Eterotopico mucosa engrafting Procedura di Drug Delivery diretto al cervello nei topi

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Summary

Un modello murino di ricostruzione base cranica endoscopica umana sviluppato che crea un'interfaccia semipermeabile tra il cervello e il naso utilizzando innesti mucose nasali. Questo metodo permette ai ricercatori di studiare consegna al sistema nervoso centrale di alto peso molecolare terapeutica che altrimenti esclusi dalla barriera emato-encefalica, se somministrati per via sistemica.

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Kohman, R. E., Han, X., Bleier, B. S. Heterotopic Mucosal Engrafting Procedure for Direct Drug Delivery to the Brain in Mice. J. Vis. Exp. (89), e51452, doi:10.3791/51452 (2014).

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Abstract

Consegna di terapeutica nel cervello è ostacolato dalla presenza della barriera ematoencefalica (BBB) ​​che limita il passaggio di composti polari e ad alto peso molecolare dal flusso sanguigno e nel tessuto cerebrale. Alcuni successi consegna diretta negli esseri umani è stato raggiunto tramite l'impianto di cateteri transcraniali; Tuttavia questo metodo è altamente invasiva e associati con numerose complicazioni. Un'alternativa meno invasiva sarebbe dosare il cervello attraverso una impiantato chirurgicamente, membrana semipermeabile come la mucosa nasale che viene utilizzato per riparare difetti base cranica seguente endoscopica transnasale rimozione chirurgica del tumore nell'uomo. Trasferimento Drug se questa membrana potrebbe effettivamente bypassare la BBB e diffondere direttamente nel cervello e nel liquido cerebrospinale. Ispirato da questo approccio, un approccio chirurgico nei topi è stata sviluppata che utilizza una membrana mucosa del setto donatore innestato su un difetto extracranica BBB chirurgico. Questo modello è stato dimostrato efficaceconsentire il passaggio di composti ad alto peso molecolare nel cervello. Dal momento che numerosi farmaci candidati sono in grado di attraversare la BBB, questo modello è utile per l'esecuzione di sperimentazione preclinica di nuove terapie per le malattie neurologiche e psichiatriche.

Introduction

Il trattamento della malattia neurologica e psichiatrica è fortemente ostacolato dalla presenza della barriera ematoencefalica (BBB) ​​che impedisce oltre il 95% di tutti i potenziali agenti farmaceutici di raggiungere il sistema nervoso centrale 1-3. Ad esempio, derivazione gliale fattore neurotrofico (GDNF) ha dimostrato di essere efficace nel trattamento della malattia di Parkinson quando iniettato direttamente nel cervello, tuttavia è inefficace quando consegnato sistemica perché non può penetrare la BBB 4-6.

Numerosi avvicinato sono stati sviluppati per cercare di aggirare questo problema. Miglioramento della consegna sistematica di neurotheraputics è stata dimostrata utilizzando coniugati contenenti anticorpi selettivi per le proteine ​​di trasporto localizzate sull'endotelio capillare cervello; tuttavia questo metodo non ha dimostrato di essere applicabile per una vasta gamma di farmaci 7,8. Inoltre, l'apertura osmotica della BBB è stato usato clinicaalleato, tuttavia questo metodo soffre di dosaggio di farmaci sistemici rispetto a una consegna più diretto alla regione del cervello di interesse 9. Notevole sforzo è stato messo in ottimizzazione consegna transnasale nella speranza di mira direttamente il cervello 10-12. Sebbene un certo successo è stato raggiunto, risultati conclusivi sono stati ottenuti solo per farmaci che posseggono recettori endogeni, come l'insulina 13,14. Inoltre il meccanismo di consegna transnasale è stato controverso con prove che suggeriscono ingresso indiretto nel cervello attraverso olfattivo neurone assorbimento o attraverso il flusso sanguigno 11. , Consegna transcranica diretta utilizzando cateteri impiantabili è stato raggiunto, tuttavia questa procedura è altamente invasiva e associata a numerose complicanze 15,16. Ad oggi, non esiste un metodo generale, minimamente invasivo per fornire composti ad alto peso molecolare nel cervello.

Qui presentata è una procedura chirurgica murinoche crea un'interfaccia semipermeabile con il cervello. Questo si ottiene innestando un espianto membrana mucosa 17 su un difetto craniotomia chirurgica in un topo. Utilizzando questa procedura è stato dimostrato che i composti solubili fino a 500 kDa possono essere trasportati nel sistema nervoso centrale (direttamente nel parenchima cerebrale e nel liquido cerebrospinale) sia un tempo e peso molecolare di modo dipendente 18. Questo metodo di aggirare la BBB è un modello per la riparazione dei difetti di base del cranio negli esseri umani che utilizza innesti di mucosa vascolarizzati per riparare buchi nel cranio dopo la chirurgia endoscopica transnasale 19,20.

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Protocol

Prima dell'intervento assicurarsi tutte le procedure da fare sono approvati dalla IACUC e qualsiasi autorità etiche o giuridiche addizionali e utilizzare crudeli pratiche di trattamento degli animali. Questo include l'utilizzo di condizioni di chirurgia sterili, anestetizzare il mouse utilizzando IACUC metodo approvato, lubrificanti occhi topi con vet unguento durante l'intervento chirurgico, e fornire assistenza post-chirurgica. Non procedere con la chirurgia se c'è qualche problema se aspetti della procedura sono approvati. Tutte le procedure eseguite nel presente documento sono state approvate dalla Università Institutional Animal Care ed uso comitato di Boston.

1. Preparazione degli animali e Forniture chirurgici

  1. Autoclavare tutto strumento chirurgico che verrà utilizzato durante l'intervento chirurgico.
  2. Assicurarsi che tutte le tecniche che devono essere eseguite sono approvati dalle agenzie di regolamentazione degli animali.

2. Raccolta della mucosa Graft

  1. Ha scelto un topo geneticamente identico di età simile comeil mouse sperimentale e eutanasia in un metodo approvato IACUC (qui: asfissia isoflurane seguita da dislocazione cervicale).
  2. Utilizzando forbici chirurgiche, togliere la pelle intorno alla regione nasale della testa del mouse esporre il cranio.
  3. Con un martello pneumatico, volume con tre linee di cui due laterali fiancheggiano la regione nasale e un terzo in linea con gli occhi che collega le due linee perpendicolarmente.
  4. Drill-down ventralmente al fine di separare il setto nasale dal tessuto circostante. Un percorso più ampio eviterà danni alla membrana mucosa tuttavia sarà anche rendere più difficile isolare la membrana. Si raccomanda un taglio stretto vicino al linea mediana.
  5. Usare le forbici per tagliare il setto libero da qualsiasi tessuto aderito ad essa e conservarla in una soluzione salina sterile. A questo punto l'innesto può essere pulito per rimuovere qualsiasi tessuto collegato. La situazione ideale è avere membrane mucose integre esposti su entrambi i lati del setto cartilagine. Uno grpoppiera può fornire membrana per due topi disponibile la superficie della membrana è sufficiente a coprire i siti craniotomia. Si raccomanda che l'innesto viene utilizzato il più rapidamente possibile e il ricercatore procede alla fase 3 non appena l'innesto è isolato.

3. Impianto chirurgico di innesto mucoso

  1. Utilizzo di procedure standard, asettiche murini chirurgici, anestetizzare e montare un topo nella cornice stereologica. Utilizzare circa il 2% isoflurano in ossigeno puro utilizzando una macchina di anestesia roditore.
  2. Immobilizzare il mouse in un apparato stereotassico con orecchio bar e un supporto naso. Applicare una pomata oftalmica per gli occhi e strofinare il cuoio capelluto con Betadine e il 75% di etanolo per tre turni. Utilizzando sia le forbici o un regolatore dei capelli, rimuovere il pelo sulla testa. Esporre il cranio con una lametta e livellare la testa. Eseguire una craniotomia sopra la posizione del cervello che verrà dosato. Per esempio, quando il targeting striato tagliare un 1,25 millimetridiametro del foro circolare nel cranio (centrato a AP: 1,00 mm, ML: 0,88 mm) utilizzando un martello pneumatico. Bagnare la zona forata con soluzione fisiologica sterile e utilizzare una lama di rasoio per rimuovere il cranio.
  3. Rimuovere con cautela la dura con la punta di un ago. Inoltre, questo può essere realizzato applicando una quantità minima di tessuto adesivo alla superficie durale umida. Una volta che questo strato è indurito, il movimento laterale con una punta lametta può essere usato per rimuovere la membrana.
  4. Posizionare la membrana mucosa al di sopra della superficie del cervello avendo cura estrema per mantenere il lato epiteliale rivolto lontano dalla ferita. Questo è fatto meglio trasferendo l'intero setto sulla superficie del cranio adiacente al sito craniotomia con le pinzette. Con la punta di un paio di forbici chirurgiche, tirare fuori la membrana della cartilagine e sulla superficie del cranio e cervello. Non lasciate che la membrana asciugare o toccare con qualsiasi materiale assorbente. L'innesto dovrebbe generosamente sovrapporsi tutti i bordi ossee del craniotomia site.
  5. Coprire l'innesto con un pezzo sterile di nitrile. Questo agisce per impedire l'adesione della pelle per l'innesto durante la guarigione. Il nitrile deve essere abbastanza grande da coprire l'intera membrana mucosa. Tagliare eccessivo membrana se necessario. Evitare qualsiasi movimento del nitrile una volta entrato in contatto con l'innesto.
  6. Chiudere la pelle con un running 5-0 sutura sterile e lasciare il mouse recuperare per 3-7 giorni prima di procedere alla fase successiva. Fare attenzione a non perturbare la barriera nitrile o l'innesto di mucosa durante la chiusura della pelle.

4. Amministrazione di dosaggio Soluzione

  1. Dopo aver assicurato il topo anestetizzato nel frame stereotassico, tagliare la sutura con le forbici e togliere la pelle in eccesso intorno al cranio.
  2. Rimuovere la barriera nitrile e pulire la superficie del cranio. Usare tamponi salini e cotone sterile per pulire la zona fino a quando l'innesto è visibile. Può essere necessario tagliare l'innesto con un rasoio se ha assunto dimensioni desired superficie.
  3. Se l'esperimento sarà più lungo di un paio di giorni, è saggio impiantare almeno due viti cranio a rafforzare l'impianto testa.
  4. Posizionare il ben sopra l'innesto in modo che i bordi sono in contatto con il cranio. Applicare l'adesivo cianoacrilato all'incrocio tra il bene e il cranio. Riempire il pozzetto con soluzione salina sterile e verificare che non vi siano perdite. Wells sono costituiti da aghi di siringa taglio.
  5. Applicare cemento osseo sul cranio per fissare il bene in posizione.
  6. Rimuovere la soluzione fisiologica dal pozzo con una pipetta. Lavare le ben diverse volte per verificare che l'adesivo non è trapelato trovi Aggiungi la soluzione desiderata; in questo caso viene utilizzato 50 ml di destrano fluorescente. Si prevede che i composti idrosolubili di una polarità simile si comportano come destrano. Consegna di composti idrofobi o sospensione non è stato esplorato con questo metodo.
  7. Chiudere la parte superiore del pozzo utilizzando un pezzo circolare di nitrile fissato altop con cianoacrilato. Controllare che l'adesivo non venga a contatto con il contenuto dei pozzetti.

5. Analisi dei Transmucosal consegna

  1. Dopo la quantità desiderata di tempo è passato, anestetizzare il mouse e scambiare il contenuto dei pozzetti con una soluzione di colorante blu di Evan. Questo colorante è utilizzato per verificare che l'innesto era intatto.
  2. Dopo 30 minuti, anestetizzare il mouse pesantemente, rimuovere la soluzione colorante, e eutanasia mediante decapitazione.
  3. Rimuovere manualmente l'impianto e rimuovere il cervello con le forbici chirurgiche. Fare attenzione a tenere l'innesto in posizione.
  4. Una volta rimosso, Flash-congelare il cervello in una soluzione di isobutano raffreddata in un bagno di ghiaccio secco.
  5. Incorporare il cervello in Ottimale taglio Temperatura soluzione (OCT) e la fetta a 50 micron.
  6. Collocare le fette desiderati direttamente su un vetrino da microscopio.
  7. Immagine della sezione utilizzando un microscopio a fluorescenza non appena la soluzione Ottobre è asciugato.

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Representative Results

Ottenere un grande abbastanza setto nasale espianto è fondamentale per le fasi successive. Questo può essere realizzato mediante foratura nella posizione sul cranio del topo donatore mostrato in Figura 1a. Tagliando lungo questo percorso produrrà un espianto di sufficiente dimensione come mostrato in Figura 1b. Se la profondità non è abbastanza profonda, l'innesto sarà troncata e sarà difficile ottenere una grande membrana sufficiente a coprire la superficie del cervello. Perforazione più lateralmente rispetto al percorso suggerito non è consigliato perché più tessuto rimarrà sul setto nasale, e il prossimo passo sarà più difficile. Prima del trasferimento della membrana mucosa, la superficie del setto deve essere pulito di tutti i tessuti connettivi eccesso. Una volta fatto questo, la membrana mucosa deve essere visibile sulla superficie della cartilagine. Figura 1c mostra ciò che il tessuto si presenta come dopo la pulizia.

Prima di trasferire il membrane, una craniotomia e durotomia necessario eseguire per esporre la superficie del cervello. Solo dopo l'emorragia post-durotomia ha fermato la membrana può essere trasferito. Figura 2a mostra ciò che il sito chirurgico dovrebbe essere simile prima di passare alla fase successiva. Trasferire la membrana mucosa dalla cartilagine sulla superficie cervello è il passo più tecnicamente impegnativo di tutta la procedura chirurgica e dovrebbe essere fatto attentamente. Se il setto raccolto è abbastanza grande, la superficie dell'innesto mucosa dovrebbe essere sufficiente a coprire la superficie del cervello. Una volta trasferita, l'area chirurgica dovrebbe apparire simile a quella in Figura 2b. È importante fare in modo che il lato della membrana che è in contatto con la cartilagine è la stessa che è in contatto con la superficie del cervello. Se la membrana viene capovolta o ripiegata su se stessa, deve essere eliminato e un altro deve essere usato. Una volta completato questo passaggio, il cuoio capelluto può essere suturatain modo che il mouse può recuperare e l'innesto può guarire. Al fine di prevenire eventuali reazioni avverse dell'innesto entrare in contatto con la superficie interna del cuoio capelluto, un pezzo di nitrile protettivo deve essere posto sopra al sito chirurgico. Come mostrato in figura 2c, il pezzo inserito dovrebbe essere sufficiente a coprire la membrana grande ma non abbastanza grande da impedire sutura della pelle chiuso.

Durante il periodo di recupero, tessuto sostanziale crescita verifica del periostio circostante che deve essere rimosso prima di somministrare la membrana. Dopo la riapertura del cuoio capelluto, tamponi di cotone sterile e soluzione salina dovranno essere utilizzato per pulire il sito finché sembra simile a quella di figura 3a. Non abbiamo osservato alcuna risposta immunitaria sostanziale; tuttavia questo non è stato confermato istologicamente. L'innesto può essere necessario tagliare con un rasoio se si è sviluppato attraverso la superficie del cranio. In questa fase il ben che conterrà la soluzione di dosaggiozione deve essere impiantato sopra l'innesto. Varie viti cranio possono essere messi dentro a questo punto se la stabilità meccanica a lungo termine dell'impianto è una preoccupazione. Assicurarsi che il pozzo viene posizionato in modo che non tocchi l'innesto. Una volta in posizione, cianoacrilato può essere applicato a colla al cranio. Per impedire che l'adesivo venga a contatto con l'innesto deve essere applicato alla superficie del pozzo e spinto verso il basso per chiudere l'apertura. Una volta che il pozzo è sicuro, dovrebbe essere riempito temporaneamente con soluzione salina per idratare sia l'innesto e controllare eventuali perdite. Il pozzo aderito dovrebbe apparire come in Figura 3b e il soluzione dovrebbe essere chiaro che indica che non contiene alcun adesivo. Eventuali perdite saranno evidenti, perché il livello del liquido nel pozzo cadrà. Se si riscontrano perdite hanno bisogno di essere fissato con più adesivo. Il pozzetto viene poi rinforzata con cemento osseo. A questo punto la soluzione fisiologica nel pozzo può essere rimosso con una pipetta esostituito con la soluzione di dosaggio desiderato. Quando copre il pozzo con un pezzo di assistenza nitrile; occorre controllare che l'adesivo non contatta la soluzione nel pozzo. Alla fine di tutta la procedura, la testa mouse dovrebbe apparire come in figura 3c. Il cemento osseo è leggermente traslucido quindi se i contenuti del pozzetto sono fotosensibili, colorante o inchiostro possono essere aggiunti alla superficie del cemento essiccato o alla miscela cemento per prevenire la fotodegradazione dei contenuti così.

Dopo il periodo di tempo desiderato di attesa, il cervello dovrebbe essere analizzato per scoprire gli effetti della somministrazione. Il cervello deve essere trattata in modo diverso a seconda di ciò che viene esaminata. Se lo scopo della procedura è quello di analizzare la presenza di qualsiasi sostanza chimica aggiunta al pozzo, (come descritto nella sezione del protocollo di cui sopra), allora è consigliabile fare un congelamento flash del cervello di conservare i composti somministrati. Figura 4 > Mostra un risultato rappresentativo di questo approccio. La somministrazione di un polimero fluorescente 40 kDa (tetramethyrhodamine destrano coniugato) per 24 ore mostra notevole diffusione nel tessuto cerebrale. I nostri precedenti risultati con destrano mostra la diffusione nel tessuto cerebrale è tempo e peso molecolare dipendente 18. Molecole più piccole diffondono nel parenchima cerebrale in misura maggiore di quelle più grandi, e una più grande dosaggio maggiore comporta una maggiore quantità di diffusione per tutti i pesi molecolari che abbiamo testato. Se congelamento flash è fatto è importante montare i vetrini dopo sezionamento e non esporle a qualsiasi soluzione. Qualsiasi liquido solubilizzare il composto somministrato e diffonderla attraverso la superficie della fetta cervello. Se immunoistochimica deve essere eseguito sul cervello, allora è consigliabile per perfusione il mouse per fissare il tessuto cerebrale.

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Figura 1. Immagini della procedura di raccolta setto nasale. A) La posizione del sito di perforazione sul cranio di un topo eutanasia. Le linee tratteggiate indicano il perimetro di forare. B) Il setto nasale subito dopo la rimozione chirurgica. C) Il setto nasale dopo la rimozione del tessuto in eccesso. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 2
Figura 2. Immagini chirurgici del processo engrafting. A) Il sito chirurgico dopo craniotomia e durotomia. L'immagine è rappresentativa di ciò che il cranio dovrebbe essere simile prima di mettere l'innesto su di essa. B) Posizionamento dell'innesto mucosa al sito craniotomia. La linea tratteggiata indica il perimetro del trapianto. L'immagine mostra la superficie desiderata dell'innesto. C) Impianto del nitrile barriera protettiva. La dimensione del materiale come mostrato è sufficiente a coprire l'innesto grande ma non abbastanza grande da interferire con sutura. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 3
Figura 3. Immagini chirurgiche del processo di dosaggio farmaco. A) Un esempio di ciò che l'innesto di mucosa guarito assomiglia a seguito rigorosa pulizia del sito chirurgico. B) Immagine di ben attaccato al cranio. L'interfaccia del cranio e ben è fissatocon cianoacrilato e il pozzo è riempito con soluzione salina sterile. Il livello della soluzione stabile indica perdite dal pozzo e la chiarezza della soluzione indica nessuna contaminazione della soluzione con adesivo. C) L'immagine della chirurgia completata. Il pozzo contiene la soluzione di dosaggio, ed è chiusa saldamente con una barriera nitrile. Cemento osseo è in atto per irrigidire l'impianto bene. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 4
Figura 4. Immagine al microscopio a fluorescenza di una fetta di cervello di topo seguente transmucosale dosaggio a 40 kDa tetramethylrhodamine destrano coniugato per 24 ore. La fetta è stata presa al bregma -1.06 mm con uno spessore di 501; m. L'innesto mucoso è visibile sulla superficie del cervello. Bar = 1 mm. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

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Discussion

Il passo più difficile della procedura qui descritta è la riuscita del trasferimento di una membrana mucosa adeguate dimensioni sulla superficie del cervello. Questo passaggio è notevolmente semplificata se il setto nasale raccolto è abbastanza grande e ben puliti. Se la parte ventrale del setto viene troncato, un nuovo innesto deve essere ottenuta. L'angolo di perforazione deve essere perpendicolare alla testa mouse per assicurare che la membrana mucosa non è danneggiato dal trapano. Se viene preso un percorso di perforazione quella raccomandata ampia sarà molto più difficile da rimuovere il tessuto supplementare che è collegato al setto. Tutti i grandi pezzi di tessuto connettivo devono essere rimossi con tagli a forbice tagliente, piuttosto che tentare di tirare sciolto. Piccoli pezzi di tessuto possono essere rimossi mediante raschiatura con le punte delle forbici disponibile il tessuto non è collegato alla membrana mucosa. Al termine del processo di pulizia, la superficie cartilaginea con la membrana ancora attaccato deve essere esposto. Occaprovvisoriamente la cartilagine settale può staccarsi dall'osso che è collegato sul bordo dorsale. Se questo accade è ancora possibile utilizzarlo nel passaggio successivo tuttavia è più difficile per due ragioni. L'osso è una comoda maniglia per tenere l'espianto durante la pulizia ed il loro trasferimento. Una volta rimosso, è più difficile manovrare il foglio di cartilagine più delicato. In secondo luogo, la giunzione cartilagine-osso è dove la membrana mucosa è più spessa e più facile da ottenere durante la rimozione dalla cartilagine. Se l'osso è separata dalla cartilagine questa porzione di membrana è perso.

Dopo l'innesto del setto è stata pulita e la craniotomia e durotomia sono stati effettuati, la membrana mucosa può essere posizionato sulla superficie cervello esposto. Questo si realizza meglio posizionando l'espianto adiacente al sito craniotomia. La membrana può essere estratta dalla cartilagine, sul cranio, e il cervello. Molte cose possono andare storte durante questo process. La membrana può seccare, ottenere strappato, piega su se stesso, o grappolo. Inoltre la membrana che ricopre l'altro lato del setto possono essere danneggiati da sfregamento contro il cranio. E 'anche possibile che nel tentativo di rimuovere il fronte al rialzo membrana mucosa, si toglie le membrane da entrambi i lati allo stesso tempo. Per evitare tutti questi problemi è fondamentale per spostare la membrana lentamente e sempre osservare entrambi i lati del setto. La strategia migliore è quella di utilizzare le punte delle forbici per rimuovere la membrana dal foglio di cartilagine prima di provare a scivolare fuori. Se una parte della membrana rimane attaccato, è possibile che l'elasticità del tessuto si ritrae dopo tirando su di esso. Utilizzando piccoli movimenti che tirano la membrana può essere staccato dal setto. Solo allora sarà facilmente scivolare via. La membrana è troppo sottile per poter essere maneggiato con pinzette; Può essere tirato solo da una superficie all'altra. Se viene capovolto o ripiegato su se stesso,deve essere scartata ed un'altra deve essere ottenuta.

Se l'innesto copre l'intera superficie del cervello esposto, il processo ha avuto successo e il cuoio capelluto può essere suturato in modo che il sito chirurgico può guarire. Una barriera nitrile deve essere messo in atto in modo che la pelle non venga a contatto con la membrana. Bisogna fare attenzione in modo che la pressione non viene esercitata sulla nitrile Durante la sutura altrimenti la posizione di innesto può muoversi. Inoltre, fare attenzione a non suturare in nitrile. Il modo migliore per assicurarsi che il materiale obbedisce è per mantenerlo umido con soluzione fisiologica e assicurarsi che rimanga piatta in tutta la sutura.

Una volta che l'innesto è guarita (3-7 giorni) il pozzo contenente la soluzione di dosaggio può essere attaccato al cranio sopra l'innesto. Può essere fissato temporaneamente al cranio con colla adesiva e permanentemente con cemento osseo. Una volta applicato il cemento osseo, non sarà possibile apportare eventuali correzioni al therefo posizione benre tutte ottimizzazione deve essere fatto prima della sua applicazione. Una volta che il pozzo è in posizione e tenuto in posizione con cianoacrilato, dovrebbe essere riempito con soluzione fisiologica sterile. Se la procedura è stata eseguita con successo il livello del liquido non cambia e la soluzione sarà limpida. Se c'è una perdita, il livello scende e la posizione dove l'acqua fuoriuscito deve essere visibile. Dopo l'applicazione più adesivo sul sito fuga, più salina deve essere aggiunto per verificare la perdita è stata sigillata. Se l'adesivo contamina bene la soluzione, una pellicola traslucida sarà visibile nella parte superiore del livello del liquido. In questo caso il bene dovrebbe essere lavato più volte con soluzione fisiologica fino a quando la soluzione è limpida. Inoltre, uno scambio di cotone può essere usato per rimuovere la pellicola toccandolo la superficie della soluzione. Solo quando la soluzione è stabile e ben chiaro deve essere applicato il cemento. Quando il cemento è asciutto, la soluzione fisiologica dal bene può essere rimosso e sostituito con la soluzione di dosaggio. Si deve prestare attenzione anon danneggiare la membrana durante la dispensazione in e fuori dal pozzo. Una volta riempito, il bordo del pozzetto deve essere sigillato con un pezzo di nitrile con cianoacrilato. E 'importante che lo spazio vuoto tra la superficie della soluzione e la parte superiore del pozzo. Questo farà sì che l'adesivo non tocchi la soluzione quando indossare la barriera nitrile.

Una volta che è il momento di analizzare l'effetto della procedura di dosaggio, il cervello deve essere rimosso e ripreso. Se immunoistochimica deve essere eseguito, perfusione e anticorpo standard di colorazione può essere fatto. Se la posizione del composto dosato è determinato, si raccomanda di lampeggiare congelare il cervello in una soluzione di ghiaccio / isobutano secco. Questo farà sì che la posizione del composto nelle fette di cervello è lo stesso che è stato immediatamente prima eutanasia.

Il protocollo qui descritto descrive un metodo per indagare la somministrazione di farmaci al cervello mouse attraverso un chirurgicamenteinnestati membrana mucosa semipermeabile 18. Questo è analogo per l'esito della transnasal tumore rimozione chirurgica negli esseri umani in cui i difetti della base cranica sono riparati con una vascolarizzato membrana mucosa nasale 19,20. Utilizzando questo modello di topo, è ora possibile studiare come questi innesti mucosi sono in grado di bypassare la BBB e consentendo peso molecolare consegna diretta elevati del farmaco al cervello. Ora abbiamo eseguito questa procedura più di 100 volte. Fondamentale per questa procedura è la raccolta di successo di un innesto del setto nasale da un topo donatore e il trasferimento della membrana mucosa dal innestare il mouse prova. Questa procedura, per la prima volta, consente la prova preclinica di terapie ad alto peso molecolare per una varietà di disturbi neurologici e psichiatrici.

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Disclosures

Benjamin S. Bleier MD è inventore di piombo di metodi di copertura brevettuale provvisori di somministrazione di farmaci per il sistema nervoso centrale.

Acknowledgments

Questo studio è stato finanziato dalla Fondazione Mcihael J. Fox per la ricerca 2011 Rapid Response Innovations di Parkinson Awards Program. I finanziatori hanno avuto alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mice Taconic C57BL/6
Isoflurane Piramal Healthcare
Student fine scissors Fine Science Tools 91461-11
Pneumatic drill MTI Dental 333-CB
Drill bit
Forceps Fine Science Tools 91106-12
0.9% Sodium chloride injection USP Abbott Laboratories 4925
Polystyrene Petri dish Fisher 08-757-12 for temporarily storing graft
Bead sterilizer Fine Science Tools 18000-45
Oxygen/Isoflurane System SurgiVet V720100
Temperature Control System Physitemp TCAT-2LV
Small animal stereotaxic instrument KOPF Model 940
Eye ointment
Electric shaver
Cotton-tipped applicators Fisher 23-400-106
7.5% Providone iodine Betadine surgical scrub
70% Ethanol
Surgical blade stainless Feather 2976#10
Scalpel handle - #3 Fine Science Tools 10003-12
3% Hydogen peroxide for cleaning the skull
Vetbond tissue adhesive 3M 1469SB
Needles Becton, Dickinson and Company 305176 needle tip cut off and used as well
Syringes Becton, Dickinson and Company 309597
Nitrile gloves Denville Scientific Inc G4162 for well closure and protection of graft
5-0 Nylon suture thread
Student Halsey needle holder Fine Science Tools 91201-13
Cyanoacrylate adhesive commecially available super glue
Dental cement kit, 1 lb, pink opaque Stoelting 51458
Isobutane (2-methylbutane) Aldrich M32631 for dry ice bath
Dry ice

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cardoso, F. L., et al. Looking at the blood-brain barrier: Molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Res. Rev. 64, 328-363 (2010).
  2. Pardridge, W. M. Drug transport across the blood-brain barrier. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32, 1959-1972 (2012).
  3. Chen, Y., Liu, L. Modern methods for delivery of drugs across the blood-brain barrier. Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 640-665 (2012).
  4. Cheng, F. -C., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor protects against 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)-induced neurotoxicity in C57BL/6 mice. Neurosci. Lett. 252, 87-90 (1998).
  5. Grondin, R., et al. controlled GDNF infusion promotes structural and functional recovery in advanced parkinsonian monkeys. Brain. 125, 2191-2201 (2002).
  6. Kirik, D., et al. Localized striatal delivery of GDNF as a treatment for Parkinson disease. Nat. Neurosci. 7, 105-110 (2004).
  7. Pardridge, W. M. Drug and gene targeting to the brain with molecular trojan horses. Nat. Rev. Drug Discov. 1, 131-139 (2002).
  8. Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery of protein and non-viral gene therapeutics with molecular Trojan horses. J. Control. Release. 122, 345-348 (2007).
  9. Bellavance, M. -A., et al. Recent advances in blood-brain barrier disruption as a CNS delivery strategy. AAPS J. 10, 166-177 (2008).
  10. Merkus, F. H. M., Berg, M. Can nasal drug delivery bypass the blood-brain barrier. Drugs R. D. 8, 133-144 (2007).
  11. Dhuria, S. V., et al. Intranasal delivery to the central nervous system: Mechanisms and experimental considerations. J. Pharm. Sci. 99, 1654-1673 (2010).
  12. Illum, L. Nasal drug delivery-possibilities, problems and solutions. J. Control. Release. 87, 187-198 (2003).
  13. Craft, S., et al. Intranasal insulin therapy for alzheimer disease and amnestic mild cognitive impairment: A pilot clinical trial. Arch. Neurol. 69, 29-38 (2012).
  14. Freiherr, J., et al. Intranasal insulin as a treatment for Alzheimer's Disease: A review of basic research and clinical evidence. CNS Drugs. 27, 505-514 (2013).
  15. Gill, S. S., et al. Direct brain infusion of glial cell line-derived neurotrophic factor in Parkinson disease. Nat. Med. 9, 589-595 (2003).
  16. Love, S., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor induces neuronal sprouting in human brain. Nat. Med. 11, 703-704 (2005).
  17. Antunes, M. B., et al. Murine nasal septa for respiratory epithelial air-liquid interface cultures. BioTechniques. 43, 195-204 (2007).
  18. Bleier, B. S., et al. Permeabilization of the blood-brain barrier via mucosal engrafting: implications for drug delivery to the brain. PLoS ONE. 8, (2013).
  19. Bernal-Sprekelsen, M., et al. Closure of cerebrospinal fluid leaks prevents ascending bacterial meningitis. Rhinology. 43, 277-281 (2005).
  20. Bleier, B. S., et al. Laser-assisted cerebrospinal fluid leak repair: An animal model to test feasibility. Otolaryngol. Head Neck Surg. 137, 810-814 (2007).

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