Humant neutrofilt flöde kammare Adhesion Assay

Immunology and Infection
 

Summary

En metod för kvantifiering av neutrofil adhesion rapporteras. Denna metod skapar ett dynamiskt flöde miljö som liknar den som påträffas i ett blodkärl. Det möjliggör undersökningen av neutrofil adhesion till antingen renat adhesionsmolekyler (ligand) eller endotelcell substrat (HUVEC) i ett sammanhang som liknar miljön in vivo med ren stress.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Zhou, Y., Kucik, D. F., Szalai, A. J., Edberg, J. C. Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay. J. Vis. Exp. (89), e51410, doi:10.3791/51410 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Neutrofil fast adhesion till endotelceller spelar en avgörande roll i inflammation i både hälsa och sjukdom. Processen för neutrofila fast adhesion innebär många olika adhesionsmolekyler, däribland medlemmar av β 2 grinfamiljen och deras mot-receptorer av ICAM familjen. Nyligen, naturligt förekommande genetiska varianter i både β 2-integriner och ICAM har rapporterats i samband med autoimmuna sjukdomar. Således är det viktigt att studera i förhållande till mekanismerna bakom utvecklingen av autoimmunitet den kvantitativa vidhäftningsförmåga av neutrofiler från individer med olika alleliska former av dessa adhesionsmolekyler. Vidhäftnings studier i flödeskammarsystem kan skapa en miljö med vätska skjuvspänningen liknande den som observerades i blodkärlet miljön in vivo. Här presenterar vi en metod som använder en flödeskammare analyssystem för att studera de kvantitativa vidhäftningsförmåga av humant perifert blod neutrofilas för människors navelsträng ven endotelceller (HUVEC) och renade ligand substrat. Med denna metod kan de neutrofila självhäftande kapacitet från donatorer med olika allelvarianter i adhesionsreceptorer bedömas och jämföras. Denna metod kan också modifieras för att utvärdera vidhäftningen av andra typer primär cell eller cell-linjer.

Introduction

Genetiska varianter i både β 2-integriner och i ICAM-ligander redovisas nu att förknippas med utvecklingen av autoimmuna sjukdomar 1,2. Fastställandet av de funktionella konsekvenserna av dessa varianter i celler från individer med dessa varianter är nödvändig för vår förståelse av hur dessa varianter bidrar till autoimmun sjukdom patogenes. Sådana funktionella studier tillåter bestämning av de mekanismer som naturligt förekommande genetiska varianter forma immunsvar i både hälsa och sjukdom. I det specifika exemplet på SLE, vi vet nu att varianter i ITGAM (CD11b) och dess ligand, ICAM-1, starkt förknippar med utveckling av sjukdom 1,2. Eftersom neutrofiler är kritiska i inflammatoriska svar, kan den kvantitativa studien av neutrofiladhesion ger mekanistiska insikter i hur genetiska varianter i ITGAM / ICAM förändrar inflammation.

NeutropHil fast adhesion till endotelceller (EC) är en starkt reglerad process och spelar en viktig roll i inflammatoriska svar 3,4. Företaget vidhäftning av neutrofila följer initiala neutrofila rullande och fånga på EG och i slutändan kan leda till att transmigration in vivo. Dessa processer involverar många olika typer av adhesionsmolekyler, inklusive lCAM-1, ICAM-2, P-selektin, E-selektin på endotelceller och β 2-integriner på neutrofil 5-9. Således kommer noggrann kvantifiering av neutrofiladhesion från donatorer med olika alleliska varianter av adhesionsmolekyler vara viktigt att förstå de funktionella och patologiska konsekvenserna av dessa genetiska varianter.

Experimentell användning av en flödeskammare kan skapa en in vitro-miljö med fluidum skjuvspänning liknande den som observerats i blodkärlet miljö in vivo 10-12. När man i en flödeskammare analys kopplad med humant umbilical vein endothelial cell (HUVEC) kan härma miljön av ett blodkärl in vivo. Med denna metod kan man studera de totala cellulära vidhäftningsförmåga mot endotelceller. Dessutom medger den starkt kontrollerad miljö i flödeskammaren också bedömning av cellbindning till renade vidhäftningsligander, såsom ICAM-1 för att underlätta studier av specifika receptor-ligand-interaktioner.

Vi presenterar här en metod som utnyttjar en flödeskammare vidhäftningsanalyssystem för att studera de vidhäftande egenskaperna hos humana perifera blod neutrofiler till HUVEC och renade ligand substrat. Med den här metoden med celler från givare som uttrycker olika adhesionsmolekyl allelvarianter tillåter oss att bedöma hur dessa genetiska varianter kan förändra människans neutrofil fast adhesion.

Protocol

Alla givare som rekryteras för denna studie gav skriftligt informerat samtycke och studien godkändes av University of Alabama i Birmingham Institutional Review Board.

1. HUVEC Inledande kultur och subkultur

  1. Kultur mänskliga navelvenendotelceller (HUVEC) in vitro i komplett odlingsmedium som består av endotelceller basalmedium (se Lista över material) kompletterat med endothelial cell tillväxtfaktorer.
    Anmärkning: De tillväxtfaktorer som används i denna studie innefattar: 5 ng / ml human rekombinant epidermal tillväxtfaktor (hEGF), 1,0 mg / ml hydrokortison, 50 mg / ml gentamicin och 50 ng / ml amfotericin-B (GA-1000), 2 % fetalt bovint serum (FBS), 0,5 ng / ml Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), 10 ng / ml human fibroblasttillväxtfaktor-Basic med heparin (hFGF-B), 20 ng / ml human rekombinant insulinliknande tillväxtfaktor ( R-3-IGF-1), 1 | ig / ml askorbinsyra och 22,5 | ig / ml heparin. Den fullständigt mediumframställes initialt vid 37 ° C och kan sedan lagras vid 4 ° C för användning inom en månad från beredningen.
  2. För framställning av en kolv för celler, komplett tillväxtmedium tillsattes till en 75 cm 2 vävnadsodlingskolv (1 ml / 5 cm 2) och därefter i kolven tillåts jämvikta till 37 ° C / 5% CO2 i en fuktad inkubator under åtminstone 30 min. Humant HUVEC seedas direkt in i denna jämviktad odlingskolv vid en densitet av 2,500-5,000 celler / cm 2.
  3. Medan media är ekvilibrering, snabbt tina lager HUVEC cryovial i ett 37 ° C vattenbad. Dispergera cellerna i den ursprungliga lagringsflaskan genom virvling och sedan lägga till dem direkt till odlingskolv innehållande pre-ekvilibrerad HUVEC komplett tillväxtmedium för att uppnå en densitet av 2,500-5,000 celler / cm 2. Skaka kolven att jämnt fördela cellerna och sedan tillbaka kolven till inkubatorn. Dessa celler representerar nu den 1: a passagen.
  4. <li> Medium ska bytas varannan dag tills cellerna är 70-80% sammanflytande.
  5. Den HUVECs kan nu skördas från odlingskolven med trypsin / EDTA. Odlingsmediet sugs från odlingskolvarna, följt av en PBS-sköljning för att avlägsna återstående protein och kalcium från cellerna. En 0,25% trypsin-EDTA-lösning tillsätts och inom 2-6 minuter cell lossnar bör framgå enligt bedömning av ljusmikroskop.
  6. När 90% av cellerna har avrundats uppåt från plattan, stoppa trypsinisering genom tillsats av en lika stor volym av 2x trypsininhibitor. För att underlätta skörden av celler, tillsätt en annan lika stor mängd av fullständigt tillväxtmedium. Överför de lösgjorda celler till ett sterilt 15 ml centrifugeringsrör.
  7. Centrifugera de lösgjorda cellerna vid 225 xg under 5 min vid rumstemperatur. Aspirera supernatanten och sedan återsuspendera cellerna i 2-3 ml fullständigt tillväxtmedium. Bestäm cellkoncentrationen och livskraft med hjälp av en hemacytometer och trypanblått.
  8. För att använda ee skördade celler för studier, nytt frö ytterligare 75 cm 2 flaskor med celler vid en densitet av 10.000 celler / cm 2 och gå vidare till steg 2.2. Alternativt kan celler frysas vid denna punkt för framtida studier. För cellfrysning, pelletera cellerna genom centrifugering vid 225 xg under 5 min vid rumstemperatur. Sug bort supernatanten och återsuspendera cellpelleten i FBS innehållande 10% DMSO vid en koncentration av 1 x 10 6 celler / ml. Cellsuspensionen överförs sedan till kryorör och lagras vid -80 ° C efter frysning av cellerna i ett cellfrysbehållare.

2. HUVEC Layer Förberedelser

  1. Användning av frysta 2: a passagen HUVECs: väckelse och kultur. Om du använder aktivt växande celler, gå vidare till steg 2.2.
    1. Tina cryovial innehållande 2 nd passage HUVEC från steg 1,8 snabbt i ett 37 ° C vattenbad. Överför celler från köldkärlet till ett 15 ml sterilt centrifugrör och tillsätt 10 ml tillväxt medium.
    2. Centrifugera cellerna vid 200 xg under 5 min vid rumstemperatur och aspirera supernatanten för att avlägsna den kvarvarande DMSO.
    3. Resuspendera cellpelleten med komplett tillväxtmedium och överföra celler i en 75 cm 2-kolv. Lägg till tillväxtmediet till en total volym om 20 till 25 ml och inkubera vid 37 ° C / 5% CO2.
  2. Undersöka visuellt cellkultur för sammanflödet varje dag med medie ändras varannan dag. Vanligtvis inom 2-4 dagar, kommer cellerna når 80-90% sammanflödet då de kommer att vara klara för användning i flödeskammaren analysen.
  3. För att bereda odlingsskål som kommer att användas i flödeskammaren (se avsnitt 5), tillsätt 1 ml av en 10 | ig / ml fibronektin och 0,05% (vikt / volym) gelatin till en 35 mm vävnadsodlingsskål och pipetten flera gånger för att till att hela plattans yta är belagd. Avlägsna den överdrivna fibronektin och gelatinlösning och lufttorka plattan under minst 30 min för att optimera proteinmatrisbildning. Den fibronectin och gelatinlösningen kan återanvändas upp till 10x.
  4. Skörda HUVEC cellerna från steg 2.2 med hjälp av trypsin-EDTA enligt steg 1,5-1,7. Seed 500.000 celler i varje belagd vävnadsodlingsskål. Lägg 2 ml tillväxtmedium i varje skål och inkubera vid 37 ° C / 5% CO2.
  5. Låt celler växa till konfluens såsom i steg 2,2. Celler ska inspekteras visuellt dagligen med medel förändringar varannan dag. Innan flödeskammaren assay, prime HUVEC med 20 ng / ml human TNF-α till 4-6 h för att uppreglera och stimulera adhesionsmolekylexpression.

3. Renat ligand Coating

  1. Rita en cirkel på 0,5 cm i diameter med en markör eller penna i mitten av en 35 mm vävnadsodlingsskål.
  2. Plate 20 | il av 20 | ig / ml protein A i det markerade området. Använd pipettspetsen för att sprida protein A-lösning för att täcka hela det område inom cirkel 0,5 cm i diameter. Det är viktigt att inte röra eller repa ytan på dish. Inkubera vid 37 ° C under 1 timme.
  3. Tvätta protein A-belagda plattan 3 x med 1 ml PBS (pH 8,0).
  4. Plate 50 pl 1% BSA i det markerade området för att blockera icke-specifik bindning på plattan. Inkubera i 2 h vid 4 ° C.
  5. Tvätta de blockerade plattan 3 x med 1 ml PBS som i steg 3,3.
  6. Förbered Fc-adhesion receptorligand chimära proteinlösningar för beläggning. I detta experiment en ICAM-1/Fc chimären lösning vid 25 | ig / ml och en P-Selectin/Fc chimären vid 0,5 | ig / ml i PBS (pH 8,0) användes.
  7. Coat det markerade området med 50 pl substrat. Inkubera över natten vid 4 ° C. Skålen bör användas inom två dagar och det belagda området bör inte tillåtas att torka ut. Lägg PBS om så är nödvändigt för att upprätthålla den 50 | il lösning på plattan.

4. Neutrofila Separation (Alla steg utförs vid rumstemperatur)

  1. Efter att inhämta informerat samtycke, samla deltagare blod genom flebotomi i enn antikoagulerande provröret eller vacutainer (EDTA eller heparin). Efter blod, späda blodet 1:1 med PBS före separationen.
  2. Förbered en två lager Ficoll för att separera PBMC och neutrofiler i 50 ml centrifugrör. Först till 15 ml tung Ficoll (se lista över material, ρ = 1,118 till 1,120), och sedan försiktigt lagret 10 ml ljus Ficoll (se lista över material, ρ = 1,077-1,080) ovanpå den tunga Ficoll. Det bör finnas en skarp gräns mellan ljus Ficoll och tunga Ficoll lager. Slutligen noggrant skiktet 25 ml av det utspädda blodprovet ovanpå den ljus Ficoll utan att störa den Ficoll-skiktet.
  3. Centrifugera röret vid 250 xg under 30 min vid rumstemperatur. Obs: Bromscentrifug rotorn skall vara av för dessa snurrar för att minimera eventuella störningar av cellseparation under rotor inbromsning i slutet av centrifugering. Efter centrifugering, följande skikt (från topp till botten) finns närvarande: det översta lagret är plasma följanwed av PBMC-skiktet ovanpå det ljus Ficoll skiktet är den neutrofila lagret med få röda blodkroppar (RBC) mellan den lätta och tunga Ficoll följt av tung Ficoll skiktet och de röda blodkropparna i botten av röret.
  4. Harvest och överföra den neutrofila skiktet in i ett nytt 50 ml rör med en överföringspipett, till PBS till en slutlig volym av 50 ml och centrifugera vid 225 xg under 10 min vid rumstemperatur.
    1. Efter centrifugering, kan det fortfarande finnas RBCs blandats med neutrofiler. Aspirera supernatanten ner till 10 ml-markeringen. Resuspendera neutrofila-RBC pellets genom försiktig skakning av röret (eller en kort låg hastighet vortex) och sedan tvätta igen med 50 ml PBS.
  5. Efter den andra tvätten, aspirera supernatanten. För att ta bort kontaminerande röda blodkropparna, resuspendera pelleterat cellerna i återstående PBS genom agitation (eller kort vortex), tillsätt 25 ml H2O och försiktigt skaka i 10 sekunder för att lysera RBC.
    1. Tillsätt 25 ml 1,8% NaCl och omedelbart blandagenom centrifugering vid 225 x g under 10 min vid rumstemperatur. Den kontaminerande RBC bör nu lyseras lämnade ett vitt neutrofil cellpelleten.
  6. Tvätta neutrofila cellpelleten med PBS.
  7. Resuspendera isolerade neutrofiler i RPMI-medium med 10% FBS och bestämma cellkoncentrationen under ljusmikroskop med en hemocytometer.
  8. Justera celldensiteten till 500.000 celler / ml med komplett RPMI-10% FBS-medium.

5. Flödeskammare Adhesion Assay

  1. Montera flödeskammaren. Placera 35 mm maträtt som innehåller de sammanflytande HUVECs eller renade vidhäftningsreceptorligander på mikroskopbordet. Anslut den parallella platt flöde kammare med sprutpump, vakuumsystemet och lämna en linje öppen för neutrofila ingång. Sätt i flödeskammaren på toppen av plattan och fäst flödeskammarenheten 13. (Se figur 1)
  2. Starta videoinspelning programmet på datorn ansluten to mikroskopet. Justera området och fokus mikroskop tills en klar fält med fullvuxna HUVEC celler eller ett område inom liganden beläggning regionen är synlig.
  3. Med användning av sprutpumpen, skölj flödeskammaren med RPMI-medium. Se till att det inte finns några luftbubblor i kammaren eller neutrofila inmatningsraden.
  4. Om så önskas kan de neutrofiler primas med låg dos (10 -8 M) fMLP för 10 min. Detta kommer att medge en matchning av den basala nivån av neutrofil aktivering mellan olika givare 14.
  5. Använd sprutpump för att injicera de neutrofiler in i flödeskammaren vid definierade hastigheter (en hastighet av 350 ul / min, vilket motsvarar en skjuvspänning av 1,5 dyn / cm 2 används i denna studie). Spela in video. Eftersom neutrofiladhesion kan ske snabbt, är oftast tillräckligt för att kvantifiera vidhäftnings händelser för analys en video med en längd på 4-5 min.
  6. Ett vidhäftande cell definieras som en cell som rör sig mindre än en celldiameterinom 5 sekunder på HUVEC eller liganden belagd yta 15,16. Räkna antalet vidhäftande celler i det område som är närvarande i den inspelade videon med användning av denna regel. Genom att spela liknande längd filmer med olika givar neutrofil, kan man beräkna den vidhäftande celler / min för att jämföra de vidhäftningsegenskaper mellan olika givare.

Representative Results

Exempel på neutrofil bindning till en renad ligand (ICAM-1/P-Selectin) belagda flödeskammare (figur 2) eller av neutrofil-bindning till ett HUVEC belagd flödeskammare analys (fig. 3) är visade. Såsom visas i figurerna, neutrofiler fortsätta att ackumuleras / vidhäfta till den belagda ytan eller HUVEC under betingelser av kontinuerligt flöde. Under våra typiska experimentförhållanden, kan vi konstatera 50-70 humana neutrofiler ordentligt ansluter sig till den belagda ytan eller HUVEC under en fyra minuters inspelning perioden. Men alleliska varianter av neutrofila adhesionsmolekyler, allelvarianter i underlaget (renad ligand eller HUVEC), väsentligt kan förändra kvantitativ neutrofiladhesion 14.

Vi har även utvärderat tidsberoendet av neutrofil adhesion händelser som observerades i våra studier. Medan vi upprätthålla konstanta flödesförhållanden, är det möjligt att de vidhäftande egenskaperna hos de celler som förändras över tiden. However, under relativt korta tidsförlopp i våra studier, att vi inte ser några konsekventa skillnader i graden av vidhäftning med tiden. Till exempel bedömer vidhäftning på 1-2 minuters tidpunkter jämfört med adhesion observeras mellan 3-4 min tidpunkter är inte konsekvent annorlunda. Självklart, om cellerna stimuleras under vidhäftning experiment förändras då i adhesiva egenskaper över tid kunde förväntas.

I våra studier, kontrollerade vi för isolering inducerad neutrofil aktivering genom avsikt priming cellerna med låg dos fMLP (10 -8 M) i 10 minuter innan för att studera. Endotelceller (HUVEC i våra studier) kräver också innan aktivering för att uppreglera adhesionsmolekylexpression för optimal leukocyter fast adhesion. I frånvaro av förbehandling, kommer endotelceller (HUVEC) stödjer mycket lite neutrofiladhesion. I våra studier har vi använt 10 ng / ml TNFa-behandling för 4-6 tim före användning. IL-1β (10 ng / ml) och LPS (0,5 till 1 pg / ml) kan även användas för att i förväg aktivera endotelceller. Viktigt kan obehandlad HUVEC användas som negativ kontroll för att säkerställa att cellvidhäftning orsakas av specifik (receptormedierade) neutrofil-endotel-cell-interaktioner. Alternativt kan anti-receptor-antikroppar användas för att blockera särskilda receptorer för att bedöma specificiteten av vidhäftning.

Figur 1
Konfiguration Figur 1. Flödes kammare på mikroskop scenen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

oad/51410/51410fig2.jpg "/>
. Figur 2 Skärmbilder från ett urval video av neutrofiler fastnar på ICAM-1/P-Selectin belagda ytan vid olika tidpunkter (A: 0 tidpunkt, B: 1 min tidspunkt, C: 2 min tidspunkt, och D: 4 min tidpunkt). Koncentrationen av ICAM-1 är 25 | ig / ml och P-selektin är 0,5 ug / ml. Neutrofil flödeshastighet är 350 l / min med neutrofila densitet vid 500.000 celler / ml.

Figur 3
. Figur 3 Skärmbilder från ett prov video från neutrofiler som vidhäftar till HUVEC belagda ytan vid olika tidpunkter (A: 0 tidpunkt, B: 1 min tidpunkt, C: 2 min tidpunkt, och D: 4 min tidpunkt).Neutrofil flödeshastighet är 350 l / ml med neutrofila densitet vid 500.000 celler / ml.

Arter Plats Skjuvspänning (dyn / cm 2)
Humant Gemensam caroid artär 11,6
Humant Branchial artär 6,5
Humant Gemensam femoralartären 4,3
Humant Suprarenal aorta 7,3
Humant Supraceliac aorta 4,2
Humant Ytlig fermoral artär 4,4
Humant Venoler 0,5-5,0
Humant Retinal första arterioler 40,2
Humant Retinal andra arterioler 0,001
Humant Retinal första venoler 23,2
Humant Retinal andra venoler 0,43
Hund Gemensam caroid artär 15,8
Kanin Gemensam caroid artär 23,3
Råtta Gemensam caroid artär 46,6
Mus Gemensam caroid artär 64,8
Hund Gemensam femoralartären 9,8
Kanin Gemensam femoralartären 156,8
Råtta Gemensam femoralartären 65,9

Tabell 1. Prov skjuvspänning i olika organ och olika arter.

* Sammanfattade från referenserna 13, 16, 19 och 20.

Discussion

Detta protokoll styr separation och isolering av minimalt aktiverade neutrofiler för noggrann kvantifiering av neutrofiladhesion i ren stress villkor. Neutrofiladhesion är en kritisk process i inflammation. Eftersom genetiska varianter i flera molekyler i denna process har visat sig predisponera för utvecklingen av autoimmuna sjukdomar 1,2, är ett analyssystem som kan kvantitativt bedöma human neutrofil fast vidhäftning krävs. Den metod som beskrivs i detta protokoll möjliggör noggrann och kvantitativ bestämning av fast vidhäftande potential neutrofiler i en kontrollerad miljö in vitro under ren stress. Denna metod gör därmed direkt jämförelse av kvantitativa neutrofiladhesion mellan genotypade individer för att avgöra betydelsen av genetisk variation i adhesionsmolekyler 14.

Flera steg i denna metod förtjänar noggrant övervägande för att achieve mycket kvantitativa och reproducerbara resultat. I HUVEC förberedelser, är det viktigt att uppnå 100% cellsammanflödet innan du använder dem i flödet kammaren. För att använda ytor belagda med renad ligand, bör substratet behandlade ytan aldrig tillåtas att torka ut för att undvika denaturering av liganden. Dessutom är framställningen av humana neutrofiler kritisk för framgången för experimentet. Viktiga frågor i isolera neutrofiler från blodet inkluderar försiktigt hantering genom att minimera vortex för att undvika aktivering, hålla cellerna vid rumstemperatur (dvs. blodet inte bör förvaras på is och centrifugeringssteg bör utföras vid rumstemperatur) och fylla i isolering och experimentet i den minsta mängden tid som möjligt. Det finns ytterligare neutrofilt isoleringsmetoder som också kan användas för att framställa celler för dessa analyser 17,18.

Ur ett praktiskt perspektiv, vidhäftningsanalyser med användning av nyligen isolerade humana neutrofiler bör initieras inom 3-6 timmar efter deltagare flebotomi. Eftersom neutrofiler är extremt känsliga för hantering, kunde längre tider mellan bloddragningen och användning påverkar analysresultaten. Noggrann bestämning av neutrofil cellkoncentration innan flödet kammare analysen är också nödvändig för att erhålla korrekta och reproducerbara resultat.

Under flödeskammaren analys är det viktigt att övervaka videoinspelning noga för att säkerställa att flödeshastigheten är jämn och det finns ingen turbulens genom hela längden av experimentet. Förändringar i flödeshastigheter eller förekomsten av turbulens skulle kräva att experimentet upprepas. Efter experimentet, är det också viktigt att utvärdera de återstående neutrofiler mikroskopiskt för att säkerställa att neutrofilerna inte klibbar. Hopklumpning på denna punkt skulle tyda på att neutrofilerna har blivit aktiverade som väsentligt skulle kunna förändra neutrofila tätheten under experimentet.

innehåll "> Flödeskammaren skapar en nära homogent ren stressen i kammaren (τ = 6Qμ / (wh 2), där Q = flöde, μ = dynamisk viskositet, och w = bredden av flödet kammaren, h = höjd flödeskammaren 15). I våra studier har vi använt en flödeshastighet av 350 | il / min för neutrofil adhesion, vilket skapar en ren stressen av 1,5 dyn / cm 2 (w = 0,25 cm, H = 0,01 tum, viskositeten hos vatten vid 37 ° C (0,007 pois) användes som en approximation av viskositeten hos RMPI media). För en specifik flödeskammare, kan en förändring av flödeshastigheten för att uppnå olika nivåer av ren spänning för att efterlikna olika fysiologiska betingelser. Typiska fysiologisk skjuvspänning i mänskliga blodkärl kan varierar mellan 0,5 till 5,0 dyn / cm 13,16. Skjuvspänning i andra blodkärl och andra djur i tabell 1 113,16,19 20.

Även om vår metod har fokuserat på studier av vidhäftningen av humana neutrophils är denna metod inte begränsad till neutrofiler och kan lätt appliceras på vidhäftning eller rullande studier av andra celltyper med enkla modifikationer. Dessutom kan substraten i denna metod ändras för olika ändamål.

Även om detta protokoll är lätt att anpassa till olika studier, finns det vissa begränsningar. Protokollet som genomförts här kräver många primära celler för analys. Detta kan hindra analys av primära celler från smådjur. Dessutom kan behovet av att immobilisera renade vidhäftningsliganderna i en aktiv / tillgängliga konforma begränsa intervallet för ligander. Användningen av Fc-fusionsproteiner ökar i hög grad möjligheterna att uppnå ordentlig ligand konforma på plåtytan. Icke desto mindre har vår metod betydande flexibilitet för att möjliggöra kvantitativ analys av vidhäftningshändelser. Dessa studier kommer att betydligt öka vår förståelse av vidhäftnings receptor-ligand-par, och den potentiella funktionen vikten av genetiska varianteri dessa proteiner, i patogenesen av sjukdomar hos människor.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgements

Arbetet sponsras av Lupus Research Institute (NY, NY), NIH P01-AR49084, NIH R21-DA026956 och NIH UL1-TR00165. Vi tackar Dr Robert P. Kimberly för hans fortsatta stöd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin/EDTA Life technologies 25200-056 with Phenol Red
2x Trypsin inhibitor Life technologies R-002-100
35 mm tissue culture dish Corning Inc. 430165 Standard Tissue Culture Treated Surface
75 cm2 tissue culture flask Corning Inc. 430641 Standard Tissue Culture Treated Surface
CCD camera Dage-MTI Model 300T-RC
Cell freezing container  Biocision BCS-045
EBM-2 Lonza Inc. CC-3156 HUVEC growth basal medium
EGM-2 Bulletkit Lonza Inc CC-4176 HUVEC growth factors for basal medium
FBS Life technologies 10082-147 Certified, Heat Inactivated
Gelatin Sigma G9391 from bovine skin
Hemacytometer Fisher scientific 02-671-51B
Fibronectin Sigma F2006 from human plasma
Flow chamber Glyco Tech 31-001 Circular flow chamber for 35 mm dishes
fMLP Sigma 47729
Histopaque-11191 Sigma 11191 Heavy Ficoll
HUVEC Lonza Inc. CC-2517A
ICAM-1 R&D Systems 720-IC Fc chimera
Lymphocyte separation medium Mediatech Inc. 25072CV Light Ficoll
Microscope Zeiss Axiovert 100
RPMI 1640 medium Life technologies 11875 with L-glutamine and Phenol Red
Protein A Sigma P6031 resuspend in PBS
P-Selectin R&D Systems 137-PS Fc chimera
Syringe pump KD Scientific KDS270
TNF-α Life technologies PHC3015 Recombinant Human Protein
Trypan Blue Solution, 0.4% Life technologies 15250-061

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Harley, J. B., et al. Genome-wide association scan in women with systemic lupus erythematosus identifies susceptibility variants. in ITGAM, PXK, KIAA1542 and other. 40, 204-210 (2008).
  2. Kim, K., et al. Variation in the ICAM1-ICAM4-ICAM5 Locus Is Associated with Systemic Lupus Erythematosus Susceptibility in Multiple Ancestry Populations. Ann. Rheum. Diseases. 71, (11), 1809-1814 (2012).
  3. Ley, K. Molecular mechanism of leukocyte recruitment in the inflammatory process. Cardiovasc. Res. 32, (4), 733-742 (1996).
  4. Korthuls, R. J., Anderson, D. C., Granger, D. N. Role of neutrophil-endothelial cell adhesion in inflammatory disorders. J. Crit. Care. 9, (1), 47-71 (1994).
  5. Albelda, S. M., Smith, C. W., Ward, P. A. Adhesion molecules and inflammatory injury. FASEB J. 8, (8), 504-512 (1994).
  6. Smith, C. W., Marlin, S. D., Rothlein, R., Toman, C., Anderson, D. C. Cooperative interactions of LFA-1 and Mac-1 with intercellular adhesion molecule-1 in facilitating adherence and transendothelial migration of human neutrophils in vitro. J. Clin. Invest. 83, (6), 2008-2017 (1989).
  7. Marlin, S. D., Springer, T. A. Purified intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) is a ligand for lymphocyte function-associated antigen. Cell. 51, (5), 813-819 (1987).
  8. Lawrence, M. B., Springer, T. A. Leukocytes roll on a selectin at physiologic flow rates: Distinction from and prerequisite for adhesion through integrins. Cell. 65, (5), 859-873 (1991).
  9. Smith, C. W. Possible steps involved in the transition to stationary adhesion of rolling neutrophils: A brief review. Microcirculation. 7, 385-394 (2000).
  10. Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y., Chien, S., Skalak, R. Design and construction of a linear shear stress flow chamber. Ann. Biomed. Eng. 21, (1), 77-83 (1993).
  11. van Kooten, T. G., Schakenraad, J. M., Vander Mei, H. C., Busscher, H. J. Development and use of a parallel-plate flow chamber for studying cellular adhesion to solid surfaces. J. Biomed. Mater. Res. 26, (6), 725-738 (1992).
  12. Munn, L. L., Melder, R. J., Jain, R. K. Analysis of cell flow in the parallel plate flow chamber: Implications for cell capture studies. Biophys. J. 67, 889-895 (1994).
  13. Kucik, D. F. Measurement of Adhesion Under Flow Conditions. Current Protocols in Cell Biology. 9.6.1-9.6.10 (2003).
  14. Zhou, Y., et al. Multiple Lupus Associated ITGAM Variants Alter Mac-1 Function on Neutrophils. Arthritis. Rheum. (2013).
  15. Bacabac, R. G., et al. Dynamic shear stress in parallel-plate flow chambers. J. Biomech. 38, (1), 159-167 (2005).
  16. Kucik, D. F., Wu, C. Cell-Adhesion Assay. Methods in Molecular Biology. 294, 43-54 (2005).
  17. Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed,, Goosmann, U., C,, Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. J Vis Exp. 36, (36), (2010).
  18. Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J Vis Exp. (17), 745 (2008).
  19. Cheng, C., et al. Large variations in absolute wall shear stress levels within one species and between species. Atherosclerosis. 195, (2), 225-235 (2007).
  20. Nagaoka, T., Yoshida, A. Noninvasive evaluation of wall shear stress on retinal microcirculation in humans. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, (3), 1113-1119 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics