.5 cm 직경의 원 안에 전체 영역을 커버하는 솔루션을 확산 피펫 팁을 사용합니다. 그것은 D의 표면을 만지거나 긁지하는 것이 중요하다ISH. 1 시간 동안 37 ℃에서 배양한다.
  3. 1 ㎖의 PBS (산도 8.0)와 단백질 코팅 된 플레이트의 3 배를 씻으십시오.
  4. 비 특정 판에 바인딩을 차단하기 위해 표시된 부분의 판 (50) ㎕의 1 % BSA. 4 ℃에서 2 시간 동안 배양
  5. 단계 3.3에서와 같이 1 ㎖의 PBS 차단 판의 3 배를 씻으십시오.
  6. 코팅 구단 유착 수용체 리간드 키메라 단백질 솔루션을 준비합니다. 이 실험에서, 25 ㎍ / ml로 ICAM-1/Fc 키메라 PBS 용액 및 0.5 ㎍ / ml로 P-Selectin/Fc 키메라는 (산도 8.0)을 사용 하였다.
  7. 코트 기판의 50 μL로 표시된 부분. 4 ℃에서 하룻밤 배양한다 접시 2 일 이내에 사용되어야하며, 코팅 된 지역은 건조하도록 허용 할 수 없습니다. 접시에 50 μL 솔루션을 유지하기 위해 필요한 경우 PBS를 추가합니다.

4. 호중구 분리 (실내 온도에서 수행되는 모든 단계)

  1. 동의를 얻은 후, 정맥 절개에 의해 참가자의 혈액을 수집N 항 응고 혈관 또는 vacutainer (EDTA 또는 헤파린). 채혈 후 분리하기 전에 PBS와 혈액 1:1 희석.
  2. 50 ㎖ 원심 분리기 튜브에 PBMC 및 호중구를 분리하는 2 개의 층 피콜를 준비합니다. 처음 15 ㎖의 헤비 피콜 (재료의 목록, ρ = 1.118-1.120 참조)에 추가 한 다음 조심스럽게 10 ㎖ 무거운 피콜 위에 (재료의 목록, ρ = 1.077-1.080 참조) 피콜 빛 층. 빛 피콜 무거운 피콜 층 사이에 날카로운 경계가 있어야합니다. 마지막으로,주의 깊게 피콜 층을 방해하지 않고 빛 피콜 위에 희석 된 혈액 샘플 25 ㎖ 레이어.
  3. 실온에서 30 분 동안 250 XG에서 튜브를 원심 분리기. 주의 : 이러한 스핀은 원심의 끝에서 로터 감속시의 세포 분리의 잠재적 인 방해를 최소화하기 위해 원심 로터 브레이크가 해제되어야한다. 원심 분리 후, (위에서 아래로) 다음의 층 존재 : 상부 층은 플라즈마 FOLLO이며광 피콜 층 위에 PBMC 층에 의해 물, 약간의 적혈구 (RBC)와 호중구 층은 튜브의 바닥에서 무거운 피콜 층과 적혈구이어서 가볍고 무거운 피콜 사이​​이다.
  4. 수확하고, 전송 피펫으로 새로운 50 ㎖ 튜브에 호중구 계층 전송을 실온에서 10 분 동안 225 XG에 50 ㎖ 원심 분리기의 최종 부피 PBS를 추가.
    1. 원심 분리 후, 여전히 호중구와 혼합 적혈구가있을 수 있습니다. 아래로 10 ㎖ 마크 뜨는을 대기음. 튜브 (또는 간단한 저속 소용돌이로 교반)의 부드러운 교반 호중구 RBC 펠렛을 재현 탁하고 PBS 50 ㎖로 다시 세척한다.
  5. 두 번째 세척 후, 뜨는을 대기음. , 오염 적혈구를 제거 교반 (또는 짧은 소용돌이로 교반)에 의해 잔류 PBS의 펠렛 세포를 재현 탁하려면 25 ML의 H 2 O 및 RBC를 용해하는 10 초 동안 부드럽게 소용돌이를 추가합니다.
    1. 1.8 % 염화나트륨 25 mL를 넣고 즉시 혼합실온에서 10 분 동안 225 XG에서 원심 분리함에 따라. 오염 RBC는 이제 흰색 호중구 세포 펠렛을 떠나 용해되어야한다.
  6. PBS와 호중구 세포 펠렛을 씻으십시오.
  7. 10 % FBS와 RPMI 배지에서 격리 된 호중구를 재현 탁하고 혈구와 광학 현미경으로 세포 농도를 결정한다.
  8. 완전 RPMI-10 % FBS 배지로 500,000 세포 / ml의 세포 밀도를 조정한다.

5. 유량 용기 접착 분석

  1. 유량 용기를 조립합니다. 현미경 테이블에 합류 HUVEC를 또는 정제 부착 수용체 리간드를 포함하는 35mm 접시를 놓습니다. 주사기 펌프, 진공 시스템과 병렬 플레이트 흐름 챔버를 연결하고 호중구 입력 오픈 한 줄을 둡니다. 접시 위에 유량 용기를 삽입하고 유량 용기 조립체 (13)를 고정합니다. (그림 1 참조)
  2. 컴퓨터 연결된 t에 녹화 프로그램을 시작현미경 오. 완전히 성장 HUVEC 세포와 명확한 필드 또는 리간드 코팅 영역을 볼 수 있습니다 내에서 필드까지 현미경의 필드와 초점을 조절합니다.
  3. 주사기 펌프를 사용하여, RPMI 배지로 유동 챔버를 헹군다. 챔버 내의 기포 또는 호중구 입력 라인이 없는지 확인합니다.
  4. 원하는 경우, 호중구는 10 분 동안 낮은 복용량 (10 -8 M) fMLP으로 뇌관을 할 수있다. 이것은 다른 기증자 (14) 사이의 호중구 활성화의 기초 수준의 일치를 허용합니다.
  5. 정의 속도 유량 용기에 (이 연구에서 사용되는 / 1.5 다인의 전단 응력과 동일 350 μL / 분의 속도) 호중구를 주입하는 주사기 펌프를 사용합니다. 영상을 기록합니다. 호중구 밀착성이 빠르게 일어날 수 있으므로, 4-5 분의 길이는 비디오 분석을 위해 점착 이벤트를 정량하는 것이 충분하다.
  6. 부착 성 세포는 이하 기포 직경을 이동 셀로서 정의된다HUVEC 또는 리간드 코팅 된 표면 (15, 16)에 5 초 이내. 이 규칙을 사용하여 기록 된 영상 내에 존재하는 필드에 부착 세포의 총 수를 센다. 다른 기증자 호중구와 비슷한 길이의 동영상을 기록하여, 하나는 다른 기증자 사이의 접착 특성을 비교하기 위해 부착 세포 / 분을 계산할 수 있습니다.

Representative Results

호중구의 예는 정제 리간드 (ICAM-1/P-Selectin) 코팅 유량 용기 (그림 2) 또는 HUVEC 코팅 흐름 챔버 분석 (그림 3)에 결합하는 호중구의에 바인딩이 표시됩니다. 도면에 도시 된 바와 같이, 호중구는 연속적인 흐름의 조건 하에서 피복면 또는 HUVEC에 밀착 / 축적하는 것을 계속한다. 우리의 일반적인 실험 조건에서, 우리는 확고하게 네 분의 기록 기간 동안 코팅 표면 또는 HUVEC에 부착 50-70 인간 호중구를 관찰 할 수 있습니다. 그러나, 호중구 부착 분자, 또는 기판 (정제 리간드 또는 HUVEC)에있는 대립 유전자 변형 대립 유전자 변형이 실질적으로 양적 호중구 부착 (14)를 변경할 수 있습니다.

우리는 우리의 연구에서 관찰 된 호중구 부착 이벤트의 시간 의존성을 평가했다. 우리가 일정한 유량 조건을 유지하고 있지만, 그것은 세포의 접착 성이 시간에 따라 변경하는 것이 가능하다. However, 우리의 연구에서 비교적 짧은 시간의 과정을 통해, 우리는 시간이 지남에 따라 접착력의 비율에 어떤 일관성있는 차이를 관찰하지 않습니다. 예를 들어, 3-4 분 시간 지점 사이에서 관찰 접착력에 비해 1-2 분 시점에서의 밀착성을 평가 일관 다르지 않다. 세포 부착 실험 동안 자극되는 경우 물론, 다음 시간에 따른 접착 특성의 변화가 예상 될 수있다.

우리의 연구에서, 우리는 의도적으로 공부를하기 전에 10 분 동안 낮은 복용량 fMLP (10-8 M)와 함께 세포를 프라이밍하여 격리 유도 호중구의 활성화를 위해 제어. 내피 세포 (우리의 연구에서 HUVEC)도 최적의 백혈구 회사의 접착 접착 분자의 발현을 상향 조절하기 전에 정품 인증이 필요합니다. 전처리의 부재에서, 내피 세포 (HUVEC를)는 매우 적은 호중구 부착을 지원할 것이다. 우리의 연구에서, 우리는 10 NG / ML 사용하기 전에 4-6 시간 동안 TNFα 처리를 사용했다. IL-1β (10 NG / ㎖) LPS (0.5 ㎍ / ㎖)을 또한 내피 세포를 미리 활성화하는 데 사용할 수있다. 중요한 치료는 HUVEC 세포 부착이 특정 (수용체 - 매개) 중성구 - 내피 세포 상호 작용에 의해 발생되도록하여 음성 대조군으로 사용할 수있다. 또는, 항 - 수용체 항체는 접착 특이성을 평가하는 특정 수용체​​를 차단하기 위해 사용될 수있다.

그림 1
현미경 단계의 그림 1. 흐름 챔버 구성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

oad/51410/51410fig2.jpg "/>
0 시점, B : 1 분 시점, C : 2 분의 시점, 그리고 D. 다른 시간 지점 (A로 코팅 된 표면을 ICAM-1/P-Selectin에 부착 된 호중구의 샘플 비디오에서 그림 2 스크린 샷 : 4 분 시점). ICAM-1의 농도가 25 ㎍ / ㎖를이고 P-셀렉틴은 0.5 ㎍ / ㎖의이다. 호중구의 흐름 속도가 500,000 세포 / ml로 호중구 밀도 350 μL / 분이다.

그림 3
. 서로 다른 시간의 점 (0 시점, B : 1 분 시점, C : 2 분의 시점, 그리고 D : 4 분의 시점)에서 HUVEC 코팅 표면에 부착 호중구의 샘플 비디오에서 그림 3의 스크린 샷.호중구의 흐름 속도가 500,000 세포 / ml로 호중구 밀도 ML 350 μL /이다.

위치 전단 응력 (다인 / cm 2)
사람의 일반 caroid 동맥 11.6
사람의 아가미 동맥 6.5
사람의 대퇴 동맥 4.3
사람의 부신 대동맥 7.3
사람의 Supraceliac 대동맥 4.2
사람의 표면 fermoral 동맥 4.4
사람의 세정맥 0.5 ~ 5.0
사람의 망막 처음 소동맥 40.2
사람의 두 번째 망막 세동맥 0.001
사람의 망막 처음 세정맥 23.2
사람의 망막 번째 세정맥 0.43
일반 caroid 동맥 15.8
토끼 일반 caroid 동맥 23.3
일반 caroid 동맥 46.​​6
마우스 일반 caroid 동맥 64.8
대퇴 동맥 9.8
토끼 대퇴 동맥 156.8
대퇴 동맥 65.9

다른 기관과 다른 종의 표 1. 샘플 전단 응력.

* 참고 문헌 13, 16, 19, 20에서 요약.

Discussion

이 프로토콜은 깎아 지른듯한 스트레스 조건에서 호중구의 부착주의 정량화를위한​​ 최소한의 활성화 된 호중구의 분리 및 격리를 안내합니다. 호중구 부착 염증에서 중요한 과정이다. 이 과정에서 여러 분자의 유전자 변종은자가 면역 질환 1,2의 발전에 걸리기 입증 되었기 때문에, 정량적으로 인간 호중구 회사의 접착력을 평가 할 수있는 분석 시스템이 필요합니다. 이 프로토콜에서 설명하는 방법은 깎아 지른듯한 스트레스 조절 체외 환경에서 호중구의 회사 접착제 전위의 신중하고 정량 할 수 있습니다. 이 방법은 따라서 유전자형 개인 간의 양적 호중구 부착 직접 비교가 부착 분자 (14)의 유전 적 변이의 중요도를 결정한다.

이 방법의 몇 가지 단계에 achiev을 충분히 고려 공로전자 고도의 양적 및 재현 가능한 결과. HUVEC 제제에서, 유동 챔버 내에 사용하기 전에 100 % 세포의 합류를 달성하는 것이 중요하다. 정제 리간드로 코팅 된 표면을 사용하기 위해, 기판 코팅 영역은 리간드 변성 방지하기 위해 건조하도록 허용해서는 안됩니다. 또, 인간의 호중구의 제제는 실험의 성공에 중요하다. 혈액에서 호중구를 분리의 주요 이슈 조심스럽게 분리하고 실험을, 활성화를 피하기 위해 소용돌이로 교반을 최소화 (혈액은 실온에서 수행되어야 얼음과 원심 분리 단계에 저장할 수 없습니다 즉) 실온에서 세포를 유지하고 완료하여 처리 포함 가능한 한 최소의 시간에. 또한 이러한 분석법 17,18 위해 세포를 준비하는 데에 이용 될 수있는 추가 호중구의 분리 방법이있다.

갓 고립 된 인간의 호중구를 사용하여 실용적인 관점, 접착 분석에서 참가자 정맥 절개 후 3-6 시간 이내에 시작되어야한다. 호중구 처리에 매우 민감으로, 채혈 및 사용 사이의 오랜 시간 분석 결과에 영향을 줄 수 있습니다. 종래 유동 챔버 분석에 호중구 세포 농도의 신중한 판단이 정확하고 재현성있는 결과를 달성하기 위해 필요하다.

흐름 챔버 분석 동안, 흐름 속도가 일치하고 실험의 길이에 걸쳐 제공된 난류이 없도록 신중 비디오 기록을 감시하는 것이 중요하다. 유동 속도 변화 나 난류의 존재는 실험을 반복 할 것을 필요로한다. 실험 한 결과, 호중구가 응집되지 않도록 미세 잔존 호중구를 평가하는 것이 중요하다. 이 시점에서 응집하면 호중구가 크게 실험 기간 동안 호중구 밀도를 변경할 수있는 활성화 될 것을 나타냅니다.

내용 "> 흐름 챔버는 Q가 = 유량 챔버 내 주변의 균일 한 얇은 응력 (τ = 6Qμ / (WH 2), μ = 동점도 및 유량 용기의 W = 폭의 H = 높이를 생성 ) 챔버 (15)를 흐른다. 우리의 연구에서, 우리는 / cm 2 1.5 다인의 깎아 지른 스트레스를 생성 호중구 접착에 350 μL / 분의 유속을 사용 (= w 0.25 cm, H = 인치 0.01, 물의 점성 37 ° C에서 (0.007 포이즈가)) RMPI 매체의 점도의 근사치로 사용 하였다. 특정 유동 챔버를 들어, 하나의 다른 생리적 조건을 모방하도록 투명 응력의 상이한 레벨을 달성하기 위해 유량을 변경할 수있다. 일반적인 생리적 전단 응력보기 인간 혈관 0.5-5.0 다인 / cm 13,16 사이의 범위. 다른 혈관에서 전단 응력 수 및 다른 동물은 표 1 113,16,19 20에 열거 하였다.

우리의 방법은 인간의 neutrophi의 접착의 연구에 초점을 맞추고있는 동안LS,이 방법은 호중구에 한정되지 않고, 용이하게 부착 또는 간단한 변형을 가진 다른 세포 유형의 압연 연구에 적용될 수있다. 또한,이 방법에서는 기판은 다른 목적을 위해 변경 될 수있다.

이 프로토콜은 서로 다른 연구에 쉽게 적응할 수 있지만, 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 여기에 구현 된 프로토콜 분석을 위해 일차 전지의 많은 수를 필요로한다. 이 작은 동물에서 일차 전지의 분석을 방해 할 수 있습니다. 또한, 가능 / 활성 형태로 정제 된 점착 리간드를 고정화 할 필요가 리간드의 범위를 제한 할 수있다. 된 Fc 융합 단백질의 용도는 크게 플레이트 표면에 적절한 리간드의 입체 구조를 달성 할 가능성을 향상시킨다. 그럼에도 불구하고, 우리의 방법은 접착 이벤트의 정량 분석​​을 허용하기 위해 상당한 유연성을 가지고 있습니다. 이러한 연구는 매우 우리의 유착 수용체 리간드 쌍의 이해, 유전자 변종의 잠재적 기능의 중요성을 향상시킬 것입니다이러한 단백질, 인간의 질병의 병인에.

Disclosures

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgements

이 작품은 루퍼스 연구소 (NY, NY), NIH P01-AR49084, NIH R21-DA026956 및 NIH UL1-TR00165 후원됩니다. 우리는 자신의 지속적인 지원을 위해 로버트 P. 킴벌리 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin/EDTA Life technologies 25200-056 with Phenol Red
2x Trypsin inhibitor Life technologies R-002-100
35 mm tissue culture dish Corning Inc. 430165 Standard Tissue Culture Treated Surface
75 cm2 tissue culture flask Corning Inc. 430641 Standard Tissue Culture Treated Surface
CCD camera Dage-MTI Model 300T-RC
Cell freezing container  Biocision BCS-045
EBM-2 Lonza Inc. CC-3156 HUVEC growth basal medium
EGM-2 Bulletkit Lonza Inc CC-4176 HUVEC growth factors for basal medium
FBS Life technologies 10082-147 Certified, Heat Inactivated
Gelatin Sigma G9391 from bovine skin
Hemacytometer Fisher scientific 02-671-51B
Fibronectin Sigma F2006 from human plasma
Flow chamber Glyco Tech 31-001 Circular flow chamber for 35 mm dishes
fMLP Sigma 47729
Histopaque-11191 Sigma 11191 Heavy Ficoll
HUVEC Lonza Inc. CC-2517A
ICAM-1 R&D Systems 720-IC Fc chimera
Lymphocyte separation medium Mediatech Inc. 25072CV Light Ficoll
Microscope Zeiss Axiovert 100
RPMI 1640 medium Life technologies 11875 with L-glutamine and Phenol Red
Protein A Sigma P6031 resuspend in PBS
P-Selectin R&D Systems 137-PS Fc chimera
Syringe pump KD Scientific KDS270
TNF-α Life technologies PHC3015 Recombinant Human Protein
Trypan Blue Solution, 0.4% Life technologies 15250-061

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Harley, J. B., et al. Genome-wide association scan in women with systemic lupus erythematosus identifies susceptibility variants. in ITGAM, PXK, KIAA1542 and other. 40, 204-210 (2008).
  2. Kim, K., et al. Variation in the ICAM1-ICAM4-ICAM5 Locus Is Associated with Systemic Lupus Erythematosus Susceptibility in Multiple Ancestry Populations. Ann. Rheum. Diseases. 71, (11), 1809-1814 (2012).
  3. Ley, K. Molecular mechanism of leukocyte recruitment in the inflammatory process. Cardiovasc. Res. 32, (4), 733-742 (1996).
  4. Korthuls, R. J., Anderson, D. C., Granger, D. N. Role of neutrophil-endothelial cell adhesion in inflammatory disorders. J. Crit. Care. 9, (1), 47-71 (1994).
  5. Albelda, S. M., Smith, C. W., Ward, P. A. Adhesion molecules and inflammatory injury. FASEB J. 8, (8), 504-512 (1994).
  6. Smith, C. W., Marlin, S. D., Rothlein, R., Toman, C., Anderson, D. C. Cooperative interactions of LFA-1 and Mac-1 with intercellular adhesion molecule-1 in facilitating adherence and transendothelial migration of human neutrophils in vitro. J. Clin. Invest. 83, (6), 2008-2017 (1989).
  7. Marlin, S. D., Springer, T. A. Purified intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) is a ligand for lymphocyte function-associated antigen. Cell. 51, (5), 813-819 (1987).
  8. Lawrence, M. B., Springer, T. A. Leukocytes roll on a selectin at physiologic flow rates: Distinction from and prerequisite for adhesion through integrins. Cell. 65, (5), 859-873 (1991).
  9. Smith, C. W. Possible steps involved in the transition to stationary adhesion of rolling neutrophils: A brief review. Microcirculation. 7, 385-394 (2000).
  10. Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y., Chien, S., Skalak, R. Design and construction of a linear shear stress flow chamber. Ann. Biomed. Eng. 21, (1), 77-83 (1993).
  11. van Kooten, T. G., Schakenraad, J. M., Vander Mei, H. C., Busscher, H. J. Development and use of a parallel-plate flow chamber for studying cellular adhesion to solid surfaces. J. Biomed. Mater. Res. 26, (6), 725-738 (1992).
  12. Munn, L. L., Melder, R. J., Jain, R. K. Analysis of cell flow in the parallel plate flow chamber: Implications for cell capture studies. Biophys. J. 67, 889-895 (1994).
  13. Kucik, D. F. Measurement of Adhesion Under Flow Conditions. Current Protocols in Cell Biology. 9.6.1-9.6.10 (2003).
  14. Zhou, Y., et al. Multiple Lupus Associated ITGAM Variants Alter Mac-1 Function on Neutrophils. Arthritis. Rheum. (2013).
  15. Bacabac, R. G., et al. Dynamic shear stress in parallel-plate flow chambers. J. Biomech. 38, (1), 159-167 (2005).
  16. Kucik, D. F., Wu, C. Cell-Adhesion Assay. Methods in Molecular Biology. 294, 43-54 (2005).
  17. Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed,, Goosmann, U., C,, Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. J Vis Exp. 36, (36), (2010).
  18. Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J Vis Exp. (17), 745 (2008).
  19. Cheng, C., et al. Large variations in absolute wall shear stress levels within one species and between species. Atherosclerosis. 195, (2), 225-235 (2007).
  20. Nagaoka, T., Yoshida, A. Noninvasive evaluation of wall shear stress on retinal microcirculation in humans. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, (3), 1113-1119 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics