Очистка муковисцидоза трансмембранного регулятора проводимости белка выражается в

Biology
JoVE Journal
Biology
AccessviaTrial
 

Summary

Гетерологичная экспрессия и очистка муковисцидозный трансмембранного регулятора проводимости (CFTR) значительные проблемы и ограничивающие факторы в развитии лекарственной терапии для муковисцидоза. Этот протокол описывает два способа выделения миллиграмм количества CFTR, пригодных для функциональных и структурных исследований.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Pollock, N., Cant, N., Rimington, T., Ford, R. C. Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (87), e51447, doi:10.3791/51447 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Дефекты в муковисцидоза трансмембранного регулятора проводимости (CFTR) белок вызывает кистозный фиброз (CF), аутосомно-рецессивные заболевания, что в настоящее время ограничивает среднюю продолжительность жизни больных до <40 лет. Разработка новых лекарственных молекул восстановить активность CFTR является важной целью в CF лечения, а также изоляция функционально активной CFTR является полезным шагом на пути к достижению этой цели.

Опишем два способа очистки CFTR от эукариотической гетерологического системы экспрессии, S. CEREVISIAE. Как прокариотических системах, С. CEREVISIAE можно быстро растет в лаборатории при низких затратах, но может также трафик и посттрансляционно изменить большие мембранные белки. Выбор моющих средств для растворения и очистки является важным шагом в очистке любого мембранного белка. После скринингу на растворимости CFTR в нескольких моющих средств, мы выбрали двух соntrasting моющие средства для использования в очистке, которые позволяют заключительная подготовка CFTR, чтобы быть адаптированы к впоследствии запланированных экспериментов.

В этом методе, мы предлагаем сравнение очистки CFTR в додецил-β-D-мальтозид (DDM) и 1-тетрадеканоил-Sn-глицеро-3-фосфо-(1'-рац-глицерин) (LPG-14). Белок очищали в DDM этим методом показывает АТФазы в функциональных анализах. Белок очищают LPG-14 показывает высокую чистоту и выход, может быть использован для изучения посттрансляционных модификаций, и может быть использован для структурных методов, таких как малоуглового рассеяния рентгеновских лучей и электронной микроскопии. Однако он отображает значительно ниже АТФазы.

Introduction

Муковисцидоз (МВ) является наиболее распространенным генетическим заболеванием, в Европе и Северной Америке с частотой около 1 в 2500 живорожденных. CF происходит, когда мутации в муковисцидоза трансмембранного регулятора проводимости (CFTR) привести к потере белка своей функции на плазматической мембране эпителиальных клеток 1. Наиболее серьезным последствием этого дефекта является необратимое повреждение легких, что сокращает продолжительность жизни больных до <40 лет 2,3.

CFTR является АТФ-связывающего кассетного (ABC) транспортер, что превратилась ионный канал 1,4. Несмотря на довольно измененной функции в плазматической мембране клеток, он все еще сохраняет значительную гомологию последовательностей с другими транспортеров АВС. Интересно, что специализированные части CFTR (т.е. его регуляторной области и его N-и С-концы) не поделиться значительного сходства последовательности с другой многоклеточных ABC транспортеров, следовательно, нет никаких улик, как в гое истоки этих последовательностей в CFTR. На основе его первичной структуры, CFTR классифицируется в качестве члена C-семьи транспортера семьи ABC, но нет никаких убедительных доказательств для остаточной функциональной привязки к этой суб-семьи. Там было несколько сообщений о глутатион транспортной деятельности для CFTR 5-7, который будет соответствовать роли других членов С-семейных 8,9, хотя другие источники предполагают, что восстановленный глутатион может ингибировать активность CFTR АТФазную, а не показывая субстрат-индуцированного стимуляции, которые характеризуют перевозчиков ABC 10. Измерение ионной проводимости является достаточно чувствительным, чтобы позволить канал активность одиночных молекул CFTR быть изучены 1 и свойства канала CFTR были регистрируют как функцию времени, температуры, концентрации АТФ, мембранного потенциала и состояния фосфорилирования, а также в Наличие множества низкомолекулярные ингибиторы, усилителей и модификаторами. Этиисследования также добавил значительно к нашему знанию о том, как функционируют ABC транспортеры. Тем не менее, выражение CFTR в значительных количествах и его последующей очистки оказалась особенно сложной и успех был ограничен несколькими лабораториями 10-13.

Необходимость разработки более эффективных препаратов давит, но этот процесс был сдерживается отсутствием очищенного CFTR для скрининга малых молекул. Решение проблемы экспрессии CFTR и очистки позволит высокопроизводительного скрининга наркотиков, направленных на исправление основной дефект в CF, а также будет открыть маршрут для структурных исследований с высоким разрешением, чтобы сообщить рациональную конструкцию наркотиков. Более того, даже относительно основные биохимические характеристики белка, например, его функциональной олигомерного состояния, взаимодействующих белков и АТФазы остаются плохо охарактеризованы. Ранее мы уже сообщали протокол для крупномасштабной экспрессии GFP и его-меченых мышиных CFTRв S. CEREVISIAE 14 и теперь дополнительно описывают протоколы для очистки CFTR. Мы использовали эти методы, чтобы очистить пять ортологи CFTR и представления данных для очистки куриного CFTR в качестве примера. Выбор моющих средств для растворения и очистки является важным шагом в очистке любого мембранного белка. После скринингу на растворимости CFTR в нескольких моющих средств, мы выбрали два противоположных моющие средства для использования в очистке. Додецил-β-D-мальтозид (DDM) представляет собой неионный детергент, который широко используется как для структурных и функциональных исследований мембранных белков 15-21. Ионный детергент 1-тетрадеканоил-Sn-глицеро-3-фосфо-(1'-рац-глицерин) (LPG-14) является высокоэффективным в солюбилизации CFTR и ранее был использован в очищении функциональных мембранных белков 10, 22,23, в том числе очистки CFTR от S. CEREVISIAE 24. </ Р>

Protocol

1. Подготовка буферов

  1. Для того, чтобы 100x запас ингибитора протеазы (ИП) коктейль растворить 96 мг AEBSF, 3,5 мг химостатина, 10 мг E64, 16,5 мг лейпептина 16,5 мг пепстатин, 348 мг PMSF, и 4 мг бестатин в 20 мл ДМСО. Сделать 1 мл аликвоты и хранят при температуре -20 ° С. Чтобы сделать 100x запас бензамидина, растворить 720 мг в 20 мл воды высокой степени очистки (DDH 2 O) и магазин в 1 мл аликвоты при -20 ° С. Это количество является достаточным для одной очистки. Во всех буферов, PI и бензамидина запасы используются в разведении 1:100.
  2. Подготовка "mPIB '(0,3 М Трис, рН 8, 0,3 М сахарозы, 2 мМ DTT) и' CFTR '(50 мМ Трис рН 8, 20% (об / об) глицерина, 1 мМ DTT) буферы и холод до 4 ° С . Перед использованием добавьте 1:100 от коктейлем ингибиторов протеаз и 1:100 бензамидина в соответствии с объемом mPIB используется для ресуспендируют осадок клеток (например, использование 3,5 мл PI и 3,5 мл бензамидин в общем объеме 350 мл mPIB).
  3. Подготовка секolubilization буферы. Лизолецитин фосфатидилглицерин-14 (LPG) солюбилизацию буфер (50 мМ Трис рН 8, 10% (об / об) глицерина, 50 мМ NaCl, 1 мМ ДТТ, ингибиторы протеазы (ИП) и 4% (вес / объем) LPG) и додецилмальтозид (DDM) солюбилизацию буфер (50 мМ Трис рН 8, 20% (об / об) глицерина, 1 М NaCl, 1 мМ ДТТ, ингибиторы протеазы, 4% (вес / объем) DDM). Буфер можно ультразвуком в ультразвуковом бане (35 Вт, 40 кГц), чтобы помочь с разгона моющего средства, но избежать встряхивания смеси, так как это создает пузыри. Холод до 4 ° С перед использованием.
  4. CFTR очистка буфера для очистки сжиженного газа составляет 50 мМ Трис, 10% (об / об) глицерина, 50 мМ NaCl, 1 мМ ДТТ, 0,1% (вес / объем) LPG-14 и ингибиторы протеазы. Подготовка 350 мл этого буфера и 150 мл того же буфера плюс 1 М имидазолом. Отрегулируйте рН обоих буферов до 8.
  5. Буфер для очистки в DDM состоит из 50 мМ Трис, рН 8, 20% (об / об) глицерина, 1 М NaCl, 1 мМ ДТТ, 0,1% (вес / объем) DDM. Подготовка 350 мл этого буфера и 150 мл того же буфера плюс 1 М имидазоле. Отрегулируйте рН обоих буферов до 8.
  6. Для гель-проникающей хроматографии (ГПХ) буфера, содержащего сжиженный нефтяной газ, готовить 50 мМ Трис рН 8, 10% (об / об) глицерина, 50 мМ NaCl, 1 мМ DTT, 0,05% (вес / объем) LPG-14. Для GPC с использованием DDM подготовить буфер 50 мМ Трис, рН 8, 20% (об / об) глицерина, 1 М NaCl, 1 мМ DTT, 0,1% (вес / объем) DDM. Все буферы и DDH 2 O, используемые на колонке ГПХ должны быть отфильтрованы (0,2 мкм фильтр) и дегазировали перед использованием.
  7. Образец SDS-PAGE буфера (2x рабочую концентрацию): 50 мМ Трис-HCl рН 7,6, 5% (об / об) глицерина, 5 мМ ЭДТА, 0,02% (вес / объем) бромфенолового синего. Сделать 700 мкл аликвоты и хранят при температуре -20 ° С. Перед использованием добавьте 200 мкл 20% (вес / объем) додецилсульфата натрия (SDS) и 100 мкл свежей 0,5 М DTT. Выдержите в течение не менее 10 мин с образца при комнатной температуре перед загрузкой на геле. Не нагревайте; это будет денатурации GFP и может привести к агрегации CFTR.
  8. Чтобы сделать запасы липидов для восстановления, растворить 4:1 (вес / вес) смеси Е. палочка липидыD (2:1 об / об) холестерина в хлороформе и метаноле и сушат в стеклянную пробирку в атмосфере N2 газа в течение 2 часов с образованием липидной пленки. Добавить GPC буфер (без NaCl) до концентрации липидов 40 мг / мл и использовать повторное вихревание и ультразвуком (35 Вт, 40 кГц), чтобы разъяснить решение.
  9. Для анализа АТФазы, готовят 100x запасов ингибиторов АТФазы путем растворения SCH28080 до 1 мМ в ДМСО, NaSCN до 1 М в DDH 2 O и олигомицин до 2,5 мМ в 100% (объем / объем) этанола. Хранить в аликвоты при -20 ° С. Сделать 100 мл АТФазы буфера 50 мМ Трис, рН 7,4, 150 мМ NH 4 Cl, 5 мМ MgSO 4 и 0,02% (вес / объем) NaN 3. Это можно хранить при комнатной температуре и использовать в течение нескольких анализов. Подготовить запас 5 мМ АТФ непосредственно перед использованием и держать на льду. (NB Использование Na 2 АТФ, чтобы предотвратить чрезмерное фонового сигнала от фосфата в анализе). Подготовка стоп-раствора SDS (12% (вес / объем) SDS в DDH 2 O).
  10. Для обнаружения Chifflet подготовить буфером А (3% (мас/ Объем) аскорбат, 0,5% (вес / объем) молибдат аммония, 0,5 М HCl) непосредственно перед использованием и буфер Б (2% (вес / объем) цитрат натрия, 2% (вес / объем) натрий мета-Арсенит, 2% (объем / объем) уксусной кислоты).

2. Выделение дрожжей микросомах

  1. S.cerevisiae, выражая куриный CFTR выращивают, как описано в O'Ryan и соавт. (2012) 14. Храните материал из 20 L брожения в две аликвоты при -80 ° С в течение до 6 месяцев.
  2. Размораживание одну аликвоту клеток быстро и ресуспендируют в 3 мл охлажденной mPIB на грамм клеток.
  3. Разрушить клетки в шаровой мельнице с использованием стеклянных шариков диаметром 425-600 мкм. Используйте пять 1 мин периоды разрушения клеток, разделенных 1 мин периодами отдыха. (В периоды отдыха имеют важное значение для обеспечения того, чтобы клетки не подогреваются в срывов.)
  4. Монитор разрушение клеток центрифугированием в 1 мл образца клеточного лизата от шаровой мельнице. Центрифуга (12000 мкг, 4 ° С, 5 мин) в Настольные CENTRifuge. Развести супернатант до 1:50 с mPIB в кювете и измерить A 380. Если 380> 0,1, или уже перестали расти, несмотря на несколько повторяющихся циклов шарик избиение, перейдите к следующему шагу. Если нет, повторите 2,3-2,4.
  5. Центрифуга общее лизата клеток (12000 х г, 4 ° C, 20 мин). Сохранить супернатант. Откажитесь от осадка (содержащего неразрушенные клетки и митохондрии), но если есть какие-либо сомнения в эффективности клеточной поломки (см. 2.4), то сохранить осадок также.
  6. Центрифуга супернатант от предыдущей стадии (200 000 мкг, 4 ° C, 1,5 ч.). Удалите супернатант и ресуспендирования осаждали микросомальные мембраны в CFTR буфера. Если микросомы предназначены для очистки с использованием DDM, дополнить буфера CFTR с помощью 1 М NaCl.
  7. Повторите центрифугирования ресуспендировали в мембранной фракции (100000 х г, 4 ° С, 1 ч) и отбросить супернатант.
  8. Ресуспендируют осаждали микросом вМинимальный объем CFTR буфера (конечный объем 5-15 мл, общий микросомального белка 70-200 мг). Bradford анализ может быть использован для определения общей концентрации микросомальных белков 25. Кроме того, спектр флуоресценции мембран должны быть измерены (возбуждение = 485 нм, излучение = 500-600 нм) и должны иметь различные GFP пика флуоресценции (максимум при 512 нм). CFTR могут быть конкретно обнаруживается в геле SDS-PAGE, отсканированные под GFP условиях флуоресценции (рис. 1).
  9. Флеш-заморозить ресуспендированные микросом, погружаясь в жидком азоте и хранить при температуре -80 ° С, или перейдите к шагу 3.

3. Солюбилизация микросомах

  1. Если заморожены, размораживание микросом непосредственно перед применением в вод ной бане до 10 ° С
  2. Для солюбилизации мембран, разбавленный микросомах с равным объемом соответствующего буфера солюбилизации (этап 1.3), чтобы получить конечную концентрацию моющего средства2% (вес / объем) и микросомального белка концентрации 5 мг / мл. Инкубировать эту смесь в течение 1 часа при 4 ° С при перемешивании (трубка ротатора). Сохраните 200 мкл для анализа.
  3. Центрифуга смеси (100000 х г, 4 ° С, 45 мин). Удалить супернатант, содержащий растворенные мембранные белки, пропустить через шприцевой фильтр 0,45 мкм и хранить на льду. Измерить флуоресценцию супернатанта (как на шаге 2,8).
  4. Ресуспендируют нерастворимой фракции в 1% (вес / объем) SDS раствора в объеме, равном растворимой фракции. Измеряют флуоресценцию в этой фракции и удерживать аликвоту 50 мкл для анализа SDS-PAGE.

4. Никель-аффинной очистки CFTR

  1. Ссылка два 5 мл никель сефарозными колонки в серии. Промыть 2 объемами колонки (CV) 20% (объем / объем) этанола, с последующим 2 CV DDH 2 O, затем колонку промывают 2 CV буфера солюбилизации (шаг 1,4-1,5), содержащего 1 М имидазола. Повторите с 2 CV из solubilizatионный буфер хватает имидазола.
  2. Добавить имидазол до конечной концентрации 5 мМ до солюбилизированного вещества (этап 2.8) и вручную загрузить материал на колонку или в петлю образца при использовании автоматизированной хроматографической устройство жидкости.
  3. Загрузить солюбилизированного материала на колонку при скорости потока 0,5 мл / мин и промывают 2 CV имидазольного-хватает буфере при той же скорости потока для удаления несвязанного материала. Сбор фракций в 50 мл пробирки Фалкон.
  4. Для первой стирки, использовать 3 CV буфера очистки с 40 мМ имидазола при скорости потока 1 мл / мин. Сбор 2 мл фракции.
  5. Для второй стирки, использовать 3 CV буфера очистки с 100 мМ имидазола. Сбор 2 мл фракции.
  6. Элюировать CFTR из колонки HisTrap с 3 CV буфера очистки с 400 мМ имидазола. Сбор 2 мл фракции.
  7. Монитор флуоресценцию в элюированных фракций (Шаг 2.8).
  8. Сохранение аликвоты пиковых фракций для анализа SDS-PAGE. Ледяная вспышка оставаясь пик еОбразцы raction и хранить при температуре -80 ° С, или перейдите к следующему стадии очистки.

5. Гель-проникающей хроматографии (ГПХ) Очистка CFTR

  1. Равновесие столбец (суперозой 6 10/300 GL) с 1,2 CV DDH 2 O, затем на 1,2 CV ГПХ буфера.
  2. В шаге 5.1, сконцентрировать Ni-аффинно-очищенные фракции с самой высокой флуоресценции GFP с помощью 100000 MWCO центробежный фильтр при 4 ° С. Если в DDM очистки, во избежание концентрации образца выше концентрации белка 0,3 мг белка / мл так как это вызовет значительную потерю образца. Извлеките ретентата от концентратора и центрифуге при 100000 х г в течение 30 мин при 4 ° С для осаждения крупных частиц.
  3. Введите этот образец в колонку и элюируют градиентом изократическом 1,2 CV буфера ГПХ. Сбор 0,5 мл фракции.
  4. Измерьте флуоресценции GFP как в разделе 2.8, чтобы определить те фракции, содержащие CFTR. Сохраните небольшой объем (например, </ EM> 50 мкл) из каждой для анализа с помощью SDS-PAGE.
  5. Замораживание фракции в жидком азоте и хранят при температуре -80 ° С.

6. Реконституция CFTR

  1. Добавить липиды (шаг 1.8) к очищенной CFTR на липидный-к-белка соотношении 100:1 (W / W) и инкубировать при температуре 4 ° С в течение 1 часа. Аналогичным образом настроить контроль липидов только, заменяя очищенный белок с таким же объемом буфера ГПХ.
  2. Удалить моющее средство из белка / липидной смеси с использованием адсорбента бусы. Промыть адсорбента шарики в 5 CV DDH 2 O, 5 CV 70% (объем / объем) этанола, 5 CV DDH 2 O, и 5 CV ГПХ буфере без моющего средства. Добавить 200 мг промытого адсорбента шариков на мл очищенного белка и инкубируют при 4 ° С в течение ночи при осторожном перемешивании.
  3. Соберите реконституции образец из адсорбента бисера в чистую пробирку, используя тонкую состава пипетки.

7. Измерение АТФазы

  1. Определите скорость ФТR конкретных АТФазы с использованием модифицированного анализа Chifflet 26,27 в формате 96-луночного планшета. С натрий-фосфатного раствора (0,65 мМ) готовить 0-20 нмоль фосфата в конечном объеме 50 мкл в качестве стандартов. Использование смесь 1:1 буфера CFTR и АТФазы буфера для разбавления фосфата запас.
  2. Выдержите как восстановленного CFTR и пустые липосомы с 1:100 (V / V) ингибиторов АТФазы (шаг 1.9) на льду в течение 10 мин. Используйте как минимум 5 мкг восстановленного CFTR.
  3. Добавить АТФ (этап 1,9) до конечной концентрации 2 мМ и инкубируют при 25 ° С в течение 1 часа. Остановить реакцию добавлением 40 мкл 10% (вес / объем) SDS (шаг 1,9) в каждую лунку (в том числе стандартам).
  4. Добавить 100 мкл буфера А (Шаг 1,10) и инкубировать в течение 10 мин. Добавить 100 мкл буфера В (1.10) в каждую лунку и измеряют поглощение при длине волны 800 нм в 96-луночный планшет-совместимый UV / VIS спектрофотометр.
  5. Преобразование оптической плотности при 800 нм в количестве освобожденной фосфата с помощьюстандарты фосфатные. Рассчитайте скорость гидролиза АТФ после вычитания фонового сигнала (липосом только скважин).
  6. Для не-восстановленного CFTR следовать той же протокол помощью CFTR буфера для чтения фона.

Representative Results

Протокол, описанный выше, является эффективным средством изолировать CFTR обогащенный микросом, с почти полного восстановления CFTR во время клеточного повреждения и подготовки сырой микросомах (рис. 1). Другие методы клеток поломки также могут быть использованы эффективно. Мы использовали французскую ячейку давления, и другие high-pressure/cavitation устройств (также в сочетании с влияя против цели рубинового) с одинаковой эффективностью. Для удобства и низкой начальной стоимости оборудования, мы находим методом шарик избиение лучших.

Использование сжиженного газа для растворения и очистки CFTR дали 80 мкг белка / л культуры на> 90% чистоты (рис. 2). Высокий выход было связано с эффективной солюбилизации CFTR на LPG (ср. фиг.2В, дорожки 2 и 4). Кроме того, эффективным и сильной связи в колонну привело к минимальной потерей CFTR в несвязанной фракции и отсутствие CFTR в промывной фракции (рис. 2, дорожки 3, 5, и6). Элюированный белок имел чистоту> 90%, по оценкам Кумасси окрашенных ПААГ с ДСН и с помощью денситометрии в CFTR и загрязняющих групп. Гель-проникающей хроматографии (ГПХ), разделенных СНГ очищенный CFTR от загрязнений низкомолекулярных (рис. 4, нижняя панель).

Протокол для очистки CFTR с помощью DDM дает чистоту примерно 60% и выходом около 50 мкг / л (рис. 3). Электронной микроскопии (ЭМ) из отрицательно окрашенных фракций из ГПХ, элюирующихся при примерно 10 мл (рис. 4) показали, что очищенный DDM-CFTR содержит агрегаты диаметром 20-30 нм, а также более мелкие частицы диаметром 10 нм (данные не показаны). Вполне возможно, что небольшие агрегаты могут обратимо связывать и отделить как ультрафильтрации с 1 МДа отсечения фильтра не удалось удалить ЭМ-обнаруживаемые агрегатов. LPG-очищенный материал не адсорбировать на тлеющем разряжен сетки, следовательно, был изучен крио-ЭМ неокрашенных фракций. Это показало,очень однородной популяции частиц из относительно малого размера (6-8 нм в диаметре, данные не показаны).

Наконец, АТФазы из очищенных белков измеряли (рис. 5). Как член семейства белков ABC, CFTR имеет два нуклеотидных-связывающие домены (NBDs) способны связывать и / или гидролиза АТФ. Данные показывают, что очищенный белок был не в состоянии для гидролиза АТФ в LPG-солюбилизированного состоянии и показали слабую АТФ-азной активностью в присутствии DDM (рис. 5, незаполненные столбики). После добавления липидов и удаления детергента, АТФазы была в 4 раза выше для образцов, очищенный в DDM (13 нмоль ATP / мин / мг белка). Добавление липидов и удаления LPG аналогично восстановленной активности в CFTR, которые были изолированы с помощью LPG, но с меньшей скоростью окончательного (1,5 нмоль ATP / мин / мг белка), чем DDM-очищенного и восстановленного материала.

Рисунок 1 Рисунок 1. Уровни мониторинга куриного CFTR в лизата клеток (CL), супернатанты (S) и гранулы (P) во время различных стадиях центрифугирования, используемых для изоляции микросомной и промывки. ПААГ с ДСН были визуализированы с помощью в-гель флуоресценции GFP тег. Супернатант после клеточной поломки и центрифугирования при 14000 х г содержит практически все CFTR (в том числе продуктов распада). Ультрацентрифугирование 200000 XG отложений все полнометражный CFTR, оставляя некоторые фрагменты в супернатанте. Ультрацентрифугирование при 100000 х г соленых промывают микросомах гранул почти все CFTR с удалением некоторых дополнительных фрагментов.

Рисунок 2
Рисунок 2. Очистка куриного CFTR в СНГ по иммобилизованным ионом металла аффинной хроматографии. Фракции анализировали электрофорезом в ДСН-ПААГ с последующим окрашиванием кумасси (верхняя панель) и обнаружения флуоресценции GFP тега (нижняя панель). Количество треков: (1) микросом. (2) LPG-солюбилизированы Микросомы. (3) Несвязанный материал. (4) Нерастворимый материал. (5) и (6) 40 и 100 мМ имидазола моет. (7) Материал элюировали 400 мМ имидазола.

Рисунок 3
Рисунок 3. Очистка куриного CFTR в DDM по иммобилизованным ионом металла аффинной хроматографии. Фракции анализировали с помощью SDS-PAGE с последующим окрашиванием Кумасси. Левой панели показывает фракций до элюирования. Несколько последовательных фракции элюции приведены в правой панели с CFTR вdicated стрелкой. Более поздние фракции обогащены в 40 кДа примеси, который был определен методом масс-спектрометрии, как рибосомного белка L3.

Рисунок 4
Рисунок 4. Очистка куриного CFTR с помощью гель-проникающей хроматографии. CFTR очищают Ni-афинной хроматографии концентрировали и наносили на колонку ГПХ. Профиль элюции для CFTR (верхняя панель), очищенный буфере, содержащем LPG-14 (сплошная линия) или DDM (пунктирная линия) накладываются. SDS-PAGE (нижняя панель) показал, что CFTR элюируют между 8 и 11 мл.

Рисунок 5
Рисунок 5. АТФазы Activitу очищенных курица CFTR фракций. Белок очищенный DDM или СНГ анализировали с помощью модифицированного Chifflet анализа 26 в присутствии коктейля ингибиторов АТФазы, чтобы устранить любые фона АТФазы от F-, P-и АТФаз V-типа (незаполненные баров ). Скорость гидролиза АТФ была также измерена после удаления детергента и липида того (закрашенные столбцы). Сюжет показывает среднее и стандартное отклонение (п = 3). Различия между средними значениями для АТФазы в присутствии и в отсутствие липида и разницы между активностью в DDM и сжиженного нефтяного газа являются существенными для р <0,05.

Discussion

Ранее мы описали метод сверхэкспрессией мышиного CFTR 14. С момента публикации этого протокола, мы выразили и очищенный несколько различных Ортологи CFTR используя ту же систему. Все испытанные ортологи так далеко очищают хорошо в LPG моющего средства, в то время как очистка DDM показали больший разброс между различными ортологи (данные не показаны). Эта гибкость иллюстрирует прочность подход дрожжей: можно экранировать много конструкций с относительной скоростью, чтобы выбрать один для определенной цели.

Стиральная дрожжевых микросом с буфером, содержащим 1 М NaCl до солюбилизации с результатами DDM в более чистой подготовки микросомной и снижает загрязняющих веществ на более поздних стадиях. Этот шаг не является необходимым в протоколе СНГ как окончательная проба CFTR является> 90% чистоты без микросомной стирки. Кроме того, очистка в DDM требует нескольких изменений в буферов для солюбилизации аочистка й, а именно добавление дополнительной глицерин и соли. Вместе эти добавки значительно увеличилось связывание DDM-солюбилизированного белка в колонку.

Методика очистки DDM имеет возможности для совершенствования, в частности удаление 40 кДа основной примеси, которые, если судить по масс-спектрометрии, связано с дрожжи рибосомной субъединицы L3, который появляется иметь характеристическую сродство к смоле никеля. Там нет очевидного polyHis последовательность в белке L3, но экспертиза его 3D структуры при связывании с рибосомой (PDB = 1FFK) показывает, что сложил L3 субъединицы имеет потенциальную polyHis кластер. То, что это группа менее проблематично в СНГ очищенный материал может быть связано с более жесткой СНГ моющего средства.

Хотя очистка в DDM-видимому, беднее, чем в СНГ, более мягкие детергенты, такие как DDM может быть более совместимым с функциональной и структурной анализов и уже используется в нескольких рентгеновских Кристаллographic исследования мембранных белков 15-21. Кроме того, наши результаты показывают, что использование сжиженного газа приводит к потере функции АТФазы в CFTR относительно очистки в DDM. Поэтому мы рекомендуем протокол очистки LPG основе для генерации CFTR, где чистота имеет решающее значение, например, в таких приложениях, как характеристике пост-трансляционных модификаций, или в генерации антител, протокол СНГ на основе будет выбран . С другой стороны в случаях, когда деятельность и полностью родное государство белка имеет важное значение, мы бы предложить протокол DDM основе в качестве лучшего варианта.

В заключение, этот протокол описывает воспроизводимый метод для изоляции CFTR в цвиттерионного моющего средства LPG-14 или неионные моющего DDM. Как таковой, он указывает на более широкий спектр очистных условий для CFTR чем уже сообщалось ранее 10-13. В дополнение миллиграмм количеств очищенного CFTR может бытьполученные с использованием этих процедур в сочетании с высокой объемной системы рост дрожжей, таких как 20-литровом ферментере и системой сбора клеток с высокой пропускной способностью, такой как 6 л низкой скорости ротора центрифуги с. CFTR получены имеет отщепляемую GFP тег, который позволяет легко контролировать белка в различных биохимических и биофизических анализов.

Реагента, описанного в этой рукописи (CFTR курица, содержащие плазмиды или замороженные дрожжевые клетки) могут быть получены путем кистозного фиброза Foundation (США).

Disclosures

Авторы не имеют конкурирующие финансовые интересы, ни других противоречивых интересов в отношении этой работы.

Acknowledgments

Эта работа финансировалась американским Муковисцидоз Фонда (CFF) через свою CFTR 3D Consortium структуры. TR финансировалось за счет Великобритании CF Целевой студенчества и NC на студенчества Великобритании BBSRC. Мы признаем, наших коллег в структуре консорциума CFF CFTR 3D для их помощью и советом, и для конструкции курица последовательности CFTR и очистки тегов кодон-оптимизированный.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 μm syringe filter  Sartorius FC121
100 kDa MWCO centrifugal concentrator (PES membrane) Vivaspin VS0641
2 ml microfuge tubes Sarstedt 72.695
40Ti rotor Beckman Coulter 337901
50 ml sterile Falcon tubes Sarstedt 62.547.254
Adenosine triphosphate disodium salt (Na2ATP) Sigma-Aldrich A26209
Liquid chromatography system GE Healthcare 28-4062-64
Aminoethylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF) Sigma-Aldrich A8456
Glass bead-beating cell disrupter BioSpec 1107900
Benchtop centrifuge  HERMLE Z300
Benchtop centrifuge  Eppendorf 5417R
Benchtop microfuge  Fisher 13-100-511
Benzamidine hydrochloride Sigma-Aldrich 434760
Hydrophobic Beads SM-2 Adsorbent BioRad 152-3920
Bromophenol blue Sigma-Aldrich 114391
Centrifuge tubes Beckman Coulter 357000
Gel imaging system BioRad 170-808
Cholesterol Sigma-Aldrich C8667
Chymostatin  Sigma-Aldrich C7268
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 43815
E. coli total lipid extract Avanti lipids 100500
Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) Sigma-Aldrich E3132
Glass beads, acid washed Sigma G8772
Glycerol Fisher 65017
HisTrap HP columns (5 ml) GE Healthcare 17-5247-05
Rapid Coomassie Stain Novexin ISB1L
Centrifuge JA-17 rotor Beckman Coulter 369691
Leupeptin Merck 108975
Lyso-phosphatidyl glycerol-14 (LPG) Avanti lipids 858120
MgSO4 Sigma-Aldrich M7506
Gel tank SDS-PAGE system BioRad 165-8006
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside (DDM) Affymetrix D310S
NaCl Sigma-Aldrich S6191
NaN3 Sigma-Aldrich S2002
NH4Cl Sigma-Aldrich A9434
Oligomycin Sigma-Aldrich 75351
Ultracentrifuge Beckman Coulter 392050
Prestained protein standards Fermentas SM1811
Desalting columns (Sephadex G-25) GE Healthcare 17-0851-01
Pepstatin A Sigma-Aldrich P4265
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) Sigma-Aldrich P7626
SCH28080 Sigma-Aldrich S4443
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich L37771
Sodium thiocyanate (NaSCN) Sigma-Aldrich 251410
Gel filtration 10/300 GL column GE Healthcare 17-5172-01
Tris-base Formedium TRIS01
Ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 355618
Vortex mixer Star Labs N2400-0001
Ultrasonic water bath Ultrawave F0002202
Multimode plate reader BioTek BTH1MF

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aleksandrov, A. A., Aleksandrov, L. A., Riordan, J. R. CFTR (ABCC7) is a hydrolyzable-ligand-gated channel. Pflugers Arch. 453, 693-702 (2007).
  2. Dodge, J. A., Lewis, P. A., Stanton, M., Wilsher, J. Cystic fibrosis mortality and survival in the UK: 1947-2003. EUR RESPIR J. 29, 522-526 (2007).
  3. O'Sullivan, B. P., Freedman, S. D. Cystic fibrosis. Lancet. 373, 1891-1904 (2009).
  4. Rommens, J. M., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science. 245, 1059-1065 (1989).
  5. Kariya, C., et al. A role for CFTR in the elevation of glutathione levels in the lung by oral glutathione administration. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 292, (2007).
  6. Gould, N. S., Min, E., Martin, R. J., Day, B. J. CFTR is the primary known apical glutathione transporter involved in cigarette smoke-induced adaptive responses in the lung. Free Radic Biol Med. 52, 1201-1206 (2012).
  7. Childers, M., Eckel, G., Himmel, A., Caldwell, J. A new model of cystic fibrosis pathology: lack of transport of glutathione and its thiocyanate conjugates. Med Hypotheses. 68, 101-112 (2007).
  8. Cole, S. P., et al. Overexpression of a transporter gene in a multidrug-resistant human lung cancer cell line. Science. 258, 1650-1654 (1992).
  9. Conseil, G., Deeley, R. G., Cole, S. P. Polymorphisms of MRP1 (ABCC1) and related ATP-dependent drug transporters. Pharmacogenet Genomics. 15, 523-533 (2005).
  10. Ketchum, C. J., Rajendrakumar, G. V., Maloney, P. C. Characterization of the adenosinetriphosphatase and transport activities of purified cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Biochemistry. 43, 1045-1053 (2004).
  11. Ramjeesingh, M., et al. A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Biochem J. 327 (Pt 1), 17-21 (1997).
  12. Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Anal Biochem. 259, 89-97 (1998).
  13. Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). J Biol Chem. 279, 39051-39057 (2004).
  14. O'Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae. J Vis Exp. (2012).
  15. Oldham, M. L., Chen, J. Snapshots of the maltose transporter during ATP hydrolysis. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 15152-15156 (2011).
  16. Pinkett, H. W., Lee, A. T., Lum, P., Locher, K. P., Rees, D. C. An inward-facing conformation of a putative metal-chelate-type ABC transporter. Science. 315, 373-377 (2007).
  17. Dawson, R. J. P., Locher, K. P. Structure of a bacterial multidrug ABC transporter. Nature. 443, 180-185 (2006).
  18. Gerber, S., Comellas-Bigler, M., Goetz, B. A., Locher, K. P. Structural basis of trans-inhibition in a molybdate/tungstate ABC transporter. Science. 321, 246-250 (2008).
  19. Ward, A., Reyes, C. L., Yu, J., Roth, C. B., Chang, G. Flexibility in the ABC transporter MsbA: Alternating access with a twist. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 19005-19010 (2007).
  20. Kadaba, N. S., Kaiser, J. T., Johnson, E., Lee, A., Rees, D. C. The high-affinity E. coli methionine ABC transporter: structure and allosteric regulation. Science. 321, 250-253 (2008).
  21. Aller, S. G., et al. Structure of P-Glycoprotein Reveals a Molecular Basis for Poly-Specific Drug Binding. Science. 323, 1718-1722 (2009).
  22. Koehler, J., et al. Lysophospholipid micelles sustain the stability and catalytic activity of diacylglycerol kinase in the absence of lipids. Biochemistry. 49, 7089-7099 (2010).
  23. Tian, C., et al. Preparation, functional characterization, and NMR studies of human KCNE1, a voltage-gated potassium channel accessory subunit associated with deafness and long QT syndrome. Biochemistry. 46, 11459-11472 (2007).
  24. Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Anal Biochem. 259, 89-97 (1998).
  25. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  26. Chifflet, S., Torriglia, A., Chiesa, R., Tolosa, S. A method for the determination of inorganic phosphate in the presence of labile organic phosphate and high concentrations of protein: Application to lens ATPases. Analytical Biochemistry. 168, 1-4 (1988).
  27. Rothnie, A., et al. The importance of cholesterol in maintenance of P-glycoprotein activity and its membrane perturbing influence. Eur Biophys J. 30, 430-442 (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics