一个完整的皮肤缺损模型,以评估生物材料的血管化

Bioengineering

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Summary

血管是关键,成功的组织工程方法。因此,可靠的技术是必需的,以评估组织构建体的血管网络的发展。在这里,我们提出一个简单和具有成本效益的方法来可视化和量化血管在体内

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Schenck, T. L., Chávez, M. N., Condurache, A. P., Hopfner, U., Rezaeian, F., Machens, H. G., Egaña, J. T. A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo. J. Vis. Exp. (90), e51428, doi:10.3791/51428 (2014).

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Abstract

血管化不足被认为是限制性的组织工程化构建体的临床成功的主要因素之一。为了评价新的策略,其目的是提高血管化的,可靠的方法是必需的,以使得在生长的新血管进入生物人工支架可见和量化的结果。在过去的几年中,我们的团队已经推出了全层皮肤缺损模型,使血管的直接可视化通过透,并提供量化,通过数字化分割的可能性。在此模式中,一个外科地在小鼠背部创建完整皮肤缺陷并将它们替换为所测试的材料。分子或感兴趣的细胞也可以在这些材料掺入以研究它们的潜在影响。经过自己选择的观察时间,材料植进行评估。双侧伤口提供进行内部比较次的可能在减少个体之间的工件,以及减少所需的研究的动物的数量的。相较于其他方法,我们的方法提供了一种简单,可靠和具有成本效益的分析。我们已经实现了这个模式作为常规工具测试不同的生物材料和生物活化方法的血管时,执行高解析度的筛选。

Introduction

在最近的几十年中,组织工程开辟了新的治疗选择与人体自身的细胞替换1组织缺损。为了支持组织再生的生理过程,支架被设计成可生物降解的结构,即提供了一种方案,其中从伤口床的细胞能生长和恢复的缺陷2,3。

血管化不足被认为是主要的障碍,这阻碍了生物人工支架4的临床突破。与细胞的向内生长,营养物质和氧的增加,材料的血管化的需求变得至关重要。因此不足或延迟血管可导致组织工程产品5中央坏死。此外,血管提供免疫感受态细胞并去除代谢残留在再生区。高感染率和低再生只部分的血流灌注不足,在组织工程中所观察到的结果,其目的都是为了通过增加支架6,7的血管被避免。

几种策略,目的是改善血管聚焦在生物材料本身和支架的微观结构中的关键作用。有深入的研究努力,从修理转向愈合过程中再生 ,从而(重新)产生的组织与最接近的生理特性,以一个开发新的方法来恢复8,9。到研究和评估与问候他们的再生潜能的生物材料包括胶原蛋白,纤维蛋白,壳聚糖和海藻酸钠10,11。这些生物材料可以使用,组合为骨干,建立使用不同的策略,新的支架,如脱细胞组织,自组装,快速成型和静电12。为了ENHANCE人体自身的再生能力,支架可生物活化。重组血管生成生长掺入因子13或基因载体等因素后14编码已经显示出改善支架的血管。利用干细胞已被广泛证明是一种很有前途的战略,以改善血管化,其中的间充质基质细胞和内皮祖细胞获得了最多的关注15,16。其他方法试图建立包含移植前17预制的血管网络结构。尽管支架设计密集的努力和他们的生物活性,没有战略已经在临床上显著水平提高血管,并与大规模烧伤除真皮替代的,翻译生物工程材料进入临床常规只发生欲言又止18

之一的原因的血管人工组织结构仍然是一个未解决的问题,是评价新技术在体内的方法取得成功的难度。虽然在体外实验可提供支架的血管形成潜力的重要的见解,合适的动物模型是必需的,研究的关键参数,如材料的生物相容性,该处理的特别重要的安全性和有效性,并且,该组织的血管构建。因此,可靠的工具来可视化和量化的血管网络, 在体内是必需的。

在本研究中,我们提出了一种简单而可靠的方法,它允许取出的支架内的血管网络的可视化和量化。这个方法是基于组织透和数字分割。由于该方法是非侵入性的,它可以使靶材料的进一步分子和组织学分析。

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Protocol

1,准备的支架

  1. 通过使用12毫米活检穿孔产生的支架的样品。
  2. 引进生物活性分子或细胞进入支架,轻轻挤压它们,用无菌纱布引流支架。然后通过加入160微​​升含有生物活性分子或所关注的细胞的溶液中再水化的支架。仔细检查,通过代谢试验,如MTT法生物活化与细胞的成功。
  3. 如果需要的话,固定的化合物或细胞可以在支架内测试了通过在纤维蛋白的​​凝血酶溶液或水凝胶递送它们,例如,再经过补液如在步骤1.2中描述。
    注意:此步骤可以是有益的,当化合物或细胞不机械地附着到材料。一个也可以控制化合物的释放动力学..
  4. 制备的钛化网格,这将在每一个实验组和对照组被放置在每个支架下,通过cuttin克出圆形片,约14毫米的直径。
    注:钛化网格可以作为划定从伤口床再生的组织所需要的物理边界。

2,动物

  1. 在实施之前所提出的模型,请咨询相应的动物保护法,并从当地政府获得许可。在这项工作中,所有实验用小鼠进行的,根据目前德国的动物福利法,并经区政府上巴伐利亚(Regierung冯Oberbayern)。
  2. 慎选动物和应变。尽管建立了小鼠模型中,它可以转化为其他常见的动物,如大鼠,兔子或猪。
  3. 如果您正在使用的毛皮动物,剃动物的支架植入前回来。
    注意:此工作使用的6至8周龄小鼠介于20g和25克,但是不同年龄和b体重ODY权重也可以使用。

3,麻醉

  1. 进行无菌条件下操作。为了维持动物的正常体温下,使用加温垫。
  2. 之前的吸入麻醉的动物接受Buprenorphin在0.05-0.1 mg / kg体重,皮下每天8小时的剂量。
  3. 将下吸入性麻醉(异氟烷)的动物或申请同等标准的程序。确认麻醉或者轻轻挤压动物的脚趾或通过皮肤捏。
  4. 为了防止exsiccosis,在操作开始时注入0.5毫升生理盐水溶液皮下注射。

4,切除的皮肤

  1. 将动物俯卧位,并标明鼠标的背面采用了细尖永久性笔( 图1A)的中线。
  2. 定义切除区域。将缺陷中Figu所示的区域重新1C。请注意,如果缺陷被放置太尾端,动物更容易去除敷料和支架。
  3. 创建全面采用10毫米活检穿孔( 图1B)双边缺陷。冲头应仔细被迫靠着皮肤,并且不能用来完全切透皮肤,但划定切除区域( 图1C及1E)。
  4. 轻轻抬离皮肤明显用镊子沿采用精细手术剪( 图1F)标记的圆圈切割。若出血,仔细压缩用无菌纱布。切除的一步一步的描述如图1所示。
    注:该缺陷是用较小的穿孔比所述一个用于产生支架创建,以弥补该缺陷的扩大是由于皮肤的弹性。

5,支架植入术

  1. 为了使空间的蒂塔欲使网眼,延长皮肤和下面的组织的分离在2-4毫米( 图2A)的伤口边界。
  2. 将钛化网进缺损直接对创面的伤口边缘( 图2A和B)的。
  3. 脚手架的地方直接在网格。
  4. 缝合的支架与相邻的伤口边缘与4至6个单结,留下的边缘略微超过所述支架( 图2C)。
    注意:避免使用可生物降解的缝线。
  5. 缝合的透明伤口敷料上面的缺陷,以保护所述支架,同时允许监测伤口区域( 图2D)的。

6,术后护理

  1. 让每笼一只老鼠,以避免敷料和支架相互操作。
  2. 通过观察运动活动,体重,疼痛的迹象,宽容评估每天动物的一般状态在更衣室和自动切割。还监测伤口区域的出血,局部和全身感染的迹象和敷料的位置。
  3. 为了最大限度地减少了动物的痛苦,每日注射Buprenorphin在0.05-0.1 mg / kg体重或等效镇痛药物的剂量。
  4. 如果鼠标删除或损坏的伤口敷料,更换或重新连接在麻醉下。

7安乐死的脚手架和外植

  1. 在期望的时间点,由戊巴比妥(150毫克/千克)的过量牺牲动物。
  2. 马克皮肤切除的部位用永久性记号笔,其中应包括支架,并尽可能多的鼠标背部皮肤越好( 图3A)。
  3. 沿着切开用剪刀或手术刀的标线在皮肤上。拆下整个皮肤,包括支架和钛化目,通过生硬的准备下面的组织( 网络gure 3B)。
  4. 将取出的组织伸出在培养皿上( 图3CD)

8,可视化的血管网和定量

  1. 透:
    1. 成立了透设备,通过安装培养皿上面的白色光(100瓦标准灯泡)强大的源泉。
    2. 固定透射以上数码相机,以获得数码照片。
    3. 将样品在培养皿上的透设备倒挂。
    4. 采取在微距模式的完整支架的照片,以及正常皮肤的同样大小的区域。在进一步的数字分析TIFF格式存储的图像。
    5. 除组织进行进一步的生化或组织学分析。
  2. 数字细分和量化:
    1. 下载并安装VesSeg,工具软件,它可以得到FR负责EE在: http://www.isip.uni-luebeck.de/index.php?id=150&L=2%255
    2. 打开图片与VesSeg - 工具软件。
    3. 选择覆盖所述支架用于数字分析(图片→选择)的图像的区域。
    4. 为了提高船舶的对比使用选项“迟滞阈值”(图像→血管增强过滤器→迟滞阈值→顶帽变换→计算血管增强)。
    5. 进行血管图(图像→血管增强过滤器→迟滞阈值→阈值的边界)的分割。选择所述第一阈值(“船只覆盖”),因此每一个像素,这甚至远程容器状,将被标记为容器。选择所述第二阈值(“背景覆盖”),因此,只有那些像素是特别容器状将被标记为容器。
    6. 手动检查自动分割建议添加非捕获的船只和消除常见的假阳性的结构,它通常是长而薄,血管样结构,例如毛发或缝线。
    7. 计算血管的长度和覆盖船(图像→图像统计→二进制图像的统计)的总面积。
      注:对于血管长度的计算,血管生成的血管地图减薄到线,一个像素20的宽度。
  3. 根据相同的参数的支架分析天然皮肤区域,分配100%的值的原生组织和涉及该支架到该值。例如,如果白色像素的比例是60%,在正常组织和在该支架30%时,就表示该支架的50%的血管。注意:白色容器覆盖分配给周围的脚手架的正方形的面积。调整白色像素覆盖率consi数dering该圆的面积是显著较小(πX读2)比正方形(4×R 2)。

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Representative Results

一个可靠的双边全皮肤缺损所用的小鼠( 图1),其中所述皮肤可以由生物材料进行研究( 图2)来代替被创建。在这里,没有严重的并发症是中或手术操作后,无论是宏观的感染或异物反应的迹象观察。在极少数情况下,支架被当鼠标中删除丢失。伤口收缩从未被观察到( 图3)。组织透允许明确的高达30微米的宽度的血管结构的可视化,整个组织样品,其中包括二者,天然组织和植入的支架( 图4)中。数字分割后,船只可以很容易地定量在期望的时间后着床。例如,植入后第2周,62.28±8.6%的血管水平进行观察(平均值±平均值的标准误差; N = 8)21。总共约25分钟及#160;每只动物(2支架)所需要的注入,5分钟,使组织收获和生动描述和10分钟为一个取样的数字数据。作为最后一点,这种方法不影响作进一步分析移植组织的质量。例如,蛋白质和RNA的提取液可以容易地从样品通过标准方法获得。

图1
图1:全层皮肤缺损。鼠标的背部正中线标有精尖笔和活检穿孔用于标记该地区进行的缺陷将被创建(A,B,CD)。一旦该区域被定义,全皮肤用标准外科剪刀除去在特写的制备(EF)的观察。 A F该缺陷的伊纳勒结果示于(D)和放大(G)中。标尺代表1厘米ABCD和5毫米EFG。 请点击这里查看该图的放大版本。

图2
图2植入支架的。前支架的植入,网格被放入缺陷直接在伤口床的伤口边缘(AB)下。在下支架被放置在网格和缝合伤口边缘(℃)。最后,在透明伤口敷料被放置和缝合到皮肤(D)。比例尺条为5毫米(A,BC)的ð1厘米( 深)。 请点击这里查看该图的放大版本。

图3
图3的组织外植。对于组织分析,从该动物的背部的全部皮肤的手术切除(AB)和伸出于培养皿中(C)。对于透皮肤天翻地覆及数字拍照(D)。除去旁边的支架的皮肤是必需的血管数据的归一化。标尺代表1厘米。 请点击这里查看该图的放大版本。


图4透照,数字分割和量化。皮肤组织切除和内是可视化通过透照(上图)的天然皮肤(B)和所述支架的背面(A)和详细的区域的完整皮肤的血管网(C )被示出。箭头表示在(B)中的放大区域和(C)。每个下图片示出了数字的分割方法,直接位于上方的图片的结果。标尺代表为5mm。 请点击这里查看该图的放大版本。

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Discussion

有必要建立在改善血流灌注组织工程构建,这需要新的可靠的方法发展到生物材料研究中的血管形成过程中的成功做法。用于制造支架的血管的体外可见常见的方法包括使用显微镜,它提供了高分辨率的工具。在大多数情况下,虽然,这种方法仅限于较小的组织区域的分析,而且往往是昂贵的和费时的。此外,它通常包括复杂的标签和染色的方法,其中血液灌注容器不能从非功能性的人22来区分。在使用方法来评估血管的功能是电子计算机断层扫描,磁共振成像和正电子断层扫描电子。这些方法具有极其昂贵的设备和低分辨率功率23的缺点。另一种常用的策略,以可视化的血管是使用血管其次是组织24化学腐蚀类型转换。该方法使得能够获得与血管网的代表三维结构,但是结果强烈变化取决于人工灌注和组织的电平不能被用于进一步的生化研究,如蛋白质或RNA的分析。在鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型25和啮齿动物26,27的皮褶室模型已经证明是有效的方法来分析血管生成,毛细管灌注和血流量。最近,皮褶室模型也被用于组织工程应用评估基于MSC的血管生成的策略在多孔性聚氨酯的支架28。用于体内成像,这些方法存在重要的优点,并代表一个有吸引力的目标为这里所描述的方法。

这里提出的模型的开发是为了克服的方法米的缺点上述entioned。取的皮肤的独特固有特性的优点,充分缺陷被创建并用于评价生物材料的血管化。皮肤是一个外部器官,它允许更容易的可视化和操纵组织。由于其大的表面和均匀的结构,多个缺陷可以创建它使内部比较可能,同时减少所需的研究的动物的数量。由于动物的前 - 后对称,双侧缺陷但是建议;当双方都在相互比较的全身效应的影响应当予以考虑。最后,皮肤较首选透的最佳器官相当透明组织。虽然这里所描述的方法适用于许多不同的天然组织和几个生物材料,该协议最初建立与一个双层的基于胶原的支架是FDA批准并用于临床使用的解RMAL维修。用于该方法的实施的一个重要的先决条件是,该支架具有将部分透明的。取决于所选择的脚手架材料,可能需要对协议的一些调整。此前,本集团已采用的模型来说明如何人间充质细胞的应用,提高了支架的血管29。

一个标准的数字照相机和光源是足够的血管网络的可视化,其可以通过免费软件来定量。图片由VesSeg-Tool的半自动分割由两个步骤组成。在第一步骤中,从血管网拍摄的图像是造影增强通向容器地图。然后,该分割算法选择的容器区域,最后,分割提案被提出来作为一个图象( 4)30。在第二处理步骤中,使用该容器连接str中的事实uctures(即容器的像素挂一起在空间上),第二分割用于从第一个唯一的真容器中的像素和所有真容器的像素来选择。因此,“一”的最终标签只授予从第一个图像的低信心器像素是连接在一个链邻居到高可信度的船只像素的第二形象。

因为没有化学添加剂是必要的,这种方法也具有成本效益。数字分析显示了良好的重现性,在确定容器尺寸,血管内的距离,分支点,血管面积和血管网总长度的个数。我们以前曾表明,血管网络可以通过透可更好地可视化不是通过无线电血管造影研究31。泰坦网格的存在具有双重功能。一方面,它可以防止伤口的收缩,这是使用鼠标莫的一个共同的缺点德尔斯;在另一方面,它提供了脚手架和伤口床之间的物理边界。因为大多数支架是可生物降解的,最后提到的功能是至关重要的过程中支架的收获物理delimitate脚手架和伤口床之间的边界。其中该方法的主要缺点是explanting的支架和分析,以一个单一的时间点,因此,上述限制的需求;因此,动态观察血管化是不可能的当前设置。另一个问题是,这种方法是有限的,以允许透射半透明的生物材料。最后,即使操作过程不需要特殊的手术技巧,约6学习曲线 - 12手术的动物都被认为掌握了正确的方法。

我们引入了时间和成本有效的方法,它允许高清晰度的可视化和血管结构的量化河epresenting的理想方法比较血管在不同的生物材料或不同的支架,生物活化策略。这种方法很容易建立,并且不需要特殊的设备。这种模式的一个重要特点是,船舶可视化后,组织可以进一步用于研究,如组织学或分子生物学分析。

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Disclosures

感兴趣冲突声明:

所有作者:无

财务披露:

没有一个作家有财务利益的任何产品,设备,或者在这个手稿中提到的药物。

Acknowledgments

Integra真皮再生模板,请通过Integra生命科学公司提供。资金配套工作来源:(上午十时正15090007),这项工作由CIRM,BMBF的早期平移二奖及FONDAP中心基因组调控既要JTE了部分资金。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethilon P-3 13 mm 3/8 circle 5-0 Ethicon, Norderstedt, Germany 698G Ethilon polyamid-6 precision point-reverse cutting suture
Biopsy punches (10 mm) Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA P1050
Biopsy punches (12 mm) Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA P1250
Digital camera  Ricoh, Hannover, Germany Cx1
Gazin Mullkompresse  Lohmann und Rauscher, Neuwied, Germany 13622 Sterile gauze (10 cm x 10 cm)
Double-layer collagen-based scaffold (8' x 10') Integra Life Science Corporation, Plainsboro, NJ, USA 88101
Isoflurane, liquid-gas for inhalative anesthesia  Baxter, Unterschleissheim, Germany 100196040
Pentobarbital, 16 g / 100 ml Fa. Merial, Hallbergmoos
Nuri Nu/Nu Nude mice, CrLNU-Foxn1nu Charles River, Sulzfeld, Germany Strain code 088 Athymic nude mice, 6 to 8 weeks of age and with a body weight between 20 to 25 g 
Buprenorphine (0.3 mg/ml) Essex Pharma GmbH, Munich, Germany
Titanized mesh (15 cm x 15 cm), extralight PFM Medical AG, Köln, Germany 6000029
Tissucol Duo S Immuno 2 ml Baxter Germany GmbH, Unterschleißheim, Germany B1332020110614 Fibrin-thrombin solution 
Transparent adhesive drape (30.5 cm x 26 cm) KCI Medical Products, Wimborne Dorset, UK M6275009/10

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