में अभिव्यक्त किए जाते हैं सिस्टिक फाइब्रोसिस transmembrane प्रवाहकत्त्व नियामक प्रोटीन का शुद्धीकरण

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Summary

Heterologous अभिव्यक्ति और सिस्टिक फाइब्रोसिस transmembrane प्रवाहकत्त्व नियामक (CFTR) की शुद्धि महत्वपूर्ण चुनौतियां हैं और सिस्टिक फाइब्रोसिस के लिए दवा के उपचारों के विकास में सीमित कारकों. इस प्रोटोकॉल कार्यात्मक और संरचनात्मक अध्ययन के लिए उपयुक्त CFTR की मिलीग्राम मात्रा के अलगाव के लिए दो विधियों का वर्णन.

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Pollock, N., Cant, N., Rimington, T., Ford, R. C. Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (87), e51447, doi:10.3791/51447 (2014).

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Abstract

सिस्टिक फाइब्रोसिस transmembrane प्रवाहकत्त्व नियामक (CFTR) में दोष प्रोटीन सिस्टिक फाइब्रोसिस (CF), वर्तमान में उम्र के <40 वर्षों से ग्रस्त मरीजों की औसत जीवन प्रत्याशा है कि सीमा एक autosomal पीछे हटने का रोग का कारण. CFTR की गतिविधि को बहाल करने के लिए उपन्यास दवा अणुओं का विकास उपचार CF में एक महत्वपूर्ण लक्ष्य है, और कार्यात्मक सक्रिय CFTR के अलगाव के इस लक्ष्य को प्राप्त करने की दिशा में एक उपयोगी कदम है.

हम एक यूकेरियोटिक heterologous अभिव्यक्ति प्रणाली, एस से CFTR की शुद्धि के लिए दो विधियों का वर्णन cerevisiae. प्रोकार्योटिक सिस्टम की तरह, एस cerevisiae तेजी से कम कीमत पर प्रयोगशाला में विकसित किया जा सकता है, लेकिन यह भी यातायात और posttranslationally बड़ी झिल्ली प्रोटीन संशोधित कर सकते हैं. solubilization और शोधन के लिए डिटर्जेंट का चयन किसी भी झिल्ली प्रोटीन की शुद्धि में एक महत्वपूर्ण कदम है. कई डिटर्जेंट में CFTR की घुलनशीलता के लिए जांच करने के बाद, हम दो सह चुना हैअंतिम CFTR तैयारी बाद में योजना बनाई प्रयोगों के आधार पर किया जा करने की अनुमति है कि शुद्धि के लिए उपयोग में डिटर्जेंट ntrasting.

इस विधि में, हम dodecyl-β-D-maltoside में CFTR की शुद्धि (DDM) और की तुलना प्रदान 1-tetradecanoyl-एस.एन. ग्लिसरो-3-phospho-(1'-आरएसी-ग्लिसरॉल) (एलपीजी-14). इस विधि द्वारा DDM में शुद्ध प्रोटीन कार्यात्मक assays में ATPase गतिविधि को दर्शाता है. रसोई गैस के 14 में शुद्ध प्रोटीन उच्च शुद्धता और उपज, बाद translational संशोधनों का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया जा सकता है पता चलता है, और इस तरह के छोटे कोण एक्स - रे बिखरने और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के रूप में संरचनात्मक तरीकों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि यह काफी कम ATPase गतिविधि प्रदर्शित करता है.

Introduction

सिस्टिक फाइब्रोसिस (CF) 2500 जीवित जन्मों में लगभग 1 की एक घटना के साथ यूरोप और उत्तरी अमेरिका में सबसे आम आनुवंशिक विकार है. सीएफ तब होता है जब सिस्टिक फाइब्रोसिस transmembrane प्रवाहकत्त्व नियामक (CFTR) उपकला कोशिकाओं 1 के प्लाज्मा झिल्ली में अपने कार्य के प्रोटीन कारण नुकसान में उत्परिवर्तन. इस दोष के सबसे गंभीर परिणाम उम्र 2,3 की <40 वर्षों से ग्रस्त मरीजों की जीवन प्रत्याशा shortens जो अपरिवर्तनीय फेफड़ों को नुकसान होता है.

CFTR एक आयन चैनल 1,4 बनने के लिए विकसित किया गया है कि एक एटीपी बाध्यकारी कैसेट (एबीसी) ट्रांसपोर्टर है. कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली में इसकी काफी बदल समारोह के बावजूद, यह अभी भी अन्य एबीसी ट्रांसपोर्टरों के साथ महत्वपूर्ण अनुक्रम अनुरूपता बरकरार रखती है. दिलचस्प, CFTR (यानी इसकी नियामक क्षेत्र और उसके एन और सी टर्मिनी) की विशेष भागों अन्य metazoan एबीसी ट्रांसपोर्टरों के साथ कोई महत्वपूर्ण अनुक्रम समानता, इसलिए वें के रूप में कोई सुराग हैंCFTR में इन दृश्यों की ई मूल. इसका प्राथमिक संरचना के आधार पर, CFTR एबीसी ट्रांसपोर्टर परिवार की एक सी परिवार के सदस्य के रूप में वर्गीकृत है, लेकिन इस उप परिवार के लिए एक अवशिष्ट कार्यात्मक संबंध के लिए कोई पुख्ता सबूत नहीं है. अन्य रिपोर्टों कम glutathione बल्कि दिखाने से, CFTR ATPase गतिविधि को बाधित कर सकता है, हालांकि, अन्य सी परिवार के सदस्यों 8,9 की भूमिकाओं के अनुरूप होगा, जो CFTR 5-7 के लिए glutathione परिवहन गतिविधि के कुछ रिपोर्टों गया है एबीसी ट्रांसपोर्टरों 10 विशेषताएँ कि सब्सट्रेट प्रेरित उत्तेजना. आयन प्रवाहकत्त्व के मापन एकल CFTR अणुओं का चैनल गतिविधि 1 अध्ययन किया जाना और CFTR चैनल गुण एक समय के समारोह, तापमान, एटीपी एकाग्रता, झिल्ली क्षमता, और phosphorylation राज्य है, साथ ही में निगरानी के रूप में किया गया है की अनुमति के लिए पर्याप्त रूप से संवेदनशील है छोटे अणु inhibitors, potentiators, और संशोधक के एक मेजबान की उपस्थिति. इनअध्ययनों से यह भी एबीसी ट्रांसपोर्टरों समारोह का हमारे ज्ञान करने के लिए काफी जोड़ लिया है. फिर भी, काफी मात्रा में और इसके बाद के शोधन में CFTR की अभिव्यक्ति विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण और सफलता कुछ प्रयोगशालाओं 10-13 तक सीमित कर दिया गया है साबित हो गया है.

अधिक प्रभावी दवाओं को विकसित करने की आवश्यकता पर दबाव डाल रहा है, अभी तक यह प्रक्रिया छोटे अणुओं स्क्रीनिंग के लिए शुद्ध CFTR की कमी से बाधा कर दिया गया है. CFTR अभिव्यक्ति और शुद्धि समस्या को सुलझाने CF में प्राथमिक दोष को सही करने के उद्देश्य से उच्च throughput दवा स्क्रीनिंग के लिए सक्षम होगा और भी तर्कसंगत दवा डिजाइन को सूचित करने के लिए उच्च संकल्प संरचनात्मक अध्ययन के लिए एक मार्ग खुलेंगे. इसके अलावा, इस तरह अपने कार्य oligomeric राज्य के रूप में प्रोटीन, बातचीत प्रोटीन और ATPase गतिविधि की भी अपेक्षाकृत बुनियादी जैव रासायनिक गुणों खराब होती रहते हैं. हम पहले से GFP और उनकी टैग murine CFTR की बड़े पैमाने पर अभिव्यक्ति के लिए एक प्रोटोकॉल को सूचित किया हैएस में cerevisiae 14 और अब आगे CFTR की शुद्धि के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन. हम एक उदाहरण के रूप में चिकन CFTR की शुद्धि के लिए पांच CFTR की orthologues, और वर्तमान डेटा को शुद्ध करने के लिए इन तरीकों का इस्तेमाल किया है. solubilization और शोधन के लिए डिटर्जेंट का चयन किसी भी झिल्ली प्रोटीन की शुद्धि में एक महत्वपूर्ण कदम है. कई डिटर्जेंट में CFTR की घुलनशीलता के लिए जांच करने के बाद, हम शोधन में इस्तेमाल के लिए दो परस्पर विरोधी डिटर्जेंट चुना है. Dodecyl-β-D-maltoside (DDM) बड़े पैमाने पर झिल्ली प्रोटीन 15-21 के दोनों संरचनात्मक और कार्यात्मक अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया है कि एक nonionic डिटर्जेंट है. ईओण डिटर्जेंट 1-tetradecanoyl-एस.एन. ग्लिसरो-3-phospho-(1'-आरएसी-ग्लिसरॉल) (एलपीजी-14), CFTR की solubilization में अत्यधिक कुशल है और पहले से कार्यात्मक झिल्ली प्रोटीन 10 की शुद्धि में इस्तेमाल किया गया है एस से CFTR की शुद्धि सहित 22,23, cerevisiae 24. </ P>

Protocol

बफ़र की 1. तैयारी

  1. Protease अवरोध की 100x स्टॉक बनाने के लिए (पीआई) कॉकटेल 96 मिलीग्राम AEBSF, 3.5 मिलीग्राम chymostatin, 10 मिलीग्राम E64, 16.5 मिलीग्राम leupeptin, 16.5 मिलीग्राम pepstatin, 348 मिलीग्राम PMSF, और 20 मिलीलीटर DMSO में bestatin 4 मिलीग्राम भंग. -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 एमएल aliquots और दुकान Benzamidine की एक 100x स्टॉक बनाने के लिए, 720 20 मिलीलीटर ultrapure पानी में मिलीग्राम (DDH 2 हे) और -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 एमएल aliquots में दुकान भंग यह मात्रा एक शुद्धि के लिए पर्याप्त है. सभी बफ़र्स में गड़बड़ी और benzamidine शेयरों एक 1:100 कमजोर पड़ने पर इस्तेमाल कर रहे हैं.
  2. 'MPIB' (0.3 एम Tris पीएच 8, 0.3 एम सुक्रोज, 2 मिमी डीटीटी) और 'CFTR' को तैयार (50 मिमी Tris पीएच 8, 20% (v / v) ग्लिसरॉल, 1 मिमी डीटीटी) 4 डिग्री सेल्सियस तक buffers और सर्द . उपयोग करने से पहले, protease अवरोध कॉकटेल के 1:100 जोड़ने और mPIB की मात्रा के अनुसार 1:100 benzamidine (, जैसे 350 मिलीलीटर mPIB की कुल मात्रा में 3.5 मिलीलीटर गड़बड़ी और 3.5 मिलीग्राम benzamidine उपयोग) सेल गोली resuspend करने के लिए इस्तेमाल किया.
  3. एस की तैयारीolubilization बफ़र्स. Lyso-phosphatidyl ग्लिसरॉल-14 (एलपीजी) solubilization बफर (50 मिमी Tris पीएच 8, 10% (v / v) ग्लिसरॉल, 50 मिमी NaCl, 1 मिमी डीटीटी, protease inhibitors (पीआईएस) और 4% (w / v) एलपीजी) और dodecyl maltoside (DDM) solubilization बफर (50 मिमी Tris पीएच 8, 20% (v / v) ग्लिसरॉल, 1 एम NaCl, 1 मिमी डीटीटी, protease inhibitors, 4% (w / v) DDM). इस बुलबुले बनाता है के रूप में बफर, डिटर्जेंट के प्रसार के साथ सहायता, लेकिन मिश्रण vortexing से बचने के लिए एक sonicator स्नान (35 डब्ल्यू, 40 kHz) में sonicated जा सकता है. उपयोग करने से पहले 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा.
  4. रसोई गैस शोधन के लिए CFTR शुद्धि बफर 50 मिमी Tris, 10% (v / v) ग्लिसरॉल, 50 मिमी NaCl, 1 मिमी डीटीटी, 0.1% (w / v) एलपीजी-14 और protease inhibitors है. इस बफर के 350 मिलीलीटर, और एक ही बफर प्लस 1 एम imidazole की 150 मिलीलीटर की तैयारी. 8 को दोनों buffers की पीएच को समायोजित करें.
  5. DDM में शुद्धि के लिए बफर 50 मिमी Tris पीएच 8, 20% (v / v) ग्लिसरॉल, 1 एम NaCl, 1 मिमी डीटीटी, 0.1% (w / v) DDM के होते हैं. इस बफर के 350 मिलीलीटर, और एक ही बफर के 150 मिलीलीटर प्लस 1 एम imidazo तैयार करेंLe. 8 को दोनों buffers की पीएच को समायोजित करें.
  6. एलपीजी युक्त जेल पारगमन क्रोमैटोग्राफी (जीपीसी) बफर के लिए, 50 मिमी Tris पीएच 8, 10% (v / v) ग्लिसरॉल, 50 मिमी NaCl, 1 मिमी डीटीटी, 0.05% (w / v) एलपीजी-14 तैयार करते हैं. DDM का उपयोग जीपीसी 50 मिमी Tris पीएच 8, 20% (v / v) ग्लिसरॉल, 1 एम NaCl, 1 मिमी डीटीटी, 0.1% (w / v) DDM की एक बफर तैयार करने के लिए. जीपीसी स्तंभ पर इस्तेमाल सभी buffers और DDH 2 हे फ़िल्टर्ड (0.2 माइक्रोन फिल्टर) और उपयोग करने से पहले degassed किया जाना चाहिए.
  7. एसडीएस पृष्ठ नमूना बफर (काम एकाग्रता 2x): 50 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 7.6, 5% (v / v) ग्लिसरॉल, 5 मिमी EDTA, 0.02% (w / v) bromophenol नीला. -20 डिग्री सेल्सियस पर 700 μl aliquots और दुकान बनाओ उपयोग करने से पहले, 20% की 200 μl (w / v) सोडियम सल्फेट dodecyl (एसडीएस) और ताजा 0.5 एम डीटीटी के 100 μl जोड़ें. जेल पर लोड करने से पहले कमरे के तापमान पर नमूने के साथ कम से कम 10 मिनट के लिए सेते हैं. गर्मी नहीं है; यह GFP denature जाएगा और CFTR कुल करने के लिए कारण हो सकता है.
  8. पुनर्गठन के लिए लिपिड शेयरों बनाने के लिए, ई. के एक 4:1 (डब्ल्यू / डब्ल्यू) मिश्रण भंग कोली लिपिड एकडी क्लोरोफॉर्म और मेथनॉल में कोलेस्ट्रॉल (2:1 वी / वी), और एक लिपिड फिल्म के लिए फार्म 2 घंटे के लिए एन 2 गैस के तहत एक कांच की शीशी में सूखा. मिलीलीटर 40 मिलीग्राम / का एक लिपिड एकाग्रता के लिए (कोई NaCl के साथ) जीपीसी बफर जोड़ें और समाधान स्पष्ट करने के लिए दोहराया vortexing और sonication (35 डब्ल्यू, 40 kHz) का उपयोग करें.
  9. ATPase परख के लिए, DDH 2 हे में 1 मीटर DMSO, NaSCN में 1 मिमी SCH28080 भंग करके और 100% में 2.5 मिमी (v / v) इथेनॉल के लिए oligomycin ATPase inhibitors का 100x शेयरों तैयार करते हैं. -20 डिग्री सेल्सियस पर aliquots में स्टोर 50 मिमी Tris पीएच 7.4, 150 मिमी एनएच 4 सीएल, 5 मिमी MgSO 4 और 0.02% (w / v) NaN 3 के साथ ATPase बफर के 100 मिलीलीटर. इस कमरे के तापमान पर रखा और कई assays के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उपयोग और बर्फ पर रखने के लिए तुरंत पहले एक 5 मिमी एटीपी स्टॉक तैयार करें. (नो बॉल का प्रयोग ना 2 एटीपी परख में फॉस्फेट से अत्यधिक पृष्ठभूमि संकेत को रोकने के लिए). एसडीएस स्थान पर समाधान (12% (w / v) DDH में एसडीएस 2 हे) तैयार करें.
  10. Chifflet का पता लगाने के लिए डब्ल्यू (ए (3% बफर तैयार/ वी) एस्कॉर्बेट, 0.5% (w / v) अमोनियम molybdate, 0.5 एम एचसीएल) तुरंत उपयोग करने से पहले और बी बफर (2% (w / v) सोडियम साइट्रेट, 2% (w / v) सोडियम मेटा आर्सेनाइट, 2% (v / v) एसिटिक एसिड).

खमीर Microsomes के 2. अलगाव

  1. O'Ryan एट अल में वर्णित के रूप में चिकन CFTR व्यक्त एस cerevisiae बड़े हो रहे हैं. (2012) 14. अप करने के लिए 6 महीने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर दो aliquots में एक 20 एल किण्वन से सामग्री स्टोर.
  2. तेजी से कोशिकाओं के एक विभाज्य defrost और कोशिकाओं के ग्राम प्रति 3 मिलीलीटर ठंडा mPIB में resuspend.
  3. 425-600 माइक्रोन व्यास की ग्लास मनकों का उपयोग कर एक मनका मिल में कोशिकाओं को बाधित. 1 मिनट बाकी अवधि के द्वारा अलग सेल विघटन के पाँच 1 मिनट अवधि का प्रयोग करें. (बाकी समय कोशिकाओं विघटन के दौरान गर्म नहीं कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हैं.)
  4. मनका मिल से सेल lysate के 1 मिलीलीटर नमूने की centrifugation द्वारा सेल व्यवधान मॉनिटर. एक बेंच शीर्ष centr में अपकेंद्रित्र (12,000 XG, 4 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट)ifuge. एक क्युवेट में mPIB साथ 01:50 के लिए सतह पर तैरनेवाला पतला और ए 380 को मापने. एक 380> 0.1, या कई दोहराया मनका पिटाई चक्र के बावजूद बढ़ती बंद कर दिया है, तो निम्न चरण पर आगे बढ़ें. यदि नहीं, तो 2.3-2.4 दोहराएँ.
  5. कुल सेल lysate (12,000 एक्स अपकेंद्रित्र जी, 4 डिग्री सेल्सियस, 20 मिनट). सतह पर तैरनेवाला को बनाये रखें. (अटूट कोशिकाओं और mitochondria युक्त) गोली त्यागें, लेकिन सेल टूटना की दक्षता के बारे में कोई संदेह नहीं है (2.4 देखें) है, तो भी गोली बरकरार रहती है.
  6. पिछले चरण (200,000 XG, 4 डिग्री सेल्सियस, 1.5 घंटा) से सतह पर तैरनेवाला अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और CFTR बफर में pelleted माइक्रोसोमल झिल्ली resuspend. Microsomes DDM का उपयोग कर शुद्धि के लिए इरादा कर रहे हैं, 1 एम NaCl साथ CFTR बफर के पूरक.
  7. 100,000 एक्स (resuspended झिल्ली अंश का centrifugation दोहराएँ जी, 4 डिग्री सेल्सियस, 1 घंटा) और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
  8. Pelleted microsomes में ResuspendCFTR बफर का एक न्यूनतम मात्रा (अंतिम मात्रा 5-15 मिलीग्राम, कुल माइक्रोसोमल प्रोटीन 70-200 मिलीग्राम). एक ब्रैडफोर्ड परख माइक्रोसोमल प्रोटीन 25 के कुल एकाग्रता का निर्धारण किया जा सकता है. इसके अलावा झिल्ली की प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रम मापा जाना चाहिए (उत्तेजना = 485 एनएम, उत्सर्जन = 500-600 एनएम) और एक अलग GFP प्रतिदीप्ति शिखर (512 एनएम पर अधिकतम) होना चाहिए. CFTR विशेष रूप से GFP प्रतिदीप्ति परिस्थितियों में स्कैन किए गए एक एसडीएस पृष्ठ जेल, चित्रा (1) पर पाया जा सकता है.
  9. फ्लैश फ्रीज तरल नाइट्रोजन में डूबनेवाला द्वारा resuspended microsomes और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर, या 3 चरण पर जारी रखें.

Microsomes की 3. Solubilization

  1. जमे हुए हैं, तो तुरंत 10 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट एक पानी के स्नान में उपयोग करने से पहले microsomes defrost
  2. झिल्ली की solubilization के लिए, एक अंतिम डिटर्जेंट एकाग्रता के देने के लिए प्रासंगिक solubilization बफर (1.3 चरण) के एक बराबर मात्रा के साथ microsomes पतला2% (w / v) और एक माइक्रोसोमल प्रोटीन एकाग्रता 5 मिलीग्राम / एमएल. आंदोलन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस (ट्यूब रोटेटर) पर 1 घंटे के लिए इस मिश्रण को सेते हैं. विश्लेषण के लिए 200 μl को बनाये रखें.
  3. मिश्रण (100,000 XG, 4 डिग्री सेल्सियस, 45 मिनट) अपकेंद्रित्र. Solubilized झिल्ली प्रोटीन युक्त सतह पर तैरनेवाला निकालें, एक 0.45 सुक्ष्ममापी सिरिंज फिल्टर के माध्यम से इसे पारित और बर्फ पर दुकान. (2.8 कदम के रूप में) पर तैरनेवाला के प्रतिदीप्ति उपाय.
  4. 1% में अघुलनशील अंश घुलनशील अंश के बराबर मात्रा के लिए (w / v) एसडीएस समाधान Resuspend. इस अंश में प्रतिदीप्ति उपाय और एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण के लिए 50 μl के एक विभाज्य बरकरार रहती है.

CFTR के 4. निकल संबंध शुद्धीकरण

  1. श्रृंखला में लिंक दो 5 एमएल निकल sepharose स्तंभ. तो 1 एम imidazole युक्त, (1.4-1.5 चरण) solubilization बफर के 2 सीवी साथ स्तंभ धोने, DDH 2 हे 2 सीवी द्वारा पीछा (v / v) इथेनॉल, 2 स्तंभ मात्रा (सीवी) के साथ 20% धो लें. Solubilizat के 2 सीवी साथ दोहराएँआयन imidazole कमी बफर.
  2. Solubilized सामग्री (2.8 कदम) के लिए 5 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए imidazole जोड़ें और एक स्वचालित तरल क्रोमैटोग्राफी डिवाइस का उपयोग यदि स्वयं स्तंभ पर या एक नमूना पाश में सामग्री लोड.
  3. 0.5 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह दर पर स्तंभ पर solubilized सामग्री लोड, और अपार सामग्री को हटाने के लिए एक ही प्रवाह दर पर imidazole कमी बफर के 2 सीवी से धो लें. 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूबों में भिन्न लीजिए.
  4. पहली धोने के लिए, 1 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह दर पर 40 मिमी imidazole साथ शुद्धि बफर के 3 सीवी का उपयोग करें. 2 मिलीलीटर भिन्न लीजिए.
  5. दूसरे धोने के लिए, 100 मिमी imidazole साथ शुद्धि बफर के 3 सीवी का उपयोग करें. 2 मिलीलीटर भिन्न लीजिए.
  6. 400 मिमी imidazole साथ शुद्धि बफर के 3 सीवी साथ HisTrap स्तंभ से Elute CFTR. 2 मिलीलीटर भिन्न लीजिए.
  7. Eluted भिन्न (2.8 चरण) में प्रतिदीप्ति मॉनिटर.
  8. एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण के लिए चोटी के अंशों की aliquots को बनाये रखें. फ्लैश फ्रीज शेष शिखर चraction नमूने और दुकान -80 डिग्री सेल्सियस पर, या अगले शुद्धि कदम जारी है.

CFTR की 5. जेल पारगमन क्रोमैटोग्राफी (जीपीसी) शोधन

  1. 1.2 सीवी जीपीसी बफर द्वारा पीछा 1.2 सीवी DDH 2 हे के साथ स्तंभ (Superose 6 10/300 जीएल) संतुलित करना.
  2. 5.1 कदम के दौरान, 4 डिग्री सेल्सियस पर एक 100,000 MWCO केन्द्रापसारक फिल्टर का उपयोग उच्चतम GFP प्रतिदीप्ति साथ नी आत्मीयता शुद्ध किया अंशों ध्यान केंद्रित DDM में सफ़ाई, यह महत्वपूर्ण नमूना नुकसान का कारण होगा के रूप में 0.3 मिलीग्राम / एमएल प्रोटीन के एक प्रोटीन एकाग्रता ऊपर नमूना ध्यान केंद्रित कर से बचने. 100,000 एक्स पर concentrator और अपकेंद्रित्र से retentate निकालें बड़े कणों गोली 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए जी.
  3. स्तंभ पर इस नमूने इंजेक्षन और 1.2 सीवी जीपीसी बफर के एक isocratic ढाल के साथ elute. 0.5 मिलीलीटर भिन्न लीजिए.
  4. CFTR युक्त उन अंशों की पहचान करने के लिए खंड 2.8 में के रूप में GFP प्रतिदीप्ति उपाय. एक छोटी मात्रा बरकरार रहती है (उदाहरण के लिए </ उन्हें> एसडीएस पृष्ठ द्वारा विश्लेषण के लिए प्रत्येक के 50 μl).
  5. -80 डिग्री सेल्सियस पर तरल नाइट्रोजन और दुकान में भिन्न रुक

CFTR की 6. पुनर्गठन

  1. लिपिड करने वाली प्रोटीन अनुपात 100:1 (डब्ल्यू / डब्ल्यू) में शुद्ध CFTR को लिपिड (चरण 1.8) जोड़ें और 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. इसी जीपीसी बफर के समान मात्रा के साथ शुद्ध प्रोटीन प्रतिस्थापन, एक लिपिड ही नियंत्रण स्थापित किया.
  2. हाइड्रोफोबिक पी लेनेवाला मोती का उपयोग प्रोटीन / लिपिड मिश्रण से डिटर्जेंट निकालें. 5 सीवी DDH 2 हे, 5 सीवी 70% (v / v) इथेनॉल, 5 सीवी DDH 2 हे, और डिटर्जेंट की कमी 5 सीवी जीपीसी बफर में पी लेनेवाला मोती धो लें. शुद्ध प्रोटीन की मिलीलीटर प्रति धोया पी लेनेवाला मोतियों की 200 मिलीग्राम जोड़ें और कोमल आंदोलन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात सेते.
  3. एक पतली समाप्त पिपेट टिप का उपयोग कर एक ताजा ट्यूब में पी लेनेवाला मोतियों से पुनर्गठन नमूना ले लीजिए.

ATPase गतिविधि के 7. मापन

  1. सीएफटी की दर निर्धारितएक 96 अच्छी तरह से थाली प्रारूप में एक संशोधित Chifflet परख 26,27 का उपयोग आर विशिष्ट ATPase गतिविधि. सोडियम फास्फेट शेयर समाधान के साथ (0.65 मिमी) के मानकों के रूप में 50 μl के अंतिम मात्रा में 0-20 nmol फॉस्फेट तैयार करते हैं. फॉस्फेट शेयर कमजोर करने CFTR बफर और ATPase बफर की एक 1:1 मिश्रण का प्रयोग करें.
  2. 10 मिनट के लिए बर्फ पर 1:100 (v / v) ATPase अवरोधक (चरण 1.9) के साथ पुनर्गठन CFTR और खाली liposomes दोनों सेते हैं. पुनर्गठन CFTR का कम से कम 5 ग्राम का प्रयोग करें.
  3. 2 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए एटीपी (चरण 1.9) जोड़ें और 1 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. (मानकों सहित) प्रत्येक अच्छी तरह से (w / v) एसडीएस (1.9 चरण) 10% से 40 μl जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो.
  4. बफर के 100 μl जोड़ें (1.10 चरण) और 10 मिनट के लिए सेते हैं. अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 100 μl बफर बी (1.10) जोड़ें और एक 96 अच्छी तरह से थाली संगत यूवी / विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में 800 एनएम के तरंग दैर्ध्य में absorbance के उपाय.
  5. का उपयोग कर मुक्त फॉस्फेट की राशि में 800 एनएम पर absorbance कन्वर्टफॉस्फेट मानकों. पृष्ठभूमि संकेत (liposome केवल कुओं) को घटाने के बाद एटीपी hydrolysis की दर की गणना.
  6. गैर पुनर्गठन CFTR के लिए पृष्ठभूमि रीडिंग के लिए CFTR बफर का उपयोग एक ही प्रोटोकॉल का पालन करें.

Representative Results

ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल कच्चे microsomes की सेल टूटना और तैयारी (चित्रा 1) के दौरान CFTR की लगभग पूरी तरह ठीक होने के साथ CFTR समृद्ध microsomes, अलग करने के लिए एक कारगर साधन है. अन्य सेल टूटना तरीकों को भी प्रभावी ढंग से नियोजित किया जा सकता है. हम बराबर क्षमता के साथ एक फ्रेंच दबाव सेल, और अन्य high-pressure/cavitation उपकरणों (यह भी एक रूबी लक्ष्य के मुकाबले को प्रभावित के साथ संयोजन में) का उपयोग किया है. सुविधा और उपकरणों की कम प्रारंभिक लागत के लिए, हम मनका पिटाई विधि सबसे अच्छा लगता है.

CFTR solubilize और शुद्ध करने के लिए रसोई गैस का प्रयोग> 90% शुद्धता (चित्रा 2) में 80 ग्राम प्रोटीन / एल संस्कृति झुकेंगे. उच्च उपज की वजह से रसोई गैस (चित्रा 2B, गलियों 2 और 4 तुलना) द्वारा CFTR के कुशल solubilization के लिए गया था. इसके अलावा, कुशल और स्तंभ के लिए बाध्य तंग न्यूनतम अनबाउंड अंश में CFTR की हानि और धोने भागों में CFTR की अनुपस्थिति (चित्रा 2, गलियों 3, 5 में हुई, और6). eluted प्रोटीन Coomassie से सना हुआ एसडीएस पृष्ठ जैल से अनुमान लगाया और CFTR और दूषित पदार्थों को बैंड की densitometry का उपयोग कर,> 90% की शुद्धता था. जेल पारगमन क्रोमैटोग्राफी (जीपीसी) कम आणविक वजन contaminants से एलपीजी शुद्ध CFTR (चित्रा 4, कम पैनल) अलग कर दिया.

DDM का उपयोग CFTR शुद्धि के लिए प्रोटोकॉल के बारे में 60% और लगभग 50 माइक्रोग्राम / एल की उपज (चित्रा 3) की पवित्रता देता है. के बारे में 10 मिलीलीटर (चित्रा 4) में eluting जीपीसी से नकारात्मक दाग अंशों की इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) DDM शुद्ध CFTR 20-30 एनएम व्यास के समुच्चय के साथ ही 10 एनएम व्यास (नहीं दिखाया डेटा) के छोटे कण है जिसमें दिखाया. यह छोटे समुच्चय reversibly EM-detectable समुच्चय को दूर करने में विफल सहयोगी और एक 1 एमडीए कट ऑफ फिल्टर के साथ ultrafiltration के रूप में अलग कर देना सकता है कि संभव है. एलपीजी शुद्ध सामग्री इसलिए बेदाग अंशों की क्रायो EM द्वारा अध्ययन किया गया था, एक चमक छुट्टी दे ग्रिड को सोखना नहीं था. यह पता चला हैएक अपेक्षाकृत छोटे आकार का एक बहुत सजातीय कण आबादी (6-8 एनएम व्यास, डेटा दिखाया गया है).

अंत में, शुद्ध प्रोटीन की ATPase गतिविधि (चित्रा 5) मापा गया था. एबीसी प्रोटीन परिवार के एक सदस्य के रूप में CFTR एटीपी बाध्यकारी और / या hydrolyzing में सक्षम दो न्यूक्लीओटाइड बाध्यकारी डोमेन (NBDs) है. डेटा शुद्ध प्रोटीन एलपीजी solubilized राज्य में एटीपी hydrolyze करने में सक्षम नहीं था और DDM की उपस्थिति (चित्रा 5, रिक्त सलाखों) में कमजोर ATPase गतिविधि से पता चला है कि संकेत मिलता है. लिपिड, और डिटर्जेंट हटाने के बाद इसके अलावा, ATPase गतिविधि DDM (13 nmol एटीपी / मिनट / मिलीग्राम प्रोटीन) में शोधित किया गया था कि नमूने के लिए 4 गुना अधिक था. लिपिड और रसोई गैस का उपयोग कर अलग कर दिया गया था कि CFTR को एलपीजी इसी बहाल गतिविधि को हटाने, लेकिन के अलावा DDM शुद्ध और पुनर्गठन सामग्री की तुलना में एक अंतिम कम दर (1.5 nmol एटीपी / मिनट / मिलीग्राम प्रोटीन) के साथ.

चित्रा 1 चित्रा 1. सेल lysate में चिकन CFTR (सीएल) की निगरानी के स्तर, supernatants (एस) और microsome अलगाव और कपड़े धोने के लिए इस्तेमाल विभिन्न centrifugation कदम दौरान छर्रों (पी). एसडीएस पृष्ठ जैल GFP की में जेल प्रतिदीप्ति का उपयोग कल्पना गया टैग. 14,000 XG पर सेल टूटना और centrifugation के बाद सतह पर तैरनेवाला (गिरावट उत्पादों सहित) लगभग सभी CFTR होता है. सभी पूर्ण लंबाई CFTR सतह पर तैरनेवाला में कुछ टुकड़े को छोड़कर 200,000 XG अवसादों में ultracentrifugation. नमक धोया microsomes छर्रों कुछ आगे टुकड़े को हटाने के साथ लगभग सभी CFTR के 100,000 XG पर ultracentrifugation.

चित्रा 2
Immobilized धातु आयन आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी द्वारा रसोई गैस में चिकन CFTR की चित्रा 2. शोधन. भिन्न Coomassie धुंधला (ऊपरी पैनल) और GFP टैग (कम पैनल) के प्रतिदीप्ति का पता लगाने के द्वारा पीछा एसडीएस पृष्ठ से विश्लेषण किया गया. पटरियों: (1) Microsomes. (2) रसोई गैस के solubilized microsomes. (3) अनबाउंड सामग्री. (4) अघुलनशील सामग्री. (5) और (6) 40 और 100 मिमी imidazole washes. (7) सामग्री 400 मिमी imidazole साथ eluted.

चित्रा 3
Immobilized धातु आयन आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी द्वारा DDM में चिकन CFTR की चित्रा 3. शोधन. भिन्न Coomassie धुंधला द्वारा पीछा एसडीएस पृष्ठ से विश्लेषण किया गया. बाएं ओर के पैनल से पहले क्षालन के लिए भिन्न पता चलता है. कई लगातार क्षालन भागों में CFTR साथ सही हाथ पैनल में दिखाए जाते हैंतीर द्वारा dicated. बाद में भिन्न ribosomal प्रोटीन L3 के रूप में मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पहचान की गई है जो एक 40 केडीए संदूषक, में समृद्ध है.

चित्रा 4
जेल पारगमन क्रोमैटोग्राफी द्वारा चिकन CFTR की चित्रा 4. शोधन नी आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्ध. CFTR ध्यान केंद्रित किया और एक जीपीसी स्तंभ के लिए लागू किया गया था. CFTR (ऊपरी पैनल) के लिए क्षालन प्रोफ़ाइल एलपीजी-14 (ठोस लाइन) या DDM (धराशायी लाइन) मढ़ा जाता युक्त बफर में शुद्ध किया. एसडीएस पृष्ठ (कम पैनल) CFTR 8 और 11 मिलीग्राम के बीच eluted कि पता चला.

चित्रा 5
चित्रा 5. ATPase activitDDM या रसोई गैस में शुद्ध Y शुद्ध किया चिकन CFTR अंशों की. प्रोटीन एफ पी और वि प्रकार ATPases (रिक्त सलाखों से किसी भी पृष्ठभूमि ATPase गतिविधि को खत्म करने ATPase inhibitors के एक कॉकटेल की उपस्थिति में एक संशोधित Chifflet परख 26 का उपयोग assayed किया गया था ). एटीपी hydrolysis की दर भी डिटर्जेंट हटाने और लिपिड अलावा (भरा सलाखों) के बाद मापा गया था. साजिश मतलब है और मानक विचलन से पता चलता है (n = 3). मतलब उपस्थिति और लिपिड के अभाव में ATPase गतिविधि के लिए मूल्यों, और DDM और रसोई गैस में गतिविधि के बीच अंतर के बीच मतभेद पी <0.05 के लिए महत्वपूर्ण हैं.

Discussion

हम पहले से murine CFTR 14 की overexpression के लिए एक विधि का वर्णन किया है. कि प्रोटोकॉल के प्रकाशन के बाद से, हम एक ही प्रणाली का उपयोग CFTR के कई अलग orthologs व्यक्त किया है और शुद्ध है. DDM शुद्धि अलग orthologs भर में अधिक भिन्नता (नहीं दिखाया डेटा) से पता चला है whilst के सभी परीक्षण orthologs अब तक, रसोई गैस डिटर्जेंट में अच्छी तरह से शुद्ध किया. यह लचीलापन खमीर दृष्टिकोण की ताकत को दिखाता है: यह एक विशेष उद्देश्य के लिए एक का चयन करने के क्रम में रिश्तेदार तेज़ी के साथ कई निर्माणों स्क्रीन करने के लिए संभव है.

1 एम NaCl पिछले एक क्लीनर microsome तैयारी में DDM परिणामों के साथ solubilization और बाद के चरणों में contaminants कम कर देता है के लिए युक्त बफर के साथ खमीर microsomes वॉशिंग. अंतिम CFTR नमूना microsome धोने के बिना> 90% शुद्ध रूप में यह कदम एलपीजी प्रोटोकॉल में अनावश्यक है. इसके अलावा, DDM में शुद्धि solubilization एक के लिए बफ़र्स के लिए कई परिवर्तन की आवश्यकता हैएन डी शुद्धि, अतिरिक्त ग्लिसरॉल और नमक की अर्थात् अलावा. साथ में, इन अतिरिक्त काफी स्तंभ को DDM-solubilized प्रोटीन के बंधन में वृद्धि हुई.

DDM शुद्धि कार्यप्रणाली में सुधार के लिए, विशेष रूप से मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा न्याय है कि एक 40 केडीए प्रमुख संदूषक को हटाने, निकल राल के लिए एक अंतर्निहित समानता है प्रकट होता है जो खमीर ribosomal सबयूनिट L3, की वजह से है गुंजाइश है. वहाँ L3 प्रोटीन में कोई स्पष्ट polyHis अनुक्रम है, लेकिन राइबोसोम के लिए बाध्य जब अपने 3 डी संरचना की परीक्षा (पीडीबी = 1FFK) मुड़ा L3 सबयूनिट एक संभावित polyHis क्लस्टर है कि दिखाता है. इस बैंड एलपीजी शुद्ध सामग्री में कम समस्याग्रस्त है कि कठोर एलपीजी डिटर्जेंट के कारण हो सकता है.

DDM में शुद्धि रसोई गैस में है कि अधिक से अधिक गरीब हो गया लगता है हालांकि, इस तरह के DDM के रूप में मामूली डिटर्जेंट कार्यात्मक और संरचनात्मक विश्लेषण के साथ संगत हो सकता है और पहले से ही कई एक्स - रे crystall में इस्तेमाल किया गया हैझिल्ली प्रोटीन 15-21 की ographic पढ़ाई. इसके अलावा, हमारे परिणाम रसोई गैस का उपयोग DDM में शुद्धि के लिए CFTR सापेक्ष में ATPase समारोह के नुकसान की ओर जाता है कि संकेत दिया. इसलिए हम इस तरह के बाद translational संशोधनों के लक्षण वर्णन के रूप में आवेदन में उदाहरण के लिए, या एंटीबॉडी की पीढ़ी में, रसोई गैस आधारित प्रोटोकॉल चुना जाएगा, पवित्रता महत्वपूर्ण है जहां CFTR की पीढ़ी के लिए रसोई गैस आधारित शुद्धि प्रोटोकॉल की सिफारिश करेंगे . प्रोटीन की गतिविधि और पूरी तरह से देशी राज्य आवश्यक है अनुप्रयोगों में जहां दूसरी ओर, हम एक बेहतर विकल्प के रूप में DDM आधारित प्रोटोकॉल का प्रस्ताव होगा.

समाप्त करने के लिए, इस प्रोटोकॉल zwitterionic डिटर्जेंट एलपीजी-14 या गैर ईओण डिटर्जेंट DDM में CFTR के अलगाव के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि का वर्णन करता है. ऐसे में यह पहले से 10-13 सूचित किया गया है से CFTR के लिए शोधन की स्थिति की एक बड़ी रेंज इंगित करता है. इसके अलावा मिलीग्राम में शुद्ध CFTR की मात्रा हो सकती हैइस तरह के एक 20 एल किण्वक और इस तरह एक 6 एल कम गति अपकेंद्रित्र रोटर के रूप में एक उच्च क्षमता सेल संचयन प्रणाली के रूप में एक उच्च मात्रा खमीर विकास प्रणाली के साथ संयुक्त जब इन प्रक्रियाओं का उपयोग कर प्राप्त की. प्राप्त CFTR विभिन्न जैव रासायनिक और biophysical assays में प्रोटीन का आसान निगरानी की अनुमति देता है जो एक cleavable GFP टैग है.

इस पांडुलिपि (चिकन CFTR युक्त प्लाज्मिड या फ्रोजन खमीर कोशिकाओं) में वर्णित अभिकर्मक सिस्टिक फाइब्रोसिस फाउंडेशन (यूएसए) के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है.

Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों और न ही इस काम के लिए सम्मान के साथ अन्य परस्पर विरोधी हितों की है.

Acknowledgments

यह काम अपने CFTR 3 डी संरचना कंसोर्टियम के माध्यम से अमेरिका सिस्टिक फाइब्रोसिस फाउंडेशन (CFF) द्वारा वित्त पोषित किया गया. टी.आर. ब्रिटेन के एक बीबीएसआरसी छात्रावस्था द्वारा ब्रिटेन के एक सीएफ ट्रस्ट छात्रवृत्ति, और नेकां द्वारा वित्त पोषित किया गया. हम उनकी मदद और सलाह के लिए और कोडोन अनुकूलित चिकन CFTR अनुक्रम और शुद्धि टैग की डिजाइन के लिए CFF CFTR 3 डी संरचना संघ में हमारे सहयोगियों को स्वीकार करते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 μm syringe filter  Sartorius FC121
100 kDa MWCO centrifugal concentrator (PES membrane) Vivaspin VS0641
2 ml microfuge tubes Sarstedt 72.695
40Ti rotor Beckman Coulter 337901
50 ml sterile Falcon tubes Sarstedt 62.547.254
Adenosine triphosphate disodium salt (Na2ATP) Sigma-Aldrich A26209
Liquid chromatography system GE Healthcare 28-4062-64
Aminoethylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF) Sigma-Aldrich A8456
Glass bead-beating cell disrupter BioSpec 1107900
Benchtop centrifuge  HERMLE Z300
Benchtop centrifuge  Eppendorf 5417R
Benchtop microfuge  Fisher 13-100-511
Benzamidine hydrochloride Sigma-Aldrich 434760
Hydrophobic Beads SM-2 Adsorbent BioRad 152-3920
Bromophenol blue Sigma-Aldrich 114391
Centrifuge tubes Beckman Coulter 357000
Gel imaging system BioRad 170-808
Cholesterol Sigma-Aldrich C8667
Chymostatin  Sigma-Aldrich C7268
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 43815
E. coli total lipid extract Avanti lipids 100500
Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) Sigma-Aldrich E3132
Glass beads, acid washed Sigma G8772
Glycerol Fisher 65017
HisTrap HP columns (5 ml) GE Healthcare 17-5247-05
Rapid Coomassie Stain Novexin ISB1L
Centrifuge JA-17 rotor Beckman Coulter 369691
Leupeptin Merck 108975
Lyso-phosphatidyl glycerol-14 (LPG) Avanti lipids 858120
MgSO4 Sigma-Aldrich M7506
Gel tank SDS-PAGE system BioRad 165-8006
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside (DDM) Affymetrix D310S
NaCl Sigma-Aldrich S6191
NaN3 Sigma-Aldrich S2002
NH4Cl Sigma-Aldrich A9434
Oligomycin Sigma-Aldrich 75351
Ultracentrifuge Beckman Coulter 392050
Prestained protein standards Fermentas SM1811
Desalting columns (Sephadex G-25) GE Healthcare 17-0851-01
Pepstatin A Sigma-Aldrich P4265
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) Sigma-Aldrich P7626
SCH28080 Sigma-Aldrich S4443
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich L37771
Sodium thiocyanate (NaSCN) Sigma-Aldrich 251410
Gel filtration 10/300 GL column GE Healthcare 17-5172-01
Tris-base Formedium TRIS01
Ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 355618
Vortex mixer Star Labs N2400-0001
Ultrasonic water bath Ultrawave F0002202
Multimode plate reader BioTek BTH1MF

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References

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