En våglängd Shadow avbildning av

Engineering
 

Summary

Tekniken presenteras här mäter banan av fritt simmar mikroskopiska arter med hjälp av en enda våglängd exponering. C. elegans används för att demonstrera skugga avbildning som ett billigt alternativ till dyra mikroskop. Denna teknik kan anpassas till olika riktlinjer, miljöer och arter för att mäta riktning, hastighet, acceleration och krafter.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jago, A., Kpulun, T., Raley-Susman, K. M., Magnes, J. Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates. J. Vis. Exp. (86), e51424, doi:10.3791/51424 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Denna studie visar en billig och okomplicerad teknik som tillåter mätning av fysikaliska egenskaper, såsom läge, hastighet, acceleration och krafter som är involverade i motoriskt beteende hos nematoder som är suspenderade i en vattenpelare som svar på enkla ljusvåglängder. Vi visar hur man ska utvärdera förflyttning av en mikroskopisk organism med hjälp En våglängd Shadow Imaging (SWSI) med hjälp av två olika exempel.

Det första exemplet är en systematisk och statist livskraftig undersökning av den genomsnittliga nedstigande C. elegans i en vattenpelare. För denna studie använde vi levande och döda vildtyp C. elegans. När vi jämförde hastigheten och riktningen av nematod aktiv rörelse med den passiva härkomst av döda maskar i gravitationsfältet, visade studien ingen skillnad i härkomst-tider. Den genomsnittliga härkomst var 1,5 mm / s ± 0,1 mm / sek för både levande och döda maskar som använder 633 nm sammanhängandeljus.

Det andra exemplet är en fallstudie av välja enskilda C. elegans ändrar riktning under nedstigningen i en vertikal vattenpelare. Acceleration och kraft analyseras i detta exempel. Denna fallstudie visar omfattningen av andra fysikaliska egenskaper som kan utvärderas med hjälp av SWSI samtidigt utvärdera beteendet med hjälp av enskilda våglängder i en miljö som inte är tillgänglig med traditionella mikroskop. Med hjälp av denna analys som vi uppskattat en individuell nematod kan stack med en kraft på över 28 nN.

Våra resultat tyder på att levande nematoder utövar 28 nN när du svänger, eller rör sig mot gravitationsfältet. Resultaten tyder vidare att nematoder passivt ner i en vattenpelare, men kan aktivt motstå gravitationen i första hand genom att vrida riktningen.

Introduction

Caenorhabditis elegans är en fritt levande välgörande jord nematod som är ett kraftfullt modellorganism för att studera mekanismer för genreglering, utveckling och på senare tid för att förstå sensorisk biologi och beteende. Trots att bara 302 nervceller, C. elegans klarar av komplexa motoriskt mönster, fortplantningsbeteenden, navigation, kemotaxi och många andra beteenden. C. elegans besitter mekanoreceptorer, chemoreceptors och även upptäcka blå våglängder av ljus (Ward et al., 2008) 1. Även om mycket är känt om de neurala kretsar av sensomotorisk funktion och allmänna motoriskt mönster i C. elegans, mindre är känt om svaren på multipla, samtidiga stimuli eller mer komplexa miljöförhållanden än vad som kan modelleras i mikroskop. Några studier har visat mer komplexa motoriskt mönster som är mycket plast 2,3,4. Vår metodologi möjliggör studier av nematodes i lösning i realtid där vi lätt kan ge flera miljöförhållanden samtidigt. Denna fråga är svår att behandla med konventionella mikroskop baserade avbildningstekniker. Vi har utvecklat en bildteknik som gör att vi kan placera nematoder i en vattenpelare för att undersöka motoriskt beteende, samt fastställa möjligheterna för nematoder ändra förflyttning som svar på olika miljöförhållanden.

En våglängd Shadow Imaging (SWSI) presenteras i denna rapport för första gången att ta itu med bristerna i traditionella mikroskop. Traditionella mikroskop är begränsade att observera arter i ett horisontellt fokalplan några mikrometer i djup 5,6. När det gäller enstaka våglängd studier, de flesta traditionella mikroskop använder färgfilter för att filtrera vitt ljus väldigt brett, oftast, 50-100 nm. Med användning av en laser för SWSI smalnar våglängdsselektering till mindre än 1 nm under bibehållande teckenificant ljusintensitet 7. På liknande sätt har enstaka våglängder använts för att mäta simning frekvenser av C. elegans i realtid 8.

För det första demonstration av vår metod, övervakar vi horisontellt läge, x, och den vertikala positionen, y, av ett fritt simmar C. elegans i en vattenpelare, över ett avstånd på cirka en centimeter. Framför allt är vi intresserade av den vertikala rörelsen eftersom gravitationen fungerar även vertikalt. Lutningen av en linjär anpassning till det vertikala läge som ger den vertikala hastigheten, v y, av nematoden som går ner i vattnet:
Formel (1)

Det kvadratiska medelvärdet av felet (RMSE) 9 indikerar kvaliteten på passform och anger om den fallande hastigheten är i allmänhet konstant. De vertikala hastigheter då medelvärdet för each arter och döda maskar. Med hjälp av dessa resultat, drag, som maskar erfarenhet kan uppskattas.

För det andra demonstration av vår metod, valde vi C. elegans som inte stiger ned med en konstant hastighet till skillnad från de flesta av maskar som observerats. De valda maskar antingen vände och simmade uppåt eller svävade ett tag innan du fortsätter nedstigningen. Fysiskt, visar denna studie att syftet med en swimming mikroorganism kan beräknas. Newtons lagar föreskriver att en kropp som ändrar riktningar accelererar, vilket innebär en nettokraft, Formel 1 , Är att agera på kroppen 10:
Formel 2 (2)

där p ärden linjära drivkraften och t är tid. Accelerationen av masken är direkt proportionell mot den kraft som verkar på snäck eftersom massan av masken förblir konstant. Som ett resultat, är den vertikala nettokraften:
Formel 3 (3)

där m är massan av en mask och en y representerar den vertikala accelerationen. Den nettokraft i vertikal riktning representerar då masken dragkraft i samma riktning. Den totala dragkraften kan beräknas med hjälp av den horisontella komponenten i beaktande.

Protocol

1. C. elegans Framställning

  1. Förbered petri plattor av ung vuxen C. elegans som beskrivits i tidigare experiment med upphävande av C. elegans i en vätskefylld kyvett 11.
  2. På dagen för videoanalys, plocka levande unga vuxna nematoder direkt i en kyvett fylld med avjonat destillerat vatten med användning av en platina pick såsom beskrivs i steg 2.
  3. Förbered döda C. elegans med kloroform exponering. Fortsätt genom att följa det förfarande som beskrivs för att plocka levande nematoder som beskrivs i steg 2.

2. Optisk Inställningar för videoanalys

  1. Montera den experimentuppställning för att skapa skuggbilder som visas i figur 1. Kameran kan placeras på valfritt avstånd från skärmen, så länge som den är i stånd att fånga en vy framifrån av skärmen. En bra plats är intill kyvetten vänd mot skärmen.
    1. Med hjälp av minst två speglar tillstyra den avstämbara helium-neon laser output in galilé strålexpanderare så att strålen expanderas till en diameter av 12 mm.
    2. Placera en eller två små hål i strålbanan så att strålen passerar genom porer utan att hindras. Använd småhål att säkerställa inriktningen bibehålls.
    3. Rikta den expanderade strålen på ett monterat kvartskyvett som är 10 mm bred, 10 mm djup och 4 cm hög.
    4. Förstorings balken med hjälp av en plankonvex lins med en positiv brännvidd på 75 mm.
    5. Placera en filmduk ca 120 cm från linsen. Avstånd som är större än detta kommer att ge en större förstoring av skuggbild. Emellertid kommer bildkvaliteten att minska med en lägre ljusintensitet och en förhöjd noticeability diffraktion interferens.
    6. Placera en höghastighetskamera, som är i stånd att åtminstone 60 fps, precis intill kyvetten vänd mot skärmen.
  2. Placera en dissekera mikroskop nära den optiska uppsättningenupp för snabb överföring av nematoder i kyvetten.
  3. Tillfälligt säkra en transparent linjal med mm divisioner till mitten av kuvettsläden vinkelrätt mot den expanderade strålen så att strålen projekt en förstorad bild av linjalen på skärmen. Ställ skala längden för videoanalys.
    1. På filmduken, markera skalan avstånd med en transparent linjal excentriskt från den projicerade bilden för att undvika att störa projektionen. Klicka här för video.
    2. Spela den här bilden och mäta förstoringen. Ta bort linjalen från installationen. Upprepa detta steg för andra våglängder som vinkeln för ljusbrytning för varje våglängd genom linsen varierar på grund av kromatisk aberration.
  4. Byt kyvetten och fyll den till inom 1 mm från kanten med destillerat vatten.
  5. Börja inspelningen medan rummet ljuset är på, så att skalan avståndet ingår i sammatagningar som den projicerade bilden. Släcka lampan.
  6. Med hjälp av en tunn, tillplattad platinatråd plocka, flytta enskilda unga vuxna C. elegans en åt gången från agarplattan i kyvetten genom att vidröra pick till ytan av vattnet. Den nematod kommer att bli synliga i vattnet när det kommer in i balken på grund av spritt ljus. Klicka här för video.
  7. Film de projicerade bilderna av maskar då de passerar genom den expanderade laserstrålen. Det är viktigt att notera att den projicerade bilden är inverterad och maskarna visas för att röra sig i den motsatta riktningen av sin faktiska rörelse. Maskar som är fallande med allvar ser ut att röra sig uppåt på skärmen (Figur 2).

3. Video Data Preparation

  1. Importera videon till videoanalysprogrammet.
  2. Ställ skalan med förstoringsfaktorn som tidigare bestämts.
  3. Track den linjära förskjutningen av huvudet av den skuggade nematoden med minst 10 datapunkter över hela vägen tas.
  4. Hitta hastigheten i den vertikala riktningen genom att ta derivatan ("Y", "Time") och dividera detta värde med förstoringsfaktorn bestäms i steg 2,2.

4. Dataanalys

  1. Analysera den linjära nedstigande ett C. elegans:
    1. Kontrollera för att se till att datapunkterna på det vertikala läget i förhållande till tid graf bildar i allmänhet en rak linje. Vissa avvikelser kan ignoreras på grund av huvudrörelse för nematoden. Om datapunkterna bildar vanligen en rak linje, fortsätter du till steg 4.1.2, nedstigningen i övrigt är olinjär och analysen bör fortsätta med hjälp av steg 5.1 i detta protokoll.
    2. Skapa en linjär regressionslinje genom att anpassa en rät linje 12 med data från analysmenyn. Lutningen på denna linje är då den vertikala hastigheten på C.elegans. Lutningen är förändringen i positionen dividerat med förändringen i tid över ett visst intervall. Bestäm den fallande hastigheten hos de levande och döda maskar på detta sätt (Figur 3).
    3. Medelvärdet de vertikala simning hastigheter från nematoder. En urvalsstorlek på ca 50 maskar är tillräcklig. Jämför simma hastigheter i levande maskar med drivhastigheter i döda maskar.

5. Analysera Nonlinear Motion av C. elegans

  1. Från avsnitt 3, välja en analyserade videofil, som visar en icke-linjär nedgång i vattenpelaren (Figur 4). En icke-linjär härkomst kan identifieras med hjälp av steg 4.1.1 i detta protokoll.
  2. Välj 'Curve Fit "från" Analys "-menyn i videon analysprogram. Välj en andra order (kvadratisk) polynom. Montera kurvan.
  3. För en region av intresse, justera passformen på grafen genom att skjuta fästena på varje sida of passningen i diagrammet tills kurvan är mycket nära de datapunkter inom passform och / eller väl inom de felstaplar. Beslaget program ger ett matematiskt uttryck för den anpassade kurvan, som är vertikalt läge i förhållande till tiden. Tänk på inpassade kurvan fel som programmet i samband med de fysiska egenskaperna. Ett relativt fel av 15% eller lägre är vanligen acceptabelt.
  4. Lägg mer kurvan passar att täcka ytterligare delar av data. Spline 13 funktionerna för optimal täckning: se till att kurvan passar överlappning och närma angränsande kurvor så att backarna matchen i de överlappande områdena.
  5. Erhåll hastigheten för en region av intresse, genom att ta derivatan av den anpassade kurvan med användning av det matematiska uttrycket som erhölls i steg 5.1.3. Hastigheter kan variera i tiden. Lägg märke till att derivatan är lutningen av en funktion. Derivatet kan erhållas matematiskt eller grafiskt. I detta fall är det praktiskt att använda den givna matematiska expression.
  6. Ta den andra derivatan av de inpassade kurvorna för att erhålla acceleration. Accelerationen kan variera i tiden.
  7. Multiplicera accelerationen genom masken massa för att beräkna den dragkraft, som masken utövar. En rimlig uppskattade massan är 3 mikrogram förutsatt att masken består till största delen av vatten.

Representative Results

Steady Descent

Den första undersökningen visar ingen urskiljbar skillnad i fallande priser i C. elegans under SWSI hjälp av 633 nm. De sjunkande priserna befanns vara konstant vid 1,5 mm / s ± 0,1 mm / sek för både levande och döda C. elegans. En urvalsstorlek på 50 maskar genererade en rimlig varians på 7% för både levande och döda maskar. Det finns ingen acceleration verkar på maskar sedan den nedåtgående hastighet är konstant, så att dragkraften är lika med gravitationskraft minus flytkraften. Detta innebär att densiteten hos masken är något större än den för vatten; emellertid är för uppskattningarna nedan det fortfarande praktiskt att anta att densiteten hos en nematod är ungefär den för vatten.

Ändra ordning

Den andra utredningen, en fallstudie, visar att nematoder är kapabla att ändra riktning och kan simma uppåt mottyngdkraften. Två kurvor anpassades till den vertikala förskjutningen av nematoden så att de andra derivaten av dessa kurvor kan rafflad för att plotta acceleration som funktion av tiden (figur 5).   Det är lämpligt att hålla polynomet ordning så lite som möjligt och samtidigt behålla en bra passform. En lägre polynom ordning visar mindre variation i accelerationen över tiden. De högre ordningens polynom termer kommer att vara försumbar, och därför onödigt, om ordningen på polynomet är för hög. Denna mask retarderar vid en konstant hastighet av 0,110 mm / s 2 ± 0,002 mm / s 2, vänder och accelererar med samma hastighet 0,110 mm / s 2 ± 0,002 mm / s 2 till strax efter vändningen punkten. The C. elegans fortsätter att röra sig uppåt med en minskande acceleration av 1,252-,00708 ton mm / sek 2 tills accelerationen sjunker till noll. Med tanke Eq. 3, och en beräknad mask massa av 3 & #956, g, genomgår masken en vertikal nettokraft, F Ny, 0,33 pN förrän strax efter vändningen punkten.

Descent: Det finns tre typer av krafter som verkar på masken tills masken når vändpunkten: gravitation, friktion, flytkraft och dragkraft (figur 6a). Den resulterande kraften är lika med vektorsumman av alla tre krafter. Här anser vi endast de vertikala komponenter:
F Ny = F Dy + F Ty-F g + F B (4)

där F B är flytkraften. F g är lika i storlek men motsatt i riktning till den flytkraft under antagande att densiteten för masken är den för vatten. Eq. 4 kan då skrivas på följande sätt:
F Ny = F Dy + F Ty (5)

F Ny förblir konstant under nedstigningen. Detta innebär attF Dy + F Ty förblir konstant tills nematoden når vändpunkten. F Dy är störst i toppen, vilket är början på vägen, och gradvis minskar till noll tills hastigheten är noll vid vändningen punkten medan F Ty måste öka för att hålla F Ny konstant.

Turnaround: Det finns ingen dragkraft i vertikal riktning vid vändningen punkt, eftersom den vertikala hastigheten är lika med noll på den punkten. De enda krafter som verkar i den vertikala riktningen är tyngdkraften, - F g, flytkraft, F B och den vertikala masken dragkraft, F Ty, såsom visas i fig 6b. Vid denna punkt, att syftet med C. elegans kan bestämmas:
F Ty = F Ny (6)

Den huvudsakliga inriktningen i botten av banan är då ungefär lika med 0,33 pN, vilket är ca 0,001% av maskens vikt. Med hänsynstår att den uppskattade vikten, F g a C. elegans är 28 NN,

Ascent: På samma sätt under uppstigningen, ökar dra men pekar nedåt (Figur 6c):
F Ny =-F Dy + F Ty (7)

Den dragkraft implementeras av masken måste nu vara ännu större och lika med summan av den dragkraft och vikt. Masken saktar ner efter börjar simma upp. För att simma upp i samma takt som den masken föll, skulle masken måste utöva en uppåtriktad dragkraft på minst två gånger sin vikt.

Svävar

Ett exempel på en mask som saktar dess nedstigning under ca 3 sek visas i fig 7.   En 3: e gradens polynom är en rimlig passform för den övergripande vägen. Felen i acceleration och hastighet från denna passning är mindre än 15%. Masken börjar med en signifikant upward dragkraft, bromsar och börjar att vända på 68 sek; Men minskar uppåt acceleration kontinuerligt (Figur 8)   tills netto accelerationen lika med noll cirka 68,5 sek. Detta leder så småningom till en netto acceleration i riktning nedåt, följt av en annan nollpunkt i hastigheten (figur 9)   och nematoden börjar sjunka igen på 69 sek.

Det är intressant att den maximala observerade vertikala accelerationen i detta fall är 2,7 mm / sek 2. Accelerationen i vändpunkter är 0,455 mm / sek 2 och - 0,455 mm / sek 2 respektive; cirka fyra gånger större än i fallet med nematoden som vänder och simmar upp. Använda Ekv. 6, kan man uppskatta att den uppåtgående kraften är omkring 1,32 pN vid den första vändpunkten. Vid den andra vändpunkten, är netto accelerationen negativ, så att den uppåtgående dragkraft är 1.32 PN.

o: keep-together.within-page = "alltid"> Figur 1
Figur 1. Experimentell inställning. Lasers, beam expander, lins och skärm är väsentliga för experimentuppställning. Styr speglar och små hål kan utelämnas, men kommer att göra det optiska inriktningen mindre stabil.

Figur 2
Figur 2. En våglängd Skuggbild (SWSI). Använda 2 mW av 543 nm laserljus skuggan av en mask projiceras på en skärm. Bilden är inverterad så att nematoden verkar ligga uppåt.

424/51424fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51424/51424fig3.jpg "/>
Figur 3. Vertikal nedstigning av en enda vildtyp C. elegans i en vattenpelare. Denna nematod var skuggas av 633 nm koherent ljus. Lutningen på den linjära passform visar en nedåtgående hastighet av 1,09 mm / s ± 0,01 mm / sek. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4
Figur 4. Deplacement graf av ett enda uppåt simning vildtyp C. elegans. Två splines passar spåra den allmänna vägen för nematoden. Den andra derivatan av passform avslöjar accelerationen. Den maximala accelerationen är lätt bestäms från första passform: 0.110 mm / S 2 ± 0,002 mm / sek 2. Endast ett fåtal felstaplar visas så att datapunkterna och passformen är synliga. Denna nematod var skuggas av 633 nm koherent ljus. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5
Figur 5. Acceleration graf av ett enda vildtyp C. elegans. Denna nematod håller en konstant uppåtriktad acceleration på 0,110 mm / sek 2 ± 0,002 mm / sek 2 får den att sakta ner och sedan röra sig uppåt. Strax efter vändningen punkten accelerationen minskar stadigt och netto accelerationen minskar till noll. g "target =" _blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6
Figur 6. Force diagram för härkomst, vändpunkt och uppstigning. Flytkraft och gravitationen är lika stora och motsatt riktning, så att effekten av dessa krafter ut varandra. De är därför inte visas i dessa diagram. (A) Masken är fallande med drag-och tryck pekar uppåt. (B) Masken är vid den lägsta punkten på banan utan att dra. Thrust pekar uppåt. (C) Masken är stigande med drag pekar nedåt medan dragkraft pekar uppåt.

"Src =" / files/ftp_upload/51424/51424fig7.jpg "/>
Figur 7. Förskjutning diagram över enstaka svävande nematod. Masken saktar ner och börjar vända på ca 68 sekunder, men börjar fallande ca 69 sek. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 8
.. Figur 8 Acceleration diagram över en svävande nematod Denna mask börjar med en uppåtriktad acceleration på 2,7 mm / s 2, minskar till noll och så småningom har en nedåtriktad acceleration på -. 2,6 mm / sek 2 klicka gärna här för att se en större version av denna figur.

Figur 9
Figur 9. Velocity diagram över en svävande nematod. Denna mask kommer till ett stopp på 68 sekunder och börjar gå uppåt, saktar ner och når noll hastighet i vertikal riktning vid 69 sek följt av en nedstigning. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tabell 1
Tabell 1. Genomsnitt nedstigningshastigheter av N2 C. elegans. 50 levande och 50 döda nematoder är tracked under deras härkomst. Den genomsnittliga hastigheten för nedfarter är samma för de levande och de döda maskar: 1,5 mm / sek ± 0,1 mm / sek.

Discussion

Den SWSI tekniken ger ytterligare ett sätt att förstå de motoriskt kapacitet mikroskopiska organismer som fritt levande nematoder. Med denna teknik har vi skiljer mellan aktiv rörelseförmåga (simning) och passiv drift på grund av tyngdkraften verkar på döda nematoder. Dessutom, när frisimmande nematoder ändra riktning under förflyttning i vatten, har vi möjlighet att mäta dragkrafter och vinkelkrafter, vilka är verksamma på nematoder och utövas av nematoder.

Nematoder möter olika miljöförhållanden i marken. Det finns vattenfickor inom jord, såväl som fasta partiklar och biologiska material i olika former och texturer. Dessutom finns nematoder i ett gravitations miljö som de svarar på 14. Vidare är nematoder nära ytan av jorden utsätts för olika våglängder av ljus, förändringar i temperatur och fuktighet, såväl som biologisktvariabler som bakterier, underprissättning svampar och andra marklevande organismer. Nematoder måste svara på alla dessa olika variabler, simning och krypa i olika medier, vrida och ändra navigerings strategier. Alla dessa komplexa beräkningar utförs av endast 302 nervceller, en delmängd av dessa är involverade i förflyttning och 95 kroppsväggen muskelceller. Mätningar av det slag som beskrivs av SWSI teknik ger viktig inblick i hur nematoder åstadkomma detta navigations komplexitet.

För den första delen, har vi mätt den totala fallande takt vildtyp C. elegans i 633 nm ljus. Med hjälp av dessa mätningar kan vi uppskatta dragkraft en mask möten.

För fallstudie av en accelererande nematod, de krafter inblandade förändring kontinuerligt sedan dragkraft ändras med hastigheten. Det finns vissa uttalanden som vi har möjlighet att göra om de krafter som verkar på masken. Eftersom snäck saktar ner och försöker swim uppåt den vertikala komponenten av dragkraften minskar tills den når noll vid den lägsta punkten av nematoden bana. Vid denna punkt, måste masken ha en uppåtriktad kraft att simma upp.

Detta förfarande kan modifieras på flera sätt. Eventuella mikroskopiska arter som navigerar i en klar vätska kan spåras med hjälp SWSI. Studier kan genomföras med alla våglängder som är tillgängliga för digitalkameror. Digitalkameror normalt plocka upp våglängder som sträcker sig från UV till nära IR. Dessutom kan horisontella studier utföras genom att rikta laser vertikalt uppåt. Arten kan sedan placeras på ett horisontellt transparent yta, som ett mikroskopobjektglas. Justera strålexpanderaren eller förstoringsglas efter strålexpanderaren kan vässa suddiga bilder. Användaren ska se till att fästa alla komponenter till bordet för konsekvent och lätt ljushöjden.

Metoden begränsas av tillgänglig laser wavelengths och upplösning. I huvudsak fördelarna med denna metod jämfört med existerande mikroskop, som är den flexibilitet i riktningar och våglängder, är det också brister eftersom installationen är enkel. De osofistikerade optik och prickar av lasern begränsar upplösningen. En del av dessa nackdelar kan säkert förbättras i framtiden genom att inkludera rumslig filter och projicerar bilden direkt på en CCD-kamera.

De mest kritiska stegen i protokollet kan enkelt lärt sig som experimentet utförs för första gången. Placering nematoden i kyvetten utan att skapa turbulens är kritisk. Dessutom kan vibrationer störa installationen och förändra beteendet hos maskarna. Var noga med att begränsa den effekt, som används för att skugga bilden. 2 mW för en laserstråle som är 1 mm i diameter bör vara maximalt för att undvika värmeeffekter. Installationen bör testas för spridning effekter vid användning av andra än destillerat vatten vätskor.

För närvarande de flesta microscopes verka på ett horisontellt plan med hjälp av vitt ljus eller färgfilter, som fortfarande är mycket bred i våglängdsområdet. Mikroskop som verkligen använder enstaka våglängder och har flexibilitet i visnings scenariot, dvs horisontell placering, är vanligtvis begränsad till en fördel eller det andra. Även dessa typer av mikroskop är oftast mycket dyra och fortfarande begränsad till fokalplan skillnad från vår metod. Vår inställning kan enkelt byggas med en extremt låg budget. Denna metod är redo att användas av skolor, miljö företag samt andra organ som arbetar med små medel. I framtiden kan denna metod användas på ett mycket sofistikerat setup för att studera realtidseffekter på rörelseförmåga och mechanosensation av mikroskopiska arter. Denna metod gör enstaka våglängd studier på en rad olika vinklar och visningsdjup lätt tillgängliga.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Vi är tacksamma för stödet från Vassar College Grundutbildning Research Summer Institute (URSI), Lucy Maynard Salmon Research Fund, NASA utmärkelse nr NX09AU90A, National Science Foundation Center for Research Excellence inom vetenskap och teknik (NSF-CREST) ​​utmärkelse nr 0630388 och NSF utmärkelsen nr 1.058.385.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tunable Helium-Neon laser  Research Electro-Optics 30602 Four wavelengths can be selected between 543 nm and 633 nm.
2 Front Surface Aluminum Mirrors Thorlabs PF10-03-F01
High Speed Exilim Camera Casio
Quartz Cuvette Starna Cells 21/G/5
LoggerPro (Software) Vernier http://www.vernier.com/products/software/lp/
Mathematica 8 Wolfram http://www.wolfram.com/
5x-10x variable zoom Galilean beam expander Thorlabs BE05-10-A
Plano-convex lens with a positive focal length of 75 mm Thorlabs LA1257

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ward, A., Lie, J., Feng, Z., Xu, Z. S. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nature Neurosci. 11, 916-922 (2008).
  2. Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105-20987 (2008).
  3. Vidal-Gadea, A. G., Davis, S., Becker, L., Pierce-Shimomura, J. T. Coordination of behavioral hierarchies during environmental transitions in Caenorhabditis elegans. Worm. 1, 5-11 (2012).
  4. Berri, S., Boyle, J. H., Tassieri, M., Hope, I. A., Cohen, N. Forward locomotion of the nematode C. elegans is achieved through modulation of a single gait. HFSP Journal. 3, 186-193 (2009).
  5. Pawley, J. B. Objective Lenses for Confocal Microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy. 3rd Edition, Springer. New York. (2006).
  6. Conrad, J. Depth of Field in Depth. Large Format Page Retrieved. Available from: http://www.largeformatphotography.info/articles/DoFinDepth.pdf (2011).
  7. Demtröder, W. Laser Spectroscopy Basic Concepts and Instrumentation. Springer 3rd Ed. New York. (2003).
  8. Magnes, J., Raley-Susman, K., Melikechi, N., Sampson, A., Eells, R., Bello, A., Lueckheide, M. Analysis of Freely Swimming C. elegans Using Laser Diffraction. Open J. Biophys. 2, (3), 101-107 (2012).
  9. Mood, A., Graybill, F., Boes, D. Introduction to the Theory of Statistics. 3rd edition, McGraw-Hill. (1974).
  10. Taylor, J. R. Classical Mechanics. University Science Books. (2005).
  11. Magnes, J., Susman, K., Eells, R. Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction. J. Vis. Exp. (68), (2012).
  12. Bevington, P. R. Data Reduction and Error Analysis for the Physical Sciences. McGraw-Hill Book Company. New York. (1969).
  13. Lyche, T., Schumaker, L. L. Local spline approximation methods. Journal of Approximation Theory. 15, (4), 294-325 (1975).
  14. Kim, N., Dempsey, C. M., Kuan, C. -J., Zoval, J. V., O'Rourke, E., Ruvkun, G., Madou, M. J., Sze, J. Y. Gravity Force Transduced by the MEC-4/MEC-10 DEG/ENaC Channel Modulates DAF-16/FoxO Activity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 177, 835-845 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics