定量蛋白质组学使用还原二甲基化的稳定同位素标记

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

肽的还原性二甲基化(REDI标签)稳定同位素标记是一种快速,廉价的战略精确质谱为基础的定量蛋白质组学。这里我们展示了一个可靠的方法用于制备使用可以应用于几乎任何类型的样品中的Redi途径的蛋白质混合物的分析。

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Tolonen, A. C., Haas, W. Quantitative Proteomics Using Reductive Dimethylation for Stable Isotope Labeling. J. Vis. Exp. (89), e51416, doi:10.3791/51416 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

肽通过还原二甲基化(REDI标签)的稳定同位素标记的方法来准确地量化用质谱样品之间蛋白表达的差异。无论是使用常规(光)或氘(重)形式的甲醛和氰基硼氢化钠加两个甲基对每个游离胺进行REDI标签。在这里,我们展示了一个强大的协议REDI标签和复杂的蛋白质混合物的定量比较。蛋白样品用于比较被消化成肽,标记为运载轻或重的甲基标签,混合,并通过LC-MS/MS共同分析。相对的蛋白丰度,通过比较构成的肽从全MS谱中提取的重链和轻标记版本的离子色谱图的峰面积进行定量。此处描述的方法包括用反相固相萃取的样品制备,肽柱上的Redi贴标,通过碱性pH转肽分馏ersed相(BPRP)层析,并StageTip肽纯化。我们讨论REDI标签的优点和局限性相对于其它方法稳定同位素掺入。我们使用REDI标签作为一种快速,廉价,准确的方法,在几乎任何类型的样品的比较蛋白质丰度突出创新应用。

Introduction

测量复杂样品间的许多蛋白质​​的浓度差异是在蛋白质组学面临的核心挑战。越来越多地,这是由标记蛋白在每个样品中不同的同位素标记,结合样品,并用质谱定量浓度差异进行。蛋白质和多肽的稳定同位素标记的方法有几种。15 N标记12 SILAC 在体内引入同位素标记的代谢,而ICAT 3的iTRAQ 4,和二甲基化减少5蛋白的提取和消化后添加稳定同位素标记。在这些方法中,还原的二甲基化(雷迪标签)正逐渐成为一种廉价的,可再现的方法来量化在几乎任何类型的样品的蛋白质浓度差异。

雷迪标记包括使肽与甲醛以形成席夫碱,然后将其减压通过氰基。这种反应dimethylates上的N-末端和赖氨酸侧链和monomethylates N-末端脯氨酸游离氨基。这里所描述的协议甲基化的肽中的样品1使用的试剂与氢原子在其天然同位素分布和样品2使用氘化的甲醛和氰基硼氢化( 图1)一个“重”标签的“光”的标签。关于在6.0377沓轻质和重质的形式,它是采用利用质谱仪的两种形式之间进行区分之间的质量差异的肽的结果各二甲基化的氨基。具体而言,相对于肽的丰度定量为MS1的提取离子色谱图区域的光的比率(MS1峰面积之比)和重版本的每个肽的离子对。一个蛋白的相对丰度的计算方法中的所有蛋白肽中的中位数MS1峰面积之比。在这份报告中,我们描述了一个强大的协议行为ING雷迪标记实验通过LC-MS/MS,包括反相肽固相萃取,柱上的Redi标签,肽分馏由碱性pH反相(BPRP)层析,并用StageTips肽混合物的纯化( 图2) 。我们讨论使用REDI标记定量蛋白质组学的优点和局限性。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

注:此方法之前描述12。

1,蛋白质分离

制备1毫克细胞蛋白通过裂解细胞,优选通过物理方法如法国压机,珠击,或超声处理。避免溶菌酶介导的细胞溶解,因为这种酶会混淆质谱测量。

2,三氯乙酸沉淀蛋白

加入1倍体积的三氯乙酸(TCA),以4倍体积的冰蛋白和冷却10分钟以沉淀蛋白质。 12,000×g离心5分钟,在4℃下,去除上清。在4℃下重悬沉淀中加入1ml冰冷的丙酮和12,000×g离心5分钟去除上清,颠倒离心管在板凳上,以干燥沉淀15分钟。店铺蛋白小球于-80℃。

3,使蛋白质变性和还原二硫键

回复暂停蛋白质〜2 mg / ml的500微升变性和还原缓冲液(或者4M尿素或3%SDS的50mM HEPES pH值为8.5,5mM DTT的)。任选地,包括在缓冲液中的蛋白酶抑制剂。孵育蛋白30分钟,在56℃,然后在室温下10分钟。

4。Aklylate游离巯基,以不可逆扰乱二硫键形成

水准备新鲜0.3M的碘乙酰胺。注意!碘乙酰胺是剧毒。加入25微升0.3M的碘乙酰胺(15mM的终浓度),以500μl的蛋白孵育20分钟在黑暗中在室温下进行。通过加入10μl的300mM的DTT(5mM的终浓度DTT)淬灭碘乙酰胺。存储烷基化的蛋白质于-80℃。

5,蛋白质的消化

TCA沉淀的蛋白质(如步骤2中所述),并重新悬浮于1ml的50mM HEPES(pH值8.2),1M尿素。准备赖氨酰endoprotein的原液酶(赖氨酸-C)在水中的2微克/微升的浓度,并添加5微升的蛋白质溶液。为16小时,在室温下孵育混合物。确保最终的赖氨酸-C浓度为10纳克/微升和蛋白质对lysC的比率(W / W)为1/50至1/200。重悬20微克测序级胰蛋白酶在40微升50mM的乙酸中,添加5微升(10微克胰蛋白酶)对赖氨酸-C消化物,并孵育6小时,在37℃下使用相同浓度的蛋白酶和蛋白酶与蛋白质的比例为赖氨酸-C作为用于胰蛋白酶。

6,反相肽提取

  1. 通过加入三氟乙酸(TFA)至0.5%的最终浓度(pH≈2)酸化肽。附加C18柱,以提取歧管。除了使用肽的装载和洗脱尽可能高的流速所有步骤。
  2. 湿塔用6ml乙腈(ACN)。用6ml 80%ACN,0.1%TFA洗柱,然后平衡用6毫升的0.1%TFA。不要让列步骤之间的干运行。
  3. 停止真空压力和负载500的肽的微克到柱上以大约1毫升/分钟的流速。一旦肽已结合在柱上,重新启动真空和洗涤用6ml 0.1%TFA,然后用3毫升的柠檬酸缓冲液(0.09M的柠檬酸,0.23,1M的Na 2 HPO 4,pH 5.5)中。
    注意:较高的肽量可以被标记,但C18柱结合能力至少应为2倍左右的肽量更高,以避免样品损失。

7,柱头肽标记通过还原二甲基化(REDI标签)

如氰化氢在贴标过程中释放在低浓度下,化学罩执行此步骤。

  1. 准备将12ml“轻”和“重”REDI缓冲区,以甲基化肽的游离胺。光REDI缓冲由0.8%甲醛和0.12 M氰基硼氢化钠携带氢在日EIR天然同位素分布在柠檬酸缓冲液。重REDI缓冲由0.8%氘代甲醛和0.12 M在柠檬酸缓冲液氘代氰基硼氢化钠。
  2. 孵育含有肽柱中加入10ml或者轻或重的Redi缓冲区以1毫升/分钟流速的含肽柱,并重复以确保完整的标签。洗柱用6毫升含0.1%TFA,然后用1毫升0.5%的乙酸。
  3. 停止真空并用1毫升40%ACN,0.5%乙酸,然后用1毫升80%ACN,0.5%乙酸使用约0.5ml /分钟的流速洗脱第一个标记的肽。如果需要,测量单个样品的标记效率通过质谱混合重型和轻型样品前(参见“代表业绩」)。拌1点01重链和轻-标记的肽样品,通过质谱法进行定量。

8,独立的肽混合物用pH值基本反相(BPRP)色谱</ P>

碱性pH值反相(BPRP)层析,肽混合物分离成多个级分,这是通过LC-MS/MS独立地分析,以增加蛋白质的覆盖范围。

  1. 通过施加增加乙腈浓度的梯度在10mM碳酸氢铵(pH8)中的C18-HPLC柱分级分离肽混合物。开始用5%(V / V)乙腈5分钟,加至35%的ACN 60分钟,然后以90%的ACN 1分钟。降低ACN 5%至重新平衡为9分钟的列之前保留在90%ACN 4分钟。收集馏分96等体积在96 - 孔板(A1至H12)。使用UV检测器在220nm处,而肽的洗脱从柱(10-70分钟对这里所描述的条件下)监测分馏。
  2. 从孔A1,C1,E1和G1(级分A1)结合级分,从井B1,D1,F1和H1(馏分B1)中,从井A2,C2,E2和G2(级分A2),并相应的剩余部分。取出瑟尔t使用真空离心机。从馏分重悬肽A1,B2,A3,B4,A5,B6,A7,B8,A9,B10,A11,B12和在130微升的1M urea/0.5%的TFA和纯化,如步骤9中所述使用StageTips。店级分B1,A2,B3,A4,B5,A6,B7,A8,B9,A10,B11,A12和在-20℃。

9。净化肽由走走停停萃取(StageTips)

由包装200微升移液器吸头具有两个磁盘C18为1.07毫米的内径(ID)的制备C18-StageTip 7微柱。把舞台提示到Eppendorf管。使用微量离心与130微升甲醇,然后130 UL 80%ACN,0.5%醋酸冲洗技巧。平衡StageTips用130微升0.1%TFA。转肽混合物以StageTips和洗涤用130微升0.1%TFA,然后加入40μl的0.1%TFA,然后加入40μl乙酸0.5%。第一洗脱的肽用20微升40%乙腈,0.5%乙酸,然后用20微升80%乙腈,0.5%乙酸。合并洗脱液一第二干燥,真空过滤。

10。微细的LC-MS/MS

  1. 溶解肽在1-5微升5%的甲酸,5%乙腈至约1微克/微升的浓度。解决〜1微克的肽上的100微米×20厘米C18-反相HPLC柱,用6-22%乙腈的0.125%甲酸梯度施加在75或100分钟的〜300升/分钟的流速。
  2. 通过使用LTQ的Orbitrap Velos的12或类似的液相色谱-质谱联用平台与质谱仪提供高分辨率和高质量精度鉴定的肽。操作质谱仪的数据依赖模式,在轨道阱分析仪获得了完整的MS扫描(分辨率为60,000)。产生线性离子阱MS / MS谱图在全质谱检测到的20种最丰富的离子。对于MS / MS设置自动增益控制(AGC)的目标,以1×10 6的完整的MS和2000。设置最大的离子积累倍至1,000毫秒对于MS和150毫秒的MS / MS分析。从进一步选择从MS / MS进行20-60秒不包括零碎肽前体离子。

11,MS / MS数据采集

通过使用这些参数( 表1)比较,MS / MS谱图RAW文件到一个理论数据库用算法如SEQUEST 8识别的肽。

表1。肽数据库搜索参数。

常规参数 全胰蛋白酶消化高达2错过分裂
25 ppm的母离子耐受性
1.0大碎片离子耐受性
静态修改 57.02146 Da于半胱氨酸,carboxyamidomethylation
28.03130达赖氨酸和肽的N-末端,光二甲基化标签
动态修改 15.99491达蛋氨酸,氧化
6.03766沓上赖氨酸和肽的N-末端,重二甲基化标签
  1. 滤波器的肽使用的开放阅读框架的一个数据库中的实际和扭转方向1%的错误发现率的方法,如目标诱饵9策略。

12。肽定量

计算重型和轻型双MS1的领域提取离子色谱(MS1峰面积)和肽信噪(S / N)比10。包括肽对只有当他们的平均信号 - 河内SE比上述五。量化的肽的相对丰度的两个样本为相同的肽(MS1峰面积比)的重链和轻版本MS1峰面积的比值在。计算的相对丰度蛋白的中位数MS1峰面积比为在该蛋白质的所有肽。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

我们使用酿酒酵母评估的准确度,精密度和雷迪标记的再现性和梭菌C.phytofermentans中全细胞裂解液。我们首先量化C的组合的REDI标记效率C.phytofermentans中的蛋白裂解物纤维素(重标记,H)和葡萄糖(光标签,L)的培养。当过滤,以1%的肽假发现率,该样品含有具有98%的Redi标记效率11194独特的肽序列。未分离S。酵母蛋白溶胞产物同样标记用H或L试剂,混合各种比例,并进行分析。蛋白质表达的差异(对数2(中位MS1峰面积)),可重复地反映在其中H和L的样品在大范围的混合比例( 图3)的混合比率。具体而言,99%的蛋白质的倍数变化被测量为小于1.6倍的较小为1:1的混合样品。在1:10至10:1的样品,99%的蛋白质均在3.8倍的预期的比例,表示在从1:1混合物更大的距离的增加而标准偏差。当雷迪标签施加到梭菌C.phytofermentans中蛋白质组,我们量化超过2000的蛋白质与内2倍水平的复制培养于葡萄糖( 图4A)生长测定94%的蛋白质。蛋白质折叠重复对文化的改变(葡萄糖对纤维素)也高度相关(r 2 = 0.82)( 4B)。S。 酵母比较( 图3)是一个单一的文化,从而显示技术的REDI基础的定量蛋白质组学的重现性。C. C.phytofermentans中测量( 图4A,B)比较复制的文化如此表达的差异同时代表测量误差和文化之间的生物学差异。总之,这些实验目支持REDI蛋白质组学是一种准确,重复性好方法来量化复杂样品间的表达差异。

图1
图1:使用重型和轻型试剂dimethylate游离胺肽的还原二甲基化标记重与轻的试剂相同的肽具有每游离胺一6.0377大质量转变。此处所示的肽都在N-末端和赖氨酸侧链被标记。图片摘自参考11。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2。概述协议,用于定量蛋白质组学通过还原二甲基化的。红色数字上面箭头对应于在协议中所述的步骤。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3。评估使用酿酒酵母全细胞裂解液REDI标签 。从一个单一的文化样品标记与任何重链(H)和轻(L)试剂,混合不同比例(1H:10L,1H:5L,1H:2L,1H:1L,2H:1L,5H:1L,和10H:1L)和H和L个样本之间蛋白质的差异进行量化为log 2位数MS1的峰面积比(日志2 H / L比)。线性趋势线通过所有数据的R2值点为0.96(黑线);皮尔逊相关系数为0.98。置信界限(红线)显示,从趋势线的绝对垂直距离在其中发现每个样本95%的数据点。图片摘自参考12。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4
图4。定量REDI标记梭菌C.phytofermentans中的蛋白质从文化的不同碳源增长。 A)在葡萄糖文化相对一个到复制葡萄糖文化,一种半纤维素的文化和文化的纤维素蛋白的表达。葡萄糖 - 葡萄糖(94%),葡萄糖 - 半纤维素(80%),和glucos:内有两个水平表达的蛋白质的级分E-纤维素(49%),B)折叠变化,蛋白表达对葡萄糖对纤维素的文化是高度相关(r 2 = 0.82)重复对文化的。改编自参考12的图像。 请点击此处查看此图的放大版本。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

几点让使用还原二甲基化(REDI标签)一个有吸引力的方法,定量蛋白质组学肽的稳定同位素标记:物美价廉标记试剂(试剂成本低于1美元的样品),反应速度快(〜10分钟),无副产物,高再现性( 图3,4),稳定的反应产物,能够使用任何蛋白酶,和标记的肽的高电离效率。由雷迪化学标记也是有利的相对于代谢标记,因为它不需要株或细胞系具有特定氨基酸营养缺陷型或生长在合成培养基中。因此,雷迪可应用于几乎任何类型的蛋白质样品,包括新颖的微生物12的量很少的突变菌株可13和人类干细胞14,其中包括15。

REDI标签的限制是相对复样本,​​以一个加时赛能力较低她的方法,例如等压标记( 例如 ,的iTRAQ或TMT),为此,目前多达8个样本可以同时量化16。我们在这里描述的方法可以让两个不同标记样本的定量比较。甲醛和氰基硼氢化额外同位素的组合可用于产生最多3个标签,该相差至少4沓17和雷迪标签最近被扩展到5复用样品18。 REDI标签的另一个挑战是,氘化肽前稍微轻的用反相色谱时洗脱。为了控制这种“氘效应”,肽的定量应始终基于整个的提取离子色谱,而不是从一个扫描强度(MS1峰面积)。

这里所描述的REDI蛋白质组学协议包括由于减少二甲基标记的第一个描述做了许多改进11,15,17肽质谱分析5。我们描述了“在溶液中”的“柱头”标记方法允许更高的肽量和标记效率可以样品混合之前进行验证,但和“在线”的标记方法以及存在19。除了 ​​蛋白质定量,雷迪标签被施加于同种型确定20,并且可以与其它方法组合以分析翻译后修饰,如磷酸化乙酰11,18 21,和糖基化位22。由于它的多功能性和价格低廉,定量化学,REDI标签将被越来越多地应用于定量蛋白质组学在新的和令人兴奋的方式。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

作者宣称没有竞争的经济利益或其他的利益冲突。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trichloroacetic acid Sigma-Aldrich T9159 protein precipitation
Acetone Sigma-Aldrich 650501 protein precipitation
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich 71736 denature, reduce protein
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S8045 denature, reduce protein
DL-Dithiothreitol Sigma-Aldrich 43816 denature, reduce, alkylate protein
Protease Inhibitor Complete Mini Cocktail Roche 4693124001 denature, reduce protein
Iodoacetamide Sigma-Aldrich I6125 alkylate protein
HEPES Sigma-Aldrich H7523 resuspend, extract, label protein
Calcium chloride Sigma-Aldrich C5670 resuspend protein
Lysyl Endoprotease Wako Chemicals 129-02541 protein digestion
Sequencing grade trypsin Promega V5111 protein digestion
Acetic acid Sigma-Aldrich 320099 protein digestion
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich 299537 Reversed-phase peptide extraction
tC18 Sep-Pak C18 cartridges Waters WAT054960 Reversed-phase peptide extraction
Extraction manifold Waters WAT200609 Reversed-phase peptide extraction
Acetonitrile Sigma-Aldrich 14261 various
Formaldehyde Sigma-Aldrich 252549 “light” peptide labeling
Cyanoborohydride Sigma-Aldrich 71435 “light” peptide labeling
Deuterated formaldehyde Sigma-Aldrich 492620 “heavy” peptide labeling
Sodium cyanoborodeuteride CDN isotopes D-1797 “heavy” peptide labeling
MES Sigma-Aldrich M3671 peptide labeling
C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 µm particle size) Agilent 770450-902 basic pH reversed-phase chromatography
Formic acid Sigma-Aldrich 399388 various
C18 Empore Disks 3M 14-386-3  STAGE tips
Methanol Sigma-Aldrich 494437 STAGE tips

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Washburn, M. P., Ulaszek, R., Deciu, C., Schieltz, D. M., Yates III, J. R. Analysis of quantitative proteomic data generated via multidimensional protein identification technology. Analytical chemistry. 74, (7), 1650-1657 (2002).
  2. Ong, S. -E., Blagoev, B., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & cellular proteomics: MCP. 1, (5), 376-386 (2002).
  3. Gygi, S. P., Rist, B., Gerber, S. A., Turecek, F., Gelb, M. H., Aebersold, R. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nature biotechnology. 17, (10), 994-999 (1999).
  4. Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Molecular & cellular proteomics: MCP. 3, (12), 1154-1169 (2004).
  5. Hsu, J. -L., Huang, S. -Y., Chow, N. -H., Chen, S. -H. Stable-isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Analytical Chemistry. 75, (24), 6843-6852 (2003).
  6. Chick, J. M., Haynes, P. A., Molloy, M. P., Bjellqvist, B., Baker, M. S., Len, A. C. L. Characterization of the rat liver membrane proteome using peptide immobilized pH gradient isoelectric focusing. Journal of Proteome Research. 7, (3), 1036-1045 (2008).
  7. Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Analytical chemistry. 75, (3), 663-670 (2003).
  8. Eng, J. K., McCormack, A. L., Yates III, J. R. An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 5, (11), 976-989 (1994).
  9. Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nature methods. 4, (3), 207-214 (2007).
  10. Bakalarski, C. E., et al. The impact of peptide abundance and dynamic range on stable-isotope-based quantitative proteomic analyses. Journal of Proteome Research. 7, (11), 4756-4765 (2008).
  11. Wilson-Grady, J. T., Haas, W., Gygi, S. P. Quantitative comparison of the fasted and re-fed mouse liver phosphoproteomes using lower pH reductive dimethylation. Methods (San Diego, Calif.). (2013).
  12. Tolonen, A. C., Haas, W., Chilaka, A. C., Aach, J., Gygi, S. P., Church, G. M. Proteome-wide systems analysis of a cellulosic biofuel-producing microbe. Molecular Systems Biology. 7, 461 (2011).
  13. Tolonen, A. C., Chilaka, A. C., Church, G. M. Targeted gene inactivation in Clostridium phytofermentans shows that cellulose degradation requires the family 9 hydrolase Cphy3367. Molecular Microbiology. 74, (6), 1300-1313 (2009).
  14. Munoz, J., et al. The quantitative proteomes of human-induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Molecular systems biology. 7, 550 (2011).
  15. Kovanich, D., Cappadona, S., Raijmakers, R., Mohammed, S., Scholten, A., Heck, A. J. R. Applications of stable isotope dimethyl labeling in quantitative proteomics. Analytical and bioanalytical chemistry. 404, (4), 991-1009 (2012).
  16. McAlister, G. C., et al. Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses. Analytical chemistry. 84, (17), 7469-7478 (2012).
  17. Boersema, P. J., Aye, T. T., Van Veen, T. A. B., Heck, A. J. R., Mohammed, S. Triplex protein quantification based on stable isotope labeling by peptide dimethylation applied to cell and tissue lysates. Proteomics. 8, (22), 4624-4632 (2008).
  18. Wu, Y., et al. Five-plex isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Chemical communications (Cambridge, England). (2014).
  19. Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4, (4), 484-494 (2009).
  20. She, Y. -M., Rosu-Myles, M., Walrond, L., Cyr, T. D. Quantification of protein isoforms in mesenchymal stem cells by reductive dimethylation of lysines in intact proteins. Proteomics. 12, (3), 369-379 (2012).
  21. Chen, S. -H., Chen, C. -R., Chen, S. -H., Li, D. -T., Hsu, J. -L. Improved N(α)-acetylated Peptide Enrichment Following Dimethyl Labeling and SCX. Journal of proteome research. 12, (7), 3277-3287 (2013).
  22. Sun, Z., et al. Capture and Dimethyl Labeling of Glycopeptides on Hydrazide Beads for Quantitative Glycoproteomics Analysis. Analytical Chemistry. 84, (20), 8452-8456 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics