タンパク質-DNA相互作用の研究のための単一分子マニピュレーションとイメージングを組み合わせる

Biology

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Summary

ここでは、二枚の光学トラップされたマイクロスフェアの間に懸架単一のDNA分子と相互作用する単一の蛍光標識タンパク質分子を検出するための機器および方法が記載されている。

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Monico, C., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S., Capitanio, M. Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions. J. Vis. Exp. (90), e51446, doi:10.3791/51446 (2014).

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Abstract

Introduction

単一分子(SM)の技術が大幅に伝統的な、バルク溶液の測定1-3のいくつかの制限を克服する必要性に対応するために、過去30年にわたって開発してきた。単一の生物学的分子の操作は、バイオポリマー4の機械的特性を測定し、タンパク質-タンパク質5およびタンパク質-DNA相互作用6,7の機械的パラメータを制御する機会を作成した。 SMの蛍光検出は、一方で、ナノメートルの精度で単一分子を局在化および追跡の可能性をもたらす、 インビトロおよびインビボでのタンパク質活性を研究するための驚くほど用途の広いツールを表す。 SM画像に器具点広がり関数のフィッティングを介して、実際には、一方が信号対雑音比(SNR)に主に依存し、約1ナノメートル8,9の限界に達し精度で局在化を達成することができる。これらの方法論は強力見つけるモータータンパク質のダイナミクスの研究においてだけでなく、DNA結合タンパク質におけるターゲット探索の基礎となる拡散プロセスのアプリケーションに最適です。ターゲット上のDNA配列の機能、滞留時間などの拡散定数を決定し、正確に一次元拡散イベント中探求DNAの長さを測定する能力は、タンパク質-DNA相互作用の動力学の研究のための調査のための強力なツールを表す特定のターゲット探索のメカニズム。

最近では、これら2つの技術の組み合わせは、例えば、生物学的基質(例えば、アクチンフィラメント又はDNA分子)と相互作用パートナー酵素の検出/局在化(同時操作を可能にする実験装置10-14の新世代を生産しているミオシンまたはDNA結合タンパク質)。これらの技術の利点は、主にENAしたがって、捕捉されたポリマー上の機械制御を発揮する可能性に載る力又はトルクに対する相互作用のダイナミクスの研究をブリンブリン。また、方法は、古典的なSM方式、 すなわち、表面上の研究中の分子の固定化のための必要性(ガラススライドまたはマイクロスフェア)の主な制限の一つを避け、表面から遠い生化学的反応を測定することができる。

2単一分子技術の組み合わせは、15(nmの精度でローカライズが必要な場合は特に)は、主に機械的安定性および十分なSNRの要件に起因する、いくつかの技術的困難を克服する必要があります。特に、ノイズの低減を光ピンセットとSMの蛍光検出を結合し、捕捉赤外線レーザー16および生物学的複合体11が最重要である実験的測定の性能の組み立てのための生化学的なバッファのコントロールから光退色する。ここでは、正常に実行するための方法を記載デュアルトラップ/ SM蛍光ローカライズセットアップでの測定値。方法は、(Atto532付き)ラクトースリプレッサータンパク質(LacIリ)蛍光標識の例に示されており、それは、特定のLacI結合配列( すなわち、オペレータ)を含有する(二つの光ピンセットの間に閉じ込められた)DNA分子に結合するとして検出される。私たちは、ターゲット検索処理においてその輪郭に沿ってDNAと拡散のLacIの結合を検出する方法の有効性を示す。この方法は、DNA配列およびDNA結合タンパク質の任意の組み合わせの、並びに他のシステム(または微小管アクチンフィラメント及びそれらと相互作用するモータータンパク質)にも適用可能である。

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Protocol

ナノ安定性を持つ1。光ピンセットのセットアップ

実験装置は、1%以下のトラップレーザーのナノメートルレベルと強度の変動で安定性を指し示す2つの光ピンセットを提供する必要があります。 、トラップの剛性(0.1 PN / nm)で測定帯域幅を(画像取得速度20秒-1) -これらの条件の組み合わせは、典型的な張力(pNの数十1 pNで)の下でダンベルのナノメートルの安定性を保証する。実験のスキームを図1に示されている。

  1. 光ピンセットの設計と建設15,17:
    1. 機械的な振動を低減するために積極的なアイソレータを光学テーブル上の実験装置をマウントします。音響ノイズや顕微鏡構造の機械的共振を吸収するために、エラストマーアイソレータ上の顕微鏡の構造をマウントします。
    2. rに、レーザ源の近くに、トラッピングレーザーの経路内に光アイソレータを挿入する光フィードバックによるランダム振幅変動を引き出す。
    3. できるだけ多くのトラップレーザーの経路長を削減し、空気の流れと乱流に起因するレーザーポインティング変動を低減するために密封されたボックス内のパス全体を囲みます。
    4. 直交偏光を有する2つのビームに:シングル、近赤外レーザ光源(YAGレーザー、1064 nmの波長のNd)を分割することにより、二重の光ピンセットを作成します。彼らは緊張12下ダンベルの振動を引き起こすため、時分割トラップを使用しないでください。
    5. (少なくとも)1トラップとDNA張力の正確なレギュレーションの細かい動きを可能にするために、ダイレクト·デジタル·シンセサイザ(DDSを)によって駆動音響光学偏向器(のAOD)を使用します。のDDSは、電圧制御発振器(VCO)よりも良好なトラップの安定性を可能にする。
    6. サブナノメートルの精度で捕捉されたビーズの位置を検出する凝縮器の後焦点面に2つの象限検出器のフォトダイオード(QDPs)を挿入する。
  2. その強度Fをチェックしてください顕微鏡入り口で捕捉レーザのluctuationsは、画像取得の速度よりも大きい帯域幅を有するフォトダイオードを使用して1%未満である。
  3. 2トラッピングレーザーのポインティング安定性を確認します。
    1. リン酸緩衝液中のシリカビーズを準備します。シリカビーズを20μlに希釈する(1.54ミクロン、固形分10%)をアセトン1mlの中に、簡単に30秒、渦を超音波処理し、遠心2分で19000×gで。 1ミリリットルのアセトンを繰り返し洗濯に再懸濁。 50 mMリン酸緩衝液1mlで再懸濁を2回洗浄し、最後に50mMリン酸緩衝液100μl中に再懸濁します。
    2. シリカビーズを光ピンセットのキャリブレーション:(約60μm厚)ダブル粘着テープを使用した顕微鏡スライドにカバースリップを取り付けることで、フローセルを作製。 1 mg / mlのBSAをフローと3分待ちます。シリカビーズをリン酸緩衝液中で1/1000に希釈流れ、シリコングリースでフローチャンバーをシールする。各トラップでのトラップ1のビーズとパワースペクトル法18を使用してトラップを校正。 ペンチルアセテート、ニトロセルロースにシリカビーズを準備します。シリカビーズを20μlに希釈する(1.54ミクロン、固形分10%)をアセトン1mlの中に、簡単に30秒、渦を超音波処理し、遠心2分で19000×gで。 1ミリリットルのアセトンを繰り返し洗濯に再懸濁。ペンチルエチル1mlに再懸濁し、2回洗浄する。最後に、ペンチルエチルに溶解し、0.1%のニトロセルロースと酢酸ペンチルで再懸濁します。
    3. 第二カバーガラス(24×60 mm)を使用してカバースリップ(24×24ミリメートル)の表面上にペンチルアセテート+ 0.1%ニトロセルロースに溶解し1.54ミクロンの直径のシリカビーズ2μlのスプレッド。フローセルを作成するために両面テープを2枚使用して、顕微鏡スライドにカバースリップを取り付けます。 50 mMのリン酸緩衝液でフローセルを記入し、シリコングリースでそれを封印。
    4. 2,000X倍率で明視野顕微鏡における画像1シリカビーズ。ビーズ画像190のpの直径を有するように視野は、768×576ピクセルで取得した7×5μmであるべきである↑画素数黒つぶれ白とび。参考文献17のように、回折リングから画像重心およびzからのx-y位置を計算し、nmの精度以上とピエゾステージを移動ドリフトを補正し、フィードバック·ソフトウェアとの熱ドリフトを補償する。
    5. (QDPからのxy信号レベルが校正中に測定された同じでなければならない)と位置ノイズとQDPからその標準偏差を測定し、ビーズの中心部で、左トラップの中心に重なる。右のトラップの測定を繰り返します。

ナノメートル精度で2単一分子の局在

  1. 蛍光顕微鏡の設計と建設15,19
    1. ナノメートルの測位精度のために必要な高い信号対雑音比に達するために、高い量子効率および電子乗算CCDを使用する。
    2. 画像のピクセルサイズ〜​​80nmのを取得する光学系を選択する(例えば、16ミクロンのカメラの画素サイズの画像倍率〜200X)。これは名基本仕様ですピクセレーション8によるローカリゼーションエラーを無視するciently小さいが、十分な大きさは、ピクセルあたりの光子のかなりの数を収集します。
    3. 励起源として、関係なく向きの、単一の発色団の励起を最大にするために(λ/ 4波長板を通過させることによって)非偏光(非偏波保持光ファイバを通過することによって)、または円偏光であるレーザ光を使用する。
    4. 効率的にカットオフ励起とトラッピングレーザ光の両方を放出バンドパスフィルタを選択してください。注:私たちの実験では、Atto532色素で私たちのタンパク質を標識し、100 nmの帯域幅は600nmを中心とするバンドパス発光フィルターを使用していました。

3マイクロフルイディクス

バッファー交換と「ダンベル」アセンブリ、 すなわち、2つの光学的にトラップされたマイクロスフェアとの間に単一のDNA分子のアンカリング、特注の層状マルチチャンネルフローの正確な制御を実現するために、システムが開発されなければならない。これは、フローチャンバ、圧力リザーバ及び圧力制御システム( 図2)によって構成されている。

  1. フローセル調製
    注記:タンパク質-DNA相互作用に単一分子実験のために使用されるフ​​ローチャンバーは4並列バッファフローまで可能にするために、好ましくは4の入口および1出口を有する、別の実験に必要な成分の一つを含むそれぞれ:ビーズ、DNAを蛍光標識されたタンパク質、および撮像バッファ。フローチャネル内のコンポーネントの分離は、ダンベルの効率的な組立を可能にします。また、撮像チャネルタンパク質を拡散するバックグラウンド蛍光を回避し、数ナノメートルオーダーの精度でDNA結合タンパク質の局在化に必要な高信号対雑音比を達成するの​​に有用である。
    1. 4の入口と一つの出口を作成するためにドリルダイヤモンドチップを備えた顕微鏡スライド(76のx 76×1 mm)の中に、直径1mmの穴、。
    2. クリーン番目電子顕微鏡は、O-リングを挿入し、アクセス孔を取り囲むスライドで接着リングとエタノールと中心とポートを摺動する。それは、糊付け処理を乱す指紋を、避けるために、このステップの間に手袋を着用することの基本です。
    3. スライドにNanoPortsをクランプし、完全な取り付けを可能にするために1時間、180℃に予熱したオーブンに入れてください。
    4. 紙の上にフローセルの概略パターンを描画します。チャンネルは広い〜3mmとし、顕微鏡スライド上の穴の位置と一致する必要があります。
    5. パラフィルムの2枚の上に描画を置き、メスで描かれた輪郭線に沿ってシャープで連続カットを行う。形成された任意の突起を除去します。ただきれいなサポートを保証するために使用される下位パラフィルム層を捨てる。
    6. 逆さまに金属製のサポートにおける添付NanoPortsを含む顕微鏡スライドを配置します。
    7. 慎重に確認して目を作り、穴のパラフィルム室のアウトラインを揃えるパラフィルムでチャンバの入口及び出口を出過ぎるません。
    8. 清掃顕微鏡カバースリップ(62のx 56のx 0.15ミリメートル)でカバーし、慎重にチャンバーを囲む余分なパラフィルムを除去します。
    9. その上に一定の圧力を適用するためにフローセルの上に、以前に加熱し、120℃で、二つの熱ブロックを配置する。パラフィルムを約25分間溶融してみましょう。
  2. 圧力リザーバとバッファコンテナ
    圧力容器は、プレキシグラス(または類似の)で作られており、6バッファコンテナの収容を可能にする必要があります。少なくとも二つの余分なバッファのコンテナを持っていることの可能性は、機器の柔軟性を向上させます。透明容器とチューブが大幅に閉じ込められた気泡の流れのシステム処理およびトラブルシューティングを支援ことに注意してください。プランジ​​ャが以前に除去された滅菌、使い捨てルアーロックチップシリンジ(2.5ml)を、良好なバッファのコンテナであり、入口管との容易な接続を可能に。そのことを確認してください総液量は、蓄圧器内の空気体積、滑らかで安定した流れを得るために必須の条件と比較して小さい。
    1. 実験中にオンまたはオフにバッファフローを回すためのバッファ容器の出口で遮断弁を接続します。
    2. 顕微鏡ステージ上でフローセルをマウントします。ポリエーテルエーテルケトン管(内径〜150μm)でフランジレスフィッティングとフローチャンバーの入口に遮断弁を接続します。チューブとフローセルのNanoPortアセンブリ間の結合としてフッ化エチレンプロピレン管の約3センチ(内径〜500μm)を追加します。この工程は、ガラスからのフローセルまたはNanoPort剥離の破損を回避するために、チャンバ入口のバッファ流を減少させるために不可欠である。大内径の管の使用は、単独で、他方では、生物学的サンプルの膨大な量を必要とするであろう。
    3. 大気圧下でのオープンファルコンチューブにフローチャンバ出口を接続します。このチューブは、フローチャンバーから流出するバッファの処分となる。
  3. 圧力制御システム
    1. 細かく蓄圧器内の空気圧を調整可能な圧力制御システムを構築する。これは、2つのコンピュータ制御ソレノイドバルブ、0.5気圧の源(コンプレッサー)、大気圧に二つに接続つを使用することによって行うことができる。電磁弁を繰り返し増加または所望の値に達するまでライン内の圧力を減少させる約7ミリ秒間開かれる。注:このアプローチは、カルロスブスタマンテ20から適合され、それは、ステッピングモータシリンジポンプ21を用いてより滑らかな流れが得られた。
    2. 蓄圧器に加えられる有効圧力を監視するためにカスタム書かれたソフトウェアによって制御された圧力変換器を追加する。典型的な作動圧力は、フローシステムのコンポーネントを洗浄するためのダンベルアセンブリおよび200ミリバールで20ミリバールのオーダーである。

    ビオチン化デオキシシチジン三リン酸と4 DNAテーリング(ビオチン-dCTPを)

    DNA分子は、流下で捕捉されたビーズに係留その拡張を容易にするためには1μmよりも長くする必要があります。また、長いDNAは、DNA結合タンパク質を照らすからのIRトラッピング光を防ぐことができます。これは、IR光の吸収の増加退色で発色団励起された結果から、特別な関連性がある。注:本研究では、DNA分子は、3.7μmで長さであった。分子は、主演算子O1と二つの補助事業者をそれぞれ1コピーの3つのコピー、O2およびO3を含んでいた。これらの配列は、このように捕捉されたビーズとIRレーザービームからほぼ等距離生じる、分子の中央に挿入されている。

    1. ビオチン14-dCTPを、5×ターミナルデオキシヌトランスフェラーゼ酵素(TdT)緩衝液(1MカリウムCAの4μlに60ピコモルで直鎖DNAの1ピコモル3 '末端ミックスcodylate、125mMのトリス、0.05%(v / v)のトリトンX-100、5mMののCoCl 2(25℃でpH7.2)中)とのTdTとのddH 2 O1.5μlの20μlの総体積である。 15分間37℃で混合物をインキュベートする。これは、DNAの末端あたり最大60ヌクレオチドの付加をもたらすであろう。 DNAの3'-オーバーハングが凹状または平滑末端よりも高効率で尾行されていることに注意してください。
    2. のTdT反応緩衝液からのCoCl 2を除去するために、スピンカラムまたはフェノール/クロロホルム抽出とその後のエタノール沈殿した尾DNAを精製する。
    3. 精製後、DNAは、数週間または長期間-20℃で4°Cで保存したが、繰り返し解凍および再凍結を回避することができる。

    ATTO532と5。の標識タンパク質のチオール基

    システイン残基の改変によってラベル付けすることは、タンパク質の活性を変化させなければなりません。この問題を克服するために、LacIリ変異体を使用し、LacIQ231C、whichは、タンパク質の安定性22に干渉しないことが示されている位置231、この変異体は、位置231での野生型および化学修飾の同じ特性が維持さのモノマーごとに1つのシステインを運ぶ。注:私たちはATTO532マレイミドを有するタンパク質を標識した。

    1. タンパク質は7.0から7.5の範囲のpHを2〜10 mg / mlの範囲の濃度で緩衝液中に溶解されていることを確認。注:これらの実験では、LacIリ0.3 Mリン酸カリウム中に溶解し、5%ブドウ糖液、pH7.5(緩衝液A)。
    2. H 2 O中の100mg / mlの最終濃度にトリス(2 -カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(TCEP)を溶解TCEP溶液は、使用前に新たに調製しなければならない。
    3. 慎重に3μlのTCEPと渦を有するタンパク質を100μlを混ぜる。
    4. 低照度状態で作業を10mg / mlの最終濃度までN、Nジメチルホルムアミド(DMF)中に色素を溶解させる。完全に溶解するまでボルテックスする。
    5. 反応マイルX:慎重にタンパク質+ TCEP及び渦に色素の33を添加する。高速スピン極力溶液を収集する。
    6. 20℃でシェーカー(8000回転)での2時間反応ミックスをインキュベート(または4℃CO / Nにおいて)、光から保護。
    7. H 2 O中の100mg / mlの最終濃度に(GSH)縮小L-グルタチオンを溶解反応混合物に3μLを加え、15分間8,000 rpmでシェーカー上でインキュベートする。 GSHはチオール基の反応性を遮断することにより、反応を停止します。
    8. 標準的なゲル濾過カラム、透析またはスピン濃縮器を使用して標識されたタンパク質を精製する。注:これらの実験において、標識されたLacIは10 kDaのカットオフスピン濃縮器を使用して精製した。
      1. バッファAの最大12 mlの反応混合物を希釈コンセントレータデバイスに適用し、8,000×gで、1時間、4℃で遠心分離して。ラベルされたLacIリは、このように、約500μlの最終容量に濃縮し、過剰の染料はfloの中で膜を通過するWスルー。フロースルーと繰り返しステップ5.8.1の3倍以上を捨てる。
    9. -80℃で小分けし、ストアに標識されたタンパク質を分割します。凍結融解の繰り返しは避けてください。

    6。複合光トラッピングと1分子蛍光イメージング実験

    1. バッファコンテナに緩衝液Aを1mlを追加し、接続チューブを洗浄し、細胞を流す200ミリバールの圧力をかける。 DNA、ここで、以下のステップで上の結合タンパク質の拡散を最大にするために、低イオン強度緩衝液で置換することができるバッファ。注:これらの実験では、TBEの0.5倍を使用していました。
    2. 流れの滑らかさが中断される可能性があり、空気の泡の存在について確認してください。出口管に優しいフリックが残っている気泡を除去するのに役立ちます。
    3. 20ミリバールの圧力を低下させ、すべてのチャネルとチューブは、気泡から明らかであり、バッファは、すべてのチャネルで同様の速度で流れていることを確認します。
    4. 300μlの最終容量にサンプルを準備します。ストレプトアビジンでコーティングしたポリスチレンビーズ1.87ミクロン;セクション4に係る双方の四肢にビオチン化直鎖DNAの20 PM、; LacIリ四量体の300 PMはセクション5に係るATTO532で標識。
    5. 最初のチャネル中のビーズ、第二中のDNAのみイメージングバッファー(緩衝液A +酸素スカベンジャーシステム)と第4チャネルでの標識されたタンパク質を有する第3のチャネルは、次の順序で、注射器の容器の一つに、各サンプルを追加します。
    6. サンプルは、流路の内側に届くようにする3分間200ミリバールで流れをオンにします。その後、20ミリバールに圧力を低下させる。
    7. 明視野照明下での最初のチャネルを画像化する一方で、2光ピンセットをオンにし、各トラップにポリスチレンビーズをキャッチ。
    8. 他のビーズがトラップに陥ることを避けるために、第二のチャネルに迅速に移動します。 DNAチャネル内の到着は、ビーズの流れの終わりまでに目立ちやすいことに注意してください。
    9. Oの使用AODね、二枚の光学トラップされたビーズ間での流れ伸長DNAの付着を可能にするために、他のビードの近傍で前後に1トラップ(ビーズ)を移動。 DNAのダンベルが形成されると、静的ビーズが積極的にトラップすることによって前後に移動されるビーズの移動に追従開始する。
    10. バッファチャネルに迅速に移動して、バッファフローをオフにしてください。単一DNA分子の存在を確認するために力-伸長曲線解析4,23-25 ​​を行う。複数の分子が存在する場合、ダンベルを破棄し、ステップ6.7から再び開始( すなわち、力-伸長曲線の位相を高めるエンタルピーは、DNAの輪郭の長さよりも短い長さで起こる)。
    11. 単一のDNAダンベルが得られると、再び流れをオンにし、タンパク質チャネルにダンベルを移動します。 DNAと標識のLacIの相互作用を監視するために広視野蛍光顕微鏡に切り替えます。流れの電源をオフにして、取得を開始します。

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Representative Results

成功した実験では、一つ(または複数)の標識タンパク質は、DNA分子( 図3A)に沿っ/アンバインドおよび/ ​​または一次元拡散結合受ける。 DNA分子に沿ったタンパク質の局在化は、DNA配列の関数として動力学的パラメータの定量化を可能にする。 1次元拡散を引き起こすバッファー条件が適用されると、それは、拡散係数D 1D例えば、タンパク質の軌跡に従い、決定することが可能である。

単一のスポットの正確な位置は、各フレームにおいて、大きなデータセットを扱う場合に、より迅速な、最近発表されたアルゴリズム(ラジアルで、あるいは、二次元ガウス関数と点広がり関数(PSF)をフィッティング等により決定することができるシンメトリーセンター、RSC)26,27。後者の方法は、一般的にガウシアンフィッティングに匹敵する定位精度を達成すると、画像の最大半径方向の対称点を決定する。 BOで番目の場合は、追跡が自由に27アクセスできるMATLABルーチンを介して達成することができる。

図3Aは、DNA分子の中心に位置する別のLacIリ分子が特異的に一人のオペレータにバインドされている間、単一のLacI分子は、非特異的DNA配列に沿って拡散する典型的な実験のkymogramを示している。 図3Bは、2つの位置を示すLacIリ分子は、時間の関数として二つのトラップ(x)の中心を結ぶ方向に沿って(RSCを使用して得られる)。 DNA分子に沿って拡散する分子の位置から、以下の式に従って異なる時間間隔で平均二乗変位(MSD)を算出した。

式(1) (1)

Nは、測定された位置の総数であり、nは 、測定指数はfはどこへ行くのか Nにロム1。純粋な一次元ブラウン拡散の場合には、MSDに直接比例しているのnΔtの拡散係数に等しい傾きで、(Δtは 2つの連続フレーム、本発明者らの実験では100ミリ秒の時間間隔である)(MSD(nは、N) = 2D 1nΔt )4は 、DNAに沿って拡散する分子について、MSDnΔtの対のプロットを示していますタンパク質の拡散係数を容易にMSDnΔtの対のプロットの線形フィットから得ることができる。あり、n増加するにつれて、式からMSDを計算するためのポイント数ていることに注意してください。図1は、結果的に減少する。 MSDの評価における誤差は、このようにnは増加します。このような理由から、私たちはN = N / 4に私達の分析を制限することにしました。これは、とにかく多くのラボで使用されるN / 10に比べて非常に大きな値である。

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ハロゲンランプ(H)、コンデンサ(C)、試料(S)、ピエゾ·トランスレータ(のx-yおよびz)、対物レンズ(O)、低倍率カメラ(CCD 200X)および高:図1は、実験装置から構成され-magnificationカメラ(CCD 2,000X)は(BS 50:50ビームスプリッタキューブである)nmの安定化フィードバックに使用される。ダブル光ピンセットは、顕微鏡の光軸からのダイクロイックミラー(D2及びD3)を介して挿入され、抽出されのNd:含み、ビームスプリッタキューブ(PBS)、音響光学偏向器(AOD)、1064nmの干渉フィルタ(F1およびF2)を偏光/ 2波長板を、YAGレーザー(波長1064nm)、光アイソレータ(OI)λ、象限検出器フォトダイオード(QDP)。 QDPsからの信号は、アナログ - デジタル変換器(ADC)を介して取得し、FPGAボードを精緻化した。二特注のダイレクト·デジタル·シンセサイザ(DDS)は、トラップ 'の位置を制御するためのAODを運転した。デジタル入出力ボード(DIO)を制御それぞれ圧縮機(0.5気圧)と周囲圧力(0気圧)、に接続された2つの電磁弁(V1とV2)の開口部。 LabVIEWソフトウェアは圧力計(PM)を介して蓄圧器(C1)内の圧力を監視し、自動的に所望の圧力レベルに到達する二つのバルブの一方を開いた。蛍光励起が重複したNdによって提供された:YAGレーザー(532nm)を電子上に投影された画像は、カメラ(EMCCD)を乗じた。 Mは、F3、発光フィルター可動ミラーである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2(A)フローシステム図。圧力制御システムは、圧力計(PM)と二つの電磁弁V1及びV2の接続によって構成されているそれぞれ、0.5気圧(PRS)での圧縮機に、周囲圧力(ATM)に編。 X1及びX2は、3ウェイコネクタを表す。バルブの開口を微4緩衝液容器に加圧リザーバC1内の所望の圧力に達するように調整される。各入口管は、マルチチャネルフローチャンバの入口/オフ弁とは無関係を含む。出口管は周囲圧力に配置廃棄物容器C2に接続されている。図面は縮尺通りではない。マルチチャネルフローチャンバーの(B)概略図。四層流は、個別に官能化されたポリスチレンビーズ、DNA分子、イメージング緩衝液および標識されたタンパク質の転位。二つのビーズは、二重の光ピンセットでキャッチし、DNAは、それらの間に係留できるようにするためにDNAのチャンネルに移動されます。 DNA力 - 伸長分析は、単にその後、DNA、タンパク質チャネルでインキュベートされる、単一DNA分子の存在を検証するために緩衝チャネルで行われている。挿入図はマグニを示している最終分子の構築物の品名、バッファチャネル内の1分子イメージングのための準備ができて。図面は縮尺通りではない。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
延伸されたDNA分子と相互作用する単一のLacI分子の局在図3(A)kymogramの縦軸をx、横軸は時間(100ミリ秒の取得時間)であるが、DNA分子に平行な座標を表す。(B 時間のLacI分子の)X位置 。分子の位置は、RSCによって決定した。画像は、100ミリ秒の露光時間および1.25×10 -2 Wセンチ-2 EXCIで取得したテーションレーザ強度。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
延伸DNA分子に沿って拡散し、単一のLacI分子に対する時間のMSD図4プロット。MSDは、 図3B(赤色)で表示位置記録から計算されます。図に示されたデータの線形回帰から得られた拡散係数D 1Dは 、0.030±0.002ミクロン2-1である。

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Discussion

過去10年間で、単一分子マニピュレーションとイメージング技術は、空間および時間解像度の面で大きな進歩を見てきました。操作およびイメージング技術の組み合わせは、現在では、DNA、RNA、または細胞骨格フィラメントとして単一の生物学的ポリマーの機械的条件の制御を可能にする強力な器具のベースと、同じポリマーと相互作用する単一のタンパク質の同時局在化である。閉じ込められたポリマーの機械的条件を制御することが特に重要である。実際に、生細胞における、核酸は、連続的に酵素と相互作用するタンパク質によって引き起こされる機械的応力を受けている。同様に、相互作用するタンパク質や分子モーターの複雑なネットワークは、細胞骨格フィラメントの張力を調節する。一方、検出および正確に核酸と相互作用するタンパク質を局在化する可能性は、それらの経口の関数としての分子相互作用の測定を可能にするDNAまたはRNA配列に沿っsition。

単一分子操作とイメージング技術を組み合わせることにより、実験装置の慎重な設計と生物学的構造物を必要とします。光トラップは中断ポリマーのナノメートルレベルの安定性を確保し、安定した支持を提供する必要があります。このような安定性は、機械的なノイズの多数の供給源からの実験装置を慎重に分離を通して、レーザーポインティングと振幅の変動を最小限に抑えることによって到達することができます。光トラップの正確な(サブnm)の動きがのDDSによって駆動のAODを使用して達成される。ここでは、最適化し、ナノメートルレベルで光ピンセット」安定性を確認するためのステップバイステップのプロトコルを示した。

EMCCDカメラに接続されたシンプルな広視野落射蛍光顕微鏡を懸濁したポリマーとの相互作用の単一発色団をローカライズするために使用されている。本発明者らの実験アッセイは、空間的分離ベットを確保するために、長いDNAまたはRNA分子(≥6kbpの)に制限されトラッピングレーザビームと蛍光プローブを予期する。発色団が励起状態16にある間に、実際には、可視励起レーザと近赤外レーザートラッピングの重ね合わせは、近赤外光の吸収に起因する発色団の光退色増強につながる。ダンベルアセンブリは、より良い私たちは詳細な説明を提供している多チャンネルフローセルを用いて得られる別のトリッキーな手順です。私たちは、バッファフローとどのように他の方法で真剣に実験を損なう可能性が気泡を回避するために最適化する方法を示した。私たちは、タンパク質標識のために、ストレプトアビジンでコーティングしたビーズを用いてダンベルアセンブリに必要とされるビオチン、およびプロトコルを用いたDNA四肢を標識するためのプロトコルを説明した。最後に、延伸されたDNA分子上の単一のラクトースリプレッサー分子の結合および拡散が定量化された実験を行うためにステップバイステップの動作を示した。

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Acknowledgments

私たちは、サンプル調製のヘルプのためのマイクロ流体とアレッシアTempestiniのヘルプはハイス·Wuite、アーウィンJGピーターマン、ピーターグロスに感謝します。本研究は、n 284464を°とRicerca 2013 RBFR13V4M2教育、大学·研究FIRB 2011 RBAP11X42L006、フトゥロイタリア省から、との枠組みの中でグラント契約の下で、欧州連合(EU)セブンス枠組み計画(FP7 / 2007年から2013年)によって賄われていたフラッグシップ·プロジェクトNANOMAX。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Elastomeric isolators Newport Newdamp Choose the appropriate Newdamp elastomer depending on the microscope weight and resonance frequencies
Optical isolator Optics for Research IO-3-YAG-VHP
Nd:YAG laser, 1,064 nm wavelength Spectra-Physics Millennia IR
Acousto-optic deflectors (AODs) A&A optoelectronic DTS-XY 250
Direct Digital Synthesizers Analog Devices
Quadrant detector photodiodes OSI optoelectronics SPOT-15-YAG
DIO and FPGA board National Instruments NI-PCI-7830R
Halogen lamp Schott KL 1500 LCD
Condenser Olympus U-AAC 1.4NA Aplanat Apchromat
Objective Nikon CFI Plan Apochromat 60x 1.2NA water immersion
532 nm laser Coherent Sapphire
CCD 200X and 2000X Hamamatsu  XC-ST70 CE
Electron-multiplied CCD Hamamatsu  C9100-13
Piezo stage with nm-accuracy Physik Instrumente P-527.2CL 
Emission Filter Chroma Technologies 600/100m
Silica beads (1.54 mm) Bangs Laboratories SS04N/5303
Albumin from bovine serum (BSA) Sigma Aldrich B4287
Pentyl acetate  Sigma Aldrich 46022 Flammable liquid and vapor (No 1272/2008)
Nitrocellulose Sigma Aldrich N8267-5EA Flammable solid  (No 1272/2008)
Heat block MPM Instruments Srl M502-HBD with 2 removable blocks; preheated at 120 °C
NanoPort assemblies Upchurch Scientific Inc. N-333
Polyetheretherketone tubing  Upchurch Scientific Inc. 1535
Home-made metallic holder for the assembly of the flow-chamber pressure reservoir made of Plexiglass
Luer lock-tip syringes 2.5 ml Terumo SS 02LZ1
Shut-off valves  Upchurch Scientific, Inc. P-732
Flangeless fittings  Upchurch Scientific, Inc. LT-111
Fluorinated ethylene propylene tubing  Upchurch Scientific, Inc. 1549
Two computer-controlled solenoid valves Clippard, Cincinnati, USA ET-2-H-M5
Pressure transducer Druck LTD PTX 1400
biotin-14-dCTP  Life Technologies 19518-018
Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) Thermoscientific EP0161
ATTO532 maleimide Sigma Aldrich 68499
N,N-dimethylformamide (DMF)  Sigma Aldrich 227056 Combustible Liquid, Harmful by skin absorption. Irritant, Teratogen. H226; H303; H312; H316; H319; H331; H360; P201; P261; P280;P305; P351; P338; P311
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)  Sigma Aldrich C4706
L-Glutathione reduced (GSH) Sigma Aldrich G4251 Acute toxicity, Oral (Category 5), H303
Amicon Ultra-15, PLQK Ultracel-PL Membrane, 10 kDa cutoff spin concentrators Merck Millipore UFC901024
Streptavidin-coated polystyrene beads 1.87 µm Spherotech, Inc. SVP-15-5

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References

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