Enkelt bølgelængde Shadow Imaging af

Engineering
 

Summary

Teknikken præsenteres her måler stien frit svømme mikroskopiske arter ved hjælp af enkelt bølgelængde eksponering. C. elegans anvendes til at demonstrere skygge billeddannelse som et billigt alternativ til dyre mikroskoper. Denne teknik kan tilpasses til at rumme forskellige orienteringer, miljøer og arter til at måle retning, hastighed, acceleration og kræfter.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jago, A., Kpulun, T., Raley-Susman, K. M., Magnes, J. Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates. J. Vis. Exp. (86), e51424, doi:10.3791/51424 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Denne undersøgelse viser en billig og enkel teknik, der tillader måling af fysiske egenskaber, såsom position, hastighed, acceleration og kræfter involveret i motorisk adfærd nematoder suspenderet i en vandsøjle, som reaktion på enkelte bølgelængder af lys. Vi viser, hvordan du vurdere bevægelse af en mikroskopisk organisme ved hjælp af enkelt bølgelængde Shadow Imaging (SWSI) ved hjælp af to forskellige eksempler.

Det første eksempel er en systematisk og statistisk levedygtig undersøgelse af den gennemsnitlige afstamning C. elegans i en søjle af vand. For denne undersøgelse, brugte vi levende og døde vildtype C. elegans. Når vi sammenlignede hastigheden og retningen af nematode aktiv bevægelse med den passive afstamning af døde orme i tyngdefeltet, denne undersøgelse viste ingen forskel i descent-tider. Den gennemsnitlige nedstigning var 1,5 mm / sek ± 0,1 mm / sek for både levende og døde orme anvender 633 nm sammenhængendelys.

Det andet eksempel er et casestudie af vælge enkelte C. elegans ændrer retning under nedstigning i en lodret vandsøjle. Acceleration og kraft analyseres i dette eksempel. Dette casestudie viser omfanget af andre fysiske egenskaber, som kan evalueres ved hjælp SWSI mens evaluere adfærd ved hjælp af single bølgelængder i et miljø, der ikke er tilgængelige med traditionelle mikroskoper. Ved hjælp af denne analyse, vi anslået en individuel nematode er i stand til at støde med en kraft på over 28 NN.

Vores resultater viser, at levende nematoder udøve 28 NN når man drejer, eller bevæger sig imod tyngdefeltet. Resultaterne tyder endvidere på, at nematoder passivt ned i en søjle af vand, men aktivt kan modstå tyngdekraften primært ved at dreje retning.

Introduction

Caenorhabditis elegans er en fritlevende gavnlig jord rundorm, der er en kraftfuld model organisme for at studere mekanismer genregulering, udvikling og mere for nylig for at forstå sensorisk biologi og adfærd. Trods kun 302 neuroner, C. elegans er i stand til komplekse bevægelsesmæssigt mønstre, reproduktive adfærd, navigation, kemotaksi og mange andre adfærd. C. elegans besidder mekanoreceptorer, kemoreceptorer og endda registrere blå bølgelængder af lys (Ward et al. 2008) 1. Mens meget er kendt om den neurale kredsløb af sensomotoriske funktion og generelle bevægelsesmæssigt mønstre i C. elegans, mindre kendt svarene til flere, samtidige stimuli eller mere komplekse miljøforhold, end der kan modelleres under et mikroskop. Enkelte undersøgelser har afsløret mere komplekse bevægelsesmæssigt mønstre, der er meget plastik 2,3,4. Vores metodiske tilgang vil gøre det muligt studier af NEMatodes i opløsning i real tid, hvor vi let kan levere flere miljøforhold samtidig. Dette spørgsmål er vanskeligt at løse ved anvendelse af traditionelle mikroskop baseret billeddannende teknikker. Vi har udviklet en imaging teknik, der giver os mulighed for at placere nematoder i en vandsøjle til at undersøge bevægelsesmæssigt adfærd, samt bestemme kapaciteter af nematoder til at ændre bevægelse som reaktion på forskellige miljøforhold.

Enkelt bølgelængde Shadow Imaging (SWSI) er præsenteret i dette papir for første gang at tage manglerne ved traditionelle mikroskoper. Traditionelle mikroskoper er begrænset til at observere arter i et vandret fokalplan nogle få mikrometer i dybden 5,6. Med hensyn til enkelt bølgelængde studier, de fleste traditionelle mikroskoper bruge farvefiltre til at filtrere hvidt lys meget bredt, typisk 50-100 nm. Ved hjælp af en laser til SWSI indsnævrer valget bølgelængde på mindre end 1 nm, samtidig med at tegnificant lysintensitet 7. Ligeledes har enkelte bølgelængder blevet anvendt til at måle svømning frekvenser C. elegans i realtid 8.

For første demonstration af vores metode, vi overvåger den vandrette position x, og den lodrette position, y, af en frit svømning C. elegans i en vandsøjle, over en afstand på omkring en centimeter. Især er vi interesseret i den lodrette bevægelse, da tyngdekraften fungerer også lodret. Hældningen af en lineær tilpasning til lodret stilling giver den lodrette hastighed, v y af nematoden som det ned i vandsøjlen:
Formula (1)

Den geometriske middelværdi af fejl (RMSE) 9 angiver kvaliteten af pasform og indikerer, om faldende hastighed er generelt konstant. De lodrette hastigheder derefter gennemsnitligt for ØKh arter og døde orme. Ved hjælp af disse resultater, træk, som orme erfaring kan estimeres.

For anden demonstration af vores metode, vi har valgt C. elegans der ikke synke ved en konstant hastighed i modsætning til de fleste af orme overholdes. De udvalgte orme enten vendte rundt og svømmede opad eller svævede et stykke tid, før du fortsætter nedstigningen. Fysisk, denne sag viser undersøgelsen, at der kan beregnes hovedlinjerne i en swimming mikroorganisme. Newtons love dikterer, at et organ, der ændrer retninger accelererer, hvilket indebærer en netto kraft, Formel 1 , Er handler på dette organ 10:
Formel 2 (2)

hvor p erden lineære momentum og t er tiden. Accelerationen af ​​ormen er direkte proportional med den kraft, der virker på orm da massen af ​​ormen forbliver konstant. Som et resultat, den lodrette nettokraft er:
Formel 3 (3)

hvor m er massen af en orm og y repræsenterer den lodrette acceleration. Den resulterende kraft i lodret retning repræsenterer derefter ormen drivkraft i samme retning. Den samlede kraft kan beregnes ved at tage den horisontale komponent i betragtning.

Protocol

1.. C. elegans Forberedelse

  1. Forbered petriskåle af unge voksne C. elegans som beskrevet i tidligere forsøg med udsættelse af C. elegans i en væskefyldt kuvette 11.
  2. På dagen for video-analyse, pick levende unge voksne nematoder direkte i en kuvette fyldt med deioniseret, destilleret vand under anvendelse af en platin pick som beskrevet i trin 2.
  3. Forbered døde C. elegans med chloroform eksponering. Fortsæt ved at følge fremgangsmåden beskrevet for modtaget levende nematoder beskrevet i trin 2.

2.. Optisk opsætning til videoanalyse

  1. Saml forsøgsopstillingen at skabe skyggebilleder, som vist i fig. 1. Kameraet kan placeres i afstand fra skærmen, så længe den er i stand til at fange et frontbillede af skærmen. Et godt sted er ved siden af ​​kuvetten vender skærmen.
    1. Ved hjælp af mindst to spejlestyre afstemmelige Helium-Neon laser output i galilæer beam expander således at bjælken er udvidet til en diameter på 12 mm.
    2. Placer en eller to små huller i strålegangen, så strålen passerer gennem pinholes uden at blive blokeret. Brug pinholes at sikre tilpasningen opretholdes.
    3. Ret udvidede stråle på en monteret kvartscuvette, der er 10 mm bred, 10 mm dyb og 4 cm høj.
    4. Forstør strålen ved hjælp af en plankonveks linse med en positiv brændvidde på 75 mm.
    5. Placer en projektionsskærm ca 120 cm fra objektivet. Afstande større end dette vil give en større forstørrelse af billedet skyggen. Kvaliteten af ​​billedet vil dog aftage med en lavere lysintensitet og en øget noticeability diffraktion interferens.
    6. Placer en high-speed kamera, som er i stand til mindst 60 fps, lige ved siden af ​​kuvetten vender skærmen.
  2. Placer en dissektionsmikroskop nær den optiske sætop til hurtig overførsel af nematoder i kuvetten.
  3. Midlertidigt sikre en gennemsigtig lineal med mm divisioner til midten af ​​kuvetteholderen vinkelret på den udvidede stråle, så strålen projekter et forstørret billede af linealen på skærmen. Indstil længden skala til video analyse.
    1. På projection screen, markere skala afstand ved hjælp af en gennemsigtig lineal off center fra det projicerede billede for at undgå at blande sig i fremskrivningen. Klik her for video.
    2. Optag billedet og måle forstørrelsen. Tag linealen fra opsætningen. Gentag dette trin for andre bølgelængder som vinklen på brydning af lyset for hver bølgelængde gennem linsen, vil variere på grund af kromatisk aberration.
  4. Sæt kuvetten og udfylde det inden for 1 mm fra fælgen med destilleret vand.
  5. Begynd optagelse mens Værelset lyset er tændt, så skalaen distance er inkluderet i den sammeoptagelser som det projicerede billede. Slukke lyset.
  6. Ved hjælp af en tynd, fladtrykt platintråd pick, flytte enkelte unge voksne C. elegans én ad gangen fra agarpladen i kuvetten ved at trykke på pick til overfladen af vandet. Den nematode bliver synlige i vandsøjlen, når det kommer ind i strålen grund spredt lys. Klik her for video.
  7. Film de projicerede billeder af ormene, når de passerer gennem den udvidede laserstråle. Det er vigtigt at bemærke, at det projicerede billede vendes og orme vil synes at bevæge sig i den modsatte retning af den faktiske bevægelse. Orme, der er faldende med tyngdekraften vil synes at bevæge sig opad på skærmen (Figur 2).

3.. Videodata Forberedelse

  1. Importer video i video-analyse-programmet.
  2. Indstil skala under anvendelse forstørrelsesfaktoren bestemt tidligere.
  3. Track den lineære forskydning af hovedet af skygget nematode med mindst 10 datapunkter over hele stien taget.
  4. Find hastigheden i den vertikale retning ved at derivat ("Y", "Time") og dividere denne værdi med forstørrelsen bestemt i trin 2.2.

4.. Dataanalyse

  1. Analyser den lineære nedstigning af en C. elegans:
    1. Kontrollér at sikre, at datapunkter på den lodrette position versus tid graf generelt danner en lige linje. Nogle afvigelser kan ignoreres på grund af hoved bevægelse af nematoder. Hvis datapunkterne generelt danner en lige linje, skal du fortsætte til trin 4.1.2, ellers nedstigningen er lineær, og analysen bør videreføres ved hjælp af trin 5.1 i denne protokol.
    2. Opret en lineær regression ved at montere en lige linje 12 til de data fra Analyse-menuen. Hældningen af denne linje er så den lodrette hastighed af C.elegans. Hældningen er ændringen i position divideret med ændringen i tid i løbet af et bestemt interval. Bestem den nedadgående hastighed af de levende og døde orme i denne måde (figur 3).
    3. Gennemsnittet af lodrette svømning hastigheder fra nematoder. En stikprøve på omkring 50 orme er tilstrækkelig. Sammenlign svømme hastigheder i levende orme med afdrift hastigheder i døde orme.

5.. Analyser Nonlinear Motion C. elegans

  1. Fra punkt 3, skal du vælge en analyseret videofil, som viser en ikke-lineær nedstigning i vandsøjlen (figur 4). En lineær afstamning kan identificeres ved hjælp af trin 4.1.1 i denne protokol.
  2. Vælg 'Curve Fit' fra 'Analyse' menu i videoen analyse software. Vælg en anden rækkefølge (kvadratisk) polynomium. Monter kurven.
  3. For et område af interesse, justere pasformen på grafen ved at skubbe beslagene på hver side of pasform på grafen, indtil kurven er meget tæt på datapunkterne i pasform og / eller godt inden fejllinjerne. Beslaget program giver en matematisk udtryk for den tilpassede kurve, som er lodret position versus tid. Overvej de tilpassede kurve fejl givet af programmet, der er forbundet med de fysiske egenskaber. En relativ fejl på 15% eller derunder er normalt acceptabel.
  4. Tilføj flere kurve passer til dækning af yderligere afsnit af data. Spline 13 funktionerne for optimal dækning: sørg for, at kurvetilpasninger overlapning og forsøge at tilpasse tilstødende kurver så pisterne match i de overlappende områder.
  5. Anskaf hastighed for et område af interesse ved at tage differentialkvotienten af ​​tilpassede kurve ved hjælp af matematiske udtryk opnås i trin 5.1.3. Hastigheder kan variere med tiden. Bemærk, at derivatet er hældningen af ​​en funktion. Den afledte kan opnås matematisk eller grafisk. I dette tilfælde er det praktisk at anvende den givne matematiske udtrykession.
  6. Tag den anden afledede af de monterede kurver for at opnå acceleration. Accelerationen kan variere med tiden.
  7. Multiplicer acceleration af ormen masse at beregne tryk, som ormen udøver. En rimelig skønnede masse er 3 ug antagelse, at ormen hovedsagelig består af vand.

Representative Results

Steady Descent

Den første undersøgelse viser ingen skelnes forskel i nedstigende satserne for C. elegans løbet SWSI hjælp 633 nm. De faldende priser blev anset for at være konstant på 1,5 mm / sek ± 0,1 mm / sek for både de levende og de ​​døde C. elegans. En stikprøve på 50 orme genereret en rimelig varians af 7% for både levende og døde orme. Der er ingen acceleration, der virker på orme da faldende hastighed er konstant, således at trækkraften er lig med tyngdekraften minus opdriften. Dette indebærer, at tætheden af ​​orm er lidt større end vand; men for de skøn under det stadig er praktisk at antage, at tætheden af ​​en rundorm er omtrent som vand.

Ændring Direction

Den anden undersøgelse, en case, viser, at nematoder er i stand til at ændre retning og kan svømme op imodtyngdekraften. To kurver blev tilpasset til den vertikale forskydning af rundorm, så at det andet derivater af disse kurver kan notet til at tegne acceleration versus tid (figur 5).   Det er tilrådeligt at holde polynomiet orden så lav som muligt og samtidig opretholde en god pasform. En lavere polynomium rækkefølge viser mindre variation i accelerationen over tid. Højere orden polynomiel vilkår vil være ubetydelig, og derfor unødvendigt, hvis rækkefølgen af ​​polynomiet er for høj. Denne orm decelererer med en konstant hastighed på 0,110 mm / sek 2 ± 0,002 mm / sek 2, vender rundt og accelererer med samme hastighed 0,110 mm / sek 2 ± 0,002 mm / sek 2, indtil kort efter turnaround punkt. C. elegans fortsætter med at bevæge sig opad med en aftagende acceleration af 1,252-,00708 t mm / sek 2, indtil accelerationen falder til nul. Holde i tankerne Eq. 3, og en anslået orm masse på 3 & #956 g, ormen gennemgår en lodret net kraft, F Ny, på 0,33 PN indtil kort efter vendepunkt.

Descent: Der er tre typer af kræfter, der virker på ormen, før ormen når vendepunkt: tyngdekraft, træk, opdrift og stak (figur 6a). Den resulterende kraft er lig med vektorsummen af ​​alle tre kræfter. Her betragter vi kun de lodrette komponenter:
F Ny = F Dy + F Ty-F g + F B (4)

hvor F B er opdriften. F g er ens i størrelse, men med modsat retning til opdriften antages, at tætheden af ​​orm er, at vand. Ækv. 4 kan derefter skrives på følgende måde:
F Ny = F Dy + F Ty (5)

F Ny forbliver konstant under nedstigningen. Dette indebærer, atF Dy + F Ty forbliver konstant indtil nematode vendepladsen punkt. F Dy er størst i toppen, som er begyndelsen af stien, og gradvist reduceres til nul, indtil hastigheden er nul ved vendepunkt mens F Ty skal øges for at holde F Ny konstant.

Turnaround: Der er ingen træk kraft i lodret retning ved vendepunkt, da den lodrette hastighed lig med nul på dette punkt. De eneste kræfter, der virker i lodret retning er tyngdekraften, - F g, opdrift, F B og den lodrette ormen stak, F Ty, som vist i figur 6b. På dette tidspunkt, hovedlinjerne i C. elegans kan bestemmes:
F Ty = F Ny (6)

Hovedvægten i bunden af ​​banen er så stort set svarer til 0,33 PN, hvilket er omkring 0,001% af ormen vægt. Under hensyntagenkonto, den anslåede vægt, F g af en C. elegans er 28 NN

Ascent: Ligeledes i løbet af opstigningen, træk stiger, men peger nedad (figur 6c):
F Ny =-F Dy + F Ty (7)

Hovedvægten gennemføres af ormen skal nu være endnu større og lig med summen af ​​træk kraft og vægt. Ormen er aftagende efter begynder at svømme op. At svømme op på samme hastighed som ormen nedstammer ville ormen nødt til at lægge et opadgående kraft på mindst to gange sin vægt.

Svævende

Et eksempel på en orm, der forsinker nedstigningen til omkring 3 sekunder er vist i figur 7.   En 3. gradspolynomiet er en rimelig egnet til den overordnede vej. Fejlene i acceleration og hastighed fra dette fit er mindre end 15%. Ormen starter med en betydelig upward stak, bremser og begynder at dreje rundt på 68 sekunder; Den opadgående acceleration aftager kontinuerligt (fig. 8)   indtil redskab acceleration lig med nul omkring 68,5 sek. Dette fører i sidste ende til en netto acceleration i nedadgående retning efterfulgt af en anden nulpunkt i hastighed (fig. 9)   og nematoden begynder at stige igen til 69 sek.

Det er interessant, at den maksimale observerede lodrette acceleration i dette tilfælde er 2,7 mm / sek 2. Accelerationen ved vendepunkter er 0.455 mm / sek 2 og - 0,455 mm / sek 2 henholdsvis; omkring fire gange større end i tilfælde af rundorm, der vender rundt og svømmer op. Ved anvendelse af ligning. 6, kan det anslås, at den opadgående kraft er ca 1,32 PN ved det første vendepunkt. På det andet vendepunkt, netto acceleration er negativ, således at den opadgående kraft er 1.32 PN.

o: keep-together.within-side = "altid"> Figur 1
Figur 1.. Forsøgsopstillingen. Laseren, stråle expander, linse og skærm er afgørende for forsøgsopstillingen. Styre-spejle og pinholes kan udelades, men vil gøre det optisk justering mindre stabil.

Figur 2
Figur 2.. Enkelt bølgelængde Shadow Image (SWSI). Brug 2 mW 543 nm laserlys skyggen af en orm er projiceret op på en skærm. Billedet er omvendt, således at nematoden forekommer at falde opad.

424/51424fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51424/51424fig3.jpg "/>
Figur 3.. Lodret nedstigning af en enkelt vild type C. elegans i en vandsøjle. Denne nematode blev skygget af 633 nm kohærent lys. Hældningen af den lineære fit indikerer en nedadgående hastighed på 1,09 mm / sek ± 0,01 mm / sek. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4.. Displacement grafen for en enkelt opadgående svømning vildtype C. elegans. To rillede passer spore den samlede bane nematode. Den anden afledede af pasformen afslører acceleration. Den maksimale acceleration bestemmes let fra den første tilpasning: 0,110 mm / Sek 2 ± 0,002 mm / sek 2. Kun få fejlsøjler vises så datapunkterne og pasformen forbliver synlige. Denne nematode blev skygget af 633 nm kohærent lys. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5.. Acceleration grafen for en enkelt vild type C. elegans. Denne nematode opretholder et konstant opadgående acceleration på 0,110 mm / sek 2 ± 0,002 mm / sek 2 får det til at sætte farten ned og derefter bevæger sig opad. Kort efter vendepunkt accelerationen falder støt og netto acceleration faldet til nul. g "target =" _blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6.. Tving diagrammer til afstamning, vendepunkt, og opstigningen. Opdrift og tyngdekraften er lige i størrelse og modsat i retning, således at virkningen af disse kræfter ophæver hinanden. De er derfor ikke vist i disse skemaer. (A) Ormen er faldende med træk og stak peger opad. (B) Ormen er på det laveste punkt af banen uden træk. Thrust peger op. (C) Ormen er stigende med træk nedad, mens stak peger op.

"Src =" / files/ftp_upload/51424/51424fig7.jpg "/>
Figur 7. Displacement graf enkelt svævende nematoder. Ormen bremser og begynder at dreje rundt på omkring 68 sekunder, men begynder faldende omkring 69 sek. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 8
.. Figur 8 Acceleration grafen for en enkelt svævende nematode Denne orm starter med en opadgående acceleration på 2,7 mm / sek 2, falder til nul, og i sidste ende har en nedadgående acceleration -. 2,6 mm / sek 2 Klik her for at se et større version af dette tal.

Figur 9
Figur 9. Velocity grafen for en enkelt svævende nematode. Denne orm kommer til et stop ved 68 sek og begynder at lede opad, bremser og når nul hastighed i lodret retning på 69 sek efterfulgt af en nedstigning. Klik her for at få vist en større version af dette tal.

Tabel 1
Tabel 1.. Gennemsnitlige afstamning hastigheder af N2 C. elegans. 50 levende og 50 døde nematoder tracked under deres afstamning. Den gennemsnitlige hastighed for nedkørsler er den samme for de levende og de døde orme: 1,5 mm / sek ± 0,1 mm / sek.

Discussion

Den SWSI teknik giver en ekstra måde at forstå de bevægelsesmæssigt kapaciteter af mikroskopiske organismer som fritlevende nematoder. Med denne teknik har vi skelnet mellem aktiv bevægelse (svømning) og passiv drift på grund af tyngdekraften, der opererer på døde nematoder. Hertil kommer, når fritsvømmende nematoder ændre retning under bevægelse i vand, er vi i stand til at måle trækkræfterne og kantede kræfter, der opererer på nematoder og udøves af nematoder.

Nematoder møde forskellige miljømæssige forhold i jorden. Der er vand lommer i jorden, såvel som faste partikler og biologiske materialer i forskellige former og teksturer. Derudover findes nematoder inden et tyngdefelt miljø, som de reagerer på 14.. Endvidere er nematoder nær overfladen af ​​jorden udsat for forskellige bølgelængder af lys, ændringer i temperatur og fugtighed, samt biologiskvariabler som bakterier, røveriske svampe og jord andre organismer. Nematoder skal reagere på alle disse forskellige variabler, svømning og kravle i forskellige medier, drejning og ændre navigations strategier. Alle disse komplekse beregninger udføres af kun 302 neuroner, en delmængde af dem er involveret i bevægelse, og 95 kroppens væg muskelceller. Målinger af den slags, der er beskrevet af SWSI teknik giver vigtig indsigt i, hvordan nematoder opnå dette navigations kompleksitet.

For den første del har vi målt den generelle faldende sats for vildtype C. elegans i 633 nm lys. Ved hjælp af disse målinger, kan vi estimere trækkraften en orm møder.

For casestudie af en accelererende rundorm, de kræfter involveret forandring uafbrudt siden trækkraften ændringer med hastigheden. Der er nogle udsagn, som vi er i stand til at gøre om de kræfter, der virker på orm. Da ormen bremser og forsøger at swim opad lodrette komposant af trækkraften aftager, indtil den når nul ved det laveste punkt af nematoden udfoldelser. På dette punkt må ormen have en opadgående kraft til at svømme op.

Denne fremgangsmåde kan modificeres på flere måder. Eventuelle mikroskopiske arter, der navigerer i en klar væske kan spores ved hjælp SWSI. Undersøgelser kan udføres med eventuelle bølgelængder, der er tilgængelige for digitalkameraer. Digitale kameraer vil typisk afhente bølgelængder lige fra UV til nær IR. Desuden kan horisontale undersøgelser udføres ved at rette laseren lodret opad. Arterne kan derefter placeres på en vandret transparent overflade, som et mikroskopobjektglas. Justering af strålen expander eller lup efter strålen expander kan skærpe slørede billeder. Brugeren skal sørge for at fastgøre alle komponenter til bordet for at sikre en ensartet og let lyshøjden.

Metoden er begrænset af tilgængelig laser wavelengths og opløsning. Essensen af ​​fordelene ved denne metode i forhold til eksisterende mikroskoper, som er fleksibiliteten i retninger og bølgelængder, er også svagheder, da opsætningen er enkel. De usofistikeret optik og prikker i laser begrænse opløsningen. Nogle af disse ulemper kan sikkert forbedres i fremtiden ved at inkludere rumlige filter og rager billedet direkte på et CCD-kamera.

De mest kritiske trin i protokollen kan nemt læres som eksperimentet udføres for første gang. Lægger nematoden i kuvetten uden at skabe turbulens er kritisk. Desuden kan vibrationer forstyrre setup og ændre adfærd orme. Vær sikker på at begrænse den strøm, som bruges til at skygge billedet. 2 mW for en laserstråle, der er 1 mm i diameter bør være det maksimale for at undgå opvarmning effekter. Opsætningen bør testes for spredning effekter ved brug af andre end destilleret vand væsker.

I øjeblikket mest microscopes operere på et vandret plan ved hjælp af hvidt lys eller farvefiltre, som stadig er meget bred i bølgelængdeområdet. Mikroskoper, der virkelig bruge enkelte bølgelængder og have fleksibilitet i visning scenarie, dvs horisontal placering, er normalt begrænset til en fordel eller det andet. Også disse typer mikroskoper er normalt meget dyre og stadig begrænset til fokusplaner modsætning vores metode. Vores setup kan nemt bygges med et ekstremt lavt budget. Denne metode er klar til at blive brugt af skoler, miljøvirksomheder samt andre enheder, der opererer med få midler. I fremtiden kan denne metode anvendes i et meget sofistikeret setup til at studere realtid virkninger på bevægelse og mechanosensation af mikroskopiske arter. Denne metode gør enkelt bølgelængde studier på en bred vifte af vinkler og visning dybder let tilgængelige.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Vi er taknemmelige for den støtte fra Vassar College Undergraduate Research Summer Institute (ursi), Lucy Maynard Laks Research Fund, NASA prisen No NX09AU90A, National Science Foundation Center for Research Excellence i Videnskab og Teknologi (NSF-CREST) ​​tildele No 0630388 og NSF tildeling nr. 1.058.385.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tunable Helium-Neon laser  Research Electro-Optics 30602 Four wavelengths can be selected between 543 nm and 633 nm.
2 Front Surface Aluminum Mirrors Thorlabs PF10-03-F01
High Speed Exilim Camera Casio
Quartz Cuvette Starna Cells 21/G/5
LoggerPro (Software) Vernier http://www.vernier.com/products/software/lp/
Mathematica 8 Wolfram http://www.wolfram.com/
5x-10x variable zoom Galilean beam expander Thorlabs BE05-10-A
Plano-convex lens with a positive focal length of 75 mm Thorlabs LA1257

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ward, A., Lie, J., Feng, Z., Xu, Z. S. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nature Neurosci. 11, 916-922 (2008).
  2. Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105-20987 (2008).
  3. Vidal-Gadea, A. G., Davis, S., Becker, L., Pierce-Shimomura, J. T. Coordination of behavioral hierarchies during environmental transitions in Caenorhabditis elegans. Worm. 1, 5-11 (2012).
  4. Berri, S., Boyle, J. H., Tassieri, M., Hope, I. A., Cohen, N. Forward locomotion of the nematode C. elegans is achieved through modulation of a single gait. HFSP Journal. 3, 186-193 (2009).
  5. Pawley, J. B. Objective Lenses for Confocal Microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy. 3rd Edition, Springer. New York. (2006).
  6. Conrad, J. Depth of Field in Depth. Large Format Page Retrieved. Available from: http://www.largeformatphotography.info/articles/DoFinDepth.pdf (2011).
  7. Demtröder, W. Laser Spectroscopy Basic Concepts and Instrumentation. Springer 3rd Ed. New York. (2003).
  8. Magnes, J., Raley-Susman, K., Melikechi, N., Sampson, A., Eells, R., Bello, A., Lueckheide, M. Analysis of Freely Swimming C. elegans Using Laser Diffraction. Open J. Biophys. 2, (3), 101-107 (2012).
  9. Mood, A., Graybill, F., Boes, D. Introduction to the Theory of Statistics. 3rd edition, McGraw-Hill. (1974).
  10. Taylor, J. R. Classical Mechanics. University Science Books. (2005).
  11. Magnes, J., Susman, K., Eells, R. Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction. J. Vis. Exp. (68), (2012).
  12. Bevington, P. R. Data Reduction and Error Analysis for the Physical Sciences. McGraw-Hill Book Company. New York. (1969).
  13. Lyche, T., Schumaker, L. L. Local spline approximation methods. Journal of Approximation Theory. 15, (4), 294-325 (1975).
  14. Kim, N., Dempsey, C. M., Kuan, C. -J., Zoval, J. V., O'Rourke, E., Ruvkun, G., Madou, M. J., Sze, J. Y. Gravity Force Transduced by the MEC-4/MEC-10 DEG/ENaC Channel Modulates DAF-16/FoxO Activity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 177, 835-845 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics