Farelerde Beyin Doğrudan İlaç Teslim heterotopik mukozal aşılanması Prosedürü

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

İnsan endoskopik kafa tabanı yeniden fare modeli nazal mukozal greft kullanılarak beyin ve burun arasındaki yarı geçirgen bir arayüz oluşturur geliştirilmiştir. Bu yöntem, araştırmacılar, sistemik olarak uygulandığında, aksi takdirde, kan-beyin bariyeri tarafından hariçtir yüksek moleküler ağırlıklı terapötik maddelerin merkezi sinir sistemi teslim çalışma sağlar.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Kohman, R. E., Han, X., Bleier, B. S. Heterotopic Mucosal Engrafting Procedure for Direct Drug Delivery to the Brain in Mice. J. Vis. Exp. (89), e51452, doi:10.3791/51452 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Beyne terapötiklerin teslim kan dolaşımına ve beyin dokusu içine polar ve yüksek moleküler ağırlıklı bileşiklerin geçişini sınırlayan kan-beyin bariyeri (BBB) ​​varlığı ile engellenmektedir. İnsanlarda bazı doğrudan dağıtım başarı transkranial kateter implantasyonu yoluyla elde edilmiştir; ancak bu yöntem son derece invaziv ve çok sayıda komplikasyonlar ile ilişkilidir. Daha az invaziv bir alternatif örneğin insanlarda endoskopik transnazal tümör çıkarma ameliyatı sonrasında kafa tabanı hasarlarını tamir etmek için kullanılan burun mukozası gibi ameliyatla takılan bir, yan geçirgen bir zar ile beyin doz olacaktır. Olsa ilaç transfer bu zar etkili BBB bypass ve beyin ve omurilik sıvısına doğrudan dağılırdı. Bu yaklaşım esinlenen, farelerde bir cerrahi yaklaşım Ekstrakranial cerrahi BBB defekti üzerinde engrafted bir donör septal mukoza zarı kullandığı geliştirilmiştir. Bu model, etkili bir şekilde gösterilmiştirbeyne yüksek molekül ağırlıklı bileşiklerin geçişine izin verir. Çok sayıda ilaç adayları BBB geçen aciz olduğundan, bu model nörolojik ve psikiyatrik hastalıklar için yeni tedavilerin klinik öncesi testler gerçekleştirmek için değerlidir.

Introduction

Nörolojik ve psikiyatrik hastalıkların tedavisi ciddi bir şekilde, merkezi sinir sistemi 1-3 ulaşan tüm olası farmasötik maddelerin% 95 in üzerinde önler, kan-beyin bariyeri (BBB) ​​varlığı ile engellenmektedir. Örneğin, Glial nörotrofik faktör (GDNF) türetilmiş bu BBB 4-6 nüfuz edemez, çünkü sistemik olarak verilen, ancak etkisiz olan, beyin içine doğrudan enjekte edildiğinde, Parkinson hastalığının tedavisi için etkili olduğu gösterilmiştir.

Çok sayıda yaklaştı, bu sorunu aşmak için denemek için geliştirilmiştir. Neurotheraputics sistemik teslim İyileştirme beyin kılcal endotel üzerinde bulunan taşıyıcı proteinlerin seçici antikorları içeren ilaç konjugatlarını kullanılarak kanıtlanmıştır; Bununla birlikte, bu yöntem, farmasötik 7,8 geniş bir yelpazesi için geçerli olduğu gösterilmiştir edilmemiştir. Ayrıca, BBB ozmotik açılış kliniği kullanılır olmuşturilgi 9 beyin bölgesi için daha doğrudan teslim aksine müttefiki, ancak bu yöntem, sistemik ilaç doz muzdarip. Önemli çaba doğrudan beyni 10-12 hedefleme umuduyla transnasal teslim optimize girmiştir. Bazı başarılar elde edilmiş olmasına rağmen, kesin sonuçlar sadece Ensülin 13,14 gibi endojen reseptörleri sahip ilaçlar için elde edilmiştir. Ayrıca Transnazal teslim mekanizması koku nöron alımı yoluyla ya da kan dolaşımı 11 üzerinden beyne dolaylı giriş düşündüren kanıtlar tartışmalı olmuştur. Implante kateterler kullanılarak doğrudan, transkranial teslim ancak bu işlem oldukça invaziv ve çok sayıda komplikasyonlar 15,16 ile ilişkili olduğunu elde edilmiştir. Bugüne kadar, beyin içine, yüksek molekül ağırlıklı bileşiklerin sunmak için genel bir minimal invaziv bir yöntem yoktur.

Bir murin cerrahi işlem olup, burada sunulanbu beyin yarı-geçirgen bir arayüz oluşturur. Bu, bir fare, bir cerrahi kranyotomi kusur boyunca Mukozal zarı eksplant 17 aşılanması ile gerçekleştirilir. Bu prosedür kullanılarak, 500 kDa kadar çözünür bileşikler, bir zaman ve molekül ağırlığı 18 bağlı bir şekilde her ikisi de merkezi sinir sistemi (direkt olarak beyin dokusu içine yanı sıra, beyin-omurilik sıvısına) içine teslim edilebilir gösterilmiştir. BBB atlayarak Bu yöntem transnazal endoskopik cerrahi 19,20 aşağıdaki kafatasında delik onarmak için vaskülarize mukozal greftler kullanan insanlarda kafa tabanı defekt onarım için bir modeldir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ameliyat öncesi yapılması gereken tüm prosedürleri IACUC ve herhangi bir ek etik ya da yasal yetkililerin tarafından onaylanmış ve insancıl hayvan tedavi uygulamalarını kullanmak emin olun. Bu, steril cerrahi koşullar kullanarak IACUC onaylı yöntem kullanarak fare anestezi, ameliyat sırasında veteriner merhem ile fareler gözleri yağlama ve cerrahi sonrası bakım sağlayan içerir. Prosedürün yönleri onaylanmış olup olmadığını herhangi bir soru varsa cerrahi ile devam etmeyin. Burada gerçekleştirilen tüm işlemler Boston Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.

1.. Hayvanlarının Hazırlanması ve Cerrahi Malzemeleri

  1. Ameliyat sırasında kullanılacak olan tüm cerrahi alet otoklavlayın.
  2. Yapılacak olan tüm teknikleri hayvan düzenleyici kurumlar tarafından onaylanan emin olun.

Mukozal Greft 2. Hasat

  1. Gibi benzer yaştaki bir genetik özdeş fare seçtideneysel fare ve (burada: servikal dislokasyon izofluran boğulma) IACUC onaylı yönteminde euthanize.
  2. Cerrahi makas kullanarak, kafatası açığa fare baş burun çevresinde cilt kaldırmak.
  3. Yanal burun bölgesini ve dik iki satır bağlayan gözlerle doğrultusunda üçüncü bir kanadını iki üç satır ile bir havalı matkap, işareti.
  4. Çevreleyen dokudan burun septum ayırmak için ventral detaya. Daha geniş bir yol ancak o da daha zor zar izole yapacak mukozal membran zarar görmesini engelleyecektir. Yakın orta hatta dar bir kesim tavsiye edilir.
  5. Buna yapışık bir dokudan serbest septum kesilmiş ve bir steril tuz çözeltisi içinde depolamak için makas kullanın. Bu anda greft herhangi bir bağlı doku kaldırmak kadar temizlenebilir. İdeal durum, hasarsız mukozal zarlar kıkırdak septum her iki yüzünde de sahip olmaktır. Bir grarka membran yüzey alanı, kraniyotomi siteleri karşılamak için yeterli olması şartıyla, iki fare için membran temin edebilir. Bu, mümkün olduğunca hızlı bir aşı olarak kullanılan ve araştırmacı en kısa sürede aşı izole edilir olarak 3 aşamasına ilerlemektedir önerilir.

Mukozal Greft 3. Cerrahi İmplantasyonu

  1. Standart, aseptik kemirgen cerrahi prosedürleri kullanılarak, uyutmak ve Stereolojik çerçeve içinde bir fare monte. Bir kemirgen anestezi makinesi kullanılarak saf oksijen yaklaşık% 2 izofluran kullanın.
  2. Kulak çubukları ve bir sivri tutucu ile bir stereotaksik cihazında fare hareketsiz. Gözleri oftalmik merhem sürün ve üç tur için Betadin ve% 75 etanol ile kafa derisi fırçalayın. Makas veya saç düzeltici kullanarak, kafasına kürk çıkarın. Bir jilet ile kafatası maruz ve kafa seviyesi. Dozlanacaktır beyin mahallinin üzerindeki bir kranyotomi gerçekleştirin. Örneğin, striatum hedeflerken bir 1.25 mm kesilmişpnömatik bir matkap kullanarak:;: (0.88 mm ML 1.00 mm AP merkezli) kafatası çaplı dairesel delik. Steril serum fizyolojik ile delinmiş bölgeyi ıslatın ve kafatası kaldırmak için bir jilet kullanın.
  3. Dikkatli bir iğne ucu kullanılarak dura kaldırın. Ayrıca, bu nemli dural yüzeyine doku yapıştırıcı en az bir miktarda uygulanarak gerçekleştirilebilir. Bu tabaka, sertleştikten sonra, bir traş makinesi bıçak ucu ile yanal hareket membran kaldırmak için kullanılabilir.
  4. , Yaradan uzakta bakan epitelyal yan tutmak için çok dikkat çekici beyin yüzeyi üzerinde mukoza zarı yerleştirin. Bu en iyi cımbız ile kranyotomi yerine bitişik kafatasının yüzeyine üzerindeki tüm septum aktarılmasıyla yapılır. Cerrahi makas bir çift ucu kullanarak, kıkırdak kapalı ve kafatası ve beyin yüzeyi üzerine bir membran çekin. Membran kurur ya da herhangi bir emici malzeme ile temas etmesine izin vermeyin. Greft cömertçe kraniotomi s tüm kemik kenarları üst üste gelmelidirite.
  5. Nitril steril bir parça ile greft örtün. Bu, iyileşme sırasında greft için derinin yapışmasını önlemek için hareket eder. Nitril, tüm mukozal membranı karşılamak için yeterince büyük olması gerekir. Gerekirse aşırı membran kesin. Bu greft temas sonra nitrilin bir hareket kaçının.
  6. Bir çalışan 5-0 steril dikiş ile cilt kapatın ve fare bir sonraki adıma geçmeden önce 3-7 gün boyunca kurtarmak edelim. Cilt kapatılması sırasında nitril bariyer veya mukozal greft perturb özen gösterin.

Doz Çözüm 4. İdaresi

  1. Stereotaktik çerçeve içinde anestezi fare güvence sonra, makasla dikiş kesilmiş ve kafatası çevresinde aşırı cilt kaldırmak.
  2. Nitril engel çıkarmak ve kafatasının yüzeyini temizlemek. Greft görünür oluncaya kadar bölgeyi temizlemek için steril tuzlu ve pamuklu çubuk kullanmayın. D den daha büyük bir artış gösterdi, bu bir jilet ile greft kesmek için gerekli olabiliryüzey alanı esired.
  3. Deney bir kaç gün daha uzun olacaksa, o kafa implant güçlendirmek için en az iki kafatası vidayı implant akıllıca olacaktır.
  4. Kenarları kafatası ile temas halinde olan, böylece greft üzerinde de yer verilmiştir. Kuyu ve kafatası arasındaki kavşakta cyanoacrylate yapıştırıcı uygulayın. Steril serum fizyolojik ile iyi doldurmak ve emin sızıntı olmadığından emin olmak için kontrol edin. Wells kesim şırınga iğneleri yapılır.
  5. Yerine kuyu sabitlemek için kafatası kemik çimentosu uygulayın.
  6. Bir pipet ile kuyudan tuzlu çıkarın. Bu yapıştırıcı istenilen çözüm ekleyin içeri sızdırılmış değil doğrulamak için de birkaç kez yıkayın; Bu durumda floresan dekstran 50 ul kullanılmıştır. Bu, benzer bir polariteye sahip suda çözünür bileşikleri, dekstran gibi aynı şekilde davranır beklenmektedir. Hidrofobik bileşiklerin ya da süspansiyonlar Gönderme Bu yöntemle incelenmiştir edilmemiştir.
  7. Sabitlenen nitrilin dairesel parça ile kuyunun üst kapaksiyanoakrilat yapıştırıcı kullanılarak üst. Yapışkan de içeriği ile temas etmediğinden emin olun.

Transmukozal Teslim 5. Analizi

  1. İstenen zaman süre geçtikten sonra fare anestezi ve Evan mavi bir boya çözeltisi ile de içeriği değişimi. Bu boya, aşı sağlam olduğunu doğrulamak için kullanılır.
  2. 30 dakika sonra, ağır fare uyutmak boya çözüm kaldırmak ve decapitation yoluyla euthanize.
  3. Elle implantı çıkarın ve cerrahi makas kullanarak beyin kaldırmak. Yerinde greft tutmak için dikkatli olun.
  4. Bir kez çıkarıldı, flaş dondurma izobütan çözeltisi içinde beyin kuru bir buz banyosu içinde soğutuldu.
  5. Optimal Kesme Sıcaklık 50 um de (OCT) çözeltisi ve dilim içinde beyin gömün.
  6. Bir mikroskop lamı üzerinde doğrudan istenen dilimleri yerleştirin.
  7. Görüntü kısa sürede Ekim çözüm kuruduktan gibi bir açma mikroskop kullanılarak dilim.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Yeterince büyük bir nazal septum eksplant elde sonraki adımları için çok önemlidir. Bu, Şekil 1a'da gösterilen verici fare kafatasında bir yerde sondaj ile gerçekleştirilebilir. Şekil 1b de gösterildiği gibi, bu yol boyunca kesme yeterli büyüklükte bir eksplant üretecektir. Sondaj derinliği yeterince derin değilse, greft kesilmiş olacak ve beyin yüzeyini kaplamak için yeterince büyük bir zar elde etmek zor olacaktır. Daha fazla doku nazal septum üzerinde kalacaktır çünkü önerilen yol tavsiye edilmez daha fazla yanal sondaj, ve bir sonraki adım daha zor olacaktır. Önceki mukoza zarının transferine, septumun yüzey tüm fazla bağ dokusunun temizlenmesi gerekmektedir. Bu yapıldıktan sonra, mukoza zarı kıkırdak yüzeyinde görünür olması gerekir. 1c doku temizlendikten sonra nasıl göründüğünü göstermektedir.

Önceki memb aktarılmasırane, bir kraniotomi ve durotomy beyin yüzeyinin açığa çıkarılması için yapılması gerekir. Post-durotomy kanama durduktan sonra membran transfer edilebilir. Şekil 2a cerrahi alan bir sonraki adıma geçmeden önce ne gibi görünmelidir gösterir. Beyin yüzeyine kıkırdak mukoza zarı aktarılması tüm cerrahi prosedür teknik olarak en zorlu adım olduğunu ve dikkatli yapılmalıdır. Hasat septum yeterince büyükse, mukoza greft yüzey alanı beyin yüzeyini kapsayacak kadar büyük olmalıdır. Bir kez transfer, cerrahi alan Şekil 2b'de edilene benzer olmalıdır. Bu kıkırdak ile temas halinde olan zarın yan beyin yüzeyi ile temas halinde olan bir aynı olduğundan emin olmak için önemlidir. Zar katlanabilir ya da kendi üzerine katlanmış alırsa, atılmalıdır ve başka bir kullanılmalıdır. Bu adım tamamlandıktan sonra, kafa derisi dikilerek edilebilirfare kurtarabilirsiniz ve greft iyileşmek böylece. Kafa derisi iç yüzeyi ile temas halinde olan greft kaynaklanan herhangi bir yan reaksiyonları önlemek için, koruyucu bir nitril bir parça cerrahi bölgeye yukarıda yerleştirilmelidir. Şekil 2c'de gösterildiği gibi, eklenen parça membran karşılamak için yeterince büyük, ancak deri kapalı dikiş önlemek için yeterince geniş olmamalıdır.

Iyileşme süresi boyunca, in-büyümenin önemli doku membranı dozlama öncesinde kaldırılacak olan çevreleyen periost oluşur. Kafa derisi yeniden açtıktan sonra, steril pamuklu ve tuzlu çözümü Şekil 3a benzer görünüyor kadar siteyi temizlemek için kullanılan gerekir. Herhangi bir önemli bir bağışıklık tepkisi gözlenmemiştir var; ancak bu histolojik olarak teyit edilmemiştir. Greft bu kafatası yüzeyi boyunca büyümüştür, bir tıraş bıçağı ile kesilecek gerekebilir. Bu aşamada, dozlama Solu içerecek iyition greft üzerinde yerleştirilmiş olmalıdır. Implantın uzun süreli mekanik stabilite bir endişe ise birkaç kafatası vidalar bu aşamada konabilir. Bu greft değmeyecek şekilde iyi yerleştirildiğinden emin olun. Bir kez yerine, siyanoakrilat yapıştırıcı kafatasına tutkal uygulanabilir. Bu kuyu yüzeyine uygulanır ve boşluğu kapatmak için aşağıya doğru itilmesi gerekir greft ile temas yapışkanı önlemek. Iyi inince, her iki hidrat için tuzlu su greft ile geçici dolu ve sızıntı olup olmadığını kontrol edilmelidir. Yapıştırılır iyi Şekil 3b böyle bakmak gerekir ve çözüm herhangi bir yapıştırıcı ihtiva etmediğini gösteren açık olmalıdır. Tüpün içindeki sıvı seviyesi düşer, çünkü herhangi bir sızıntı açık olacaktır. Sızıntı bulunursa daha yapıştırıcı ile sabit olması gerekir. Iyi o zaman kemik çimentosu ile takviye edilmiştir. Bu noktada kuyuda tuzlu bir pipet ile çıkarıldı ve alınabilir, arzu edilen dozlama solüsyonu ile değiştirildi. Nitril bakım bir parça ile kuyu kapsayan zaman emin yapıştırıcı içindeki çözelti temas etmez olmak için dikkat edilmelidir. Tüm prosedürün sonunda, fare kafa Şekil 3c gibi görünmelidir. Kuyunun içeriği ışığa duyarlı, boya ya da mürekkep iyi içeriğinin fotodegradasyonu önlemek için kuru çimentonun yüzeyine ya da çimento karışımına ilave edilebilir ise kemik çimentosu olup, bu nedenle biraz şeffaf.

Bekleme İstenen zaman süresinden sonra, beyin doz etkisini bulmak için analiz edilmelidir. Beyin muayene ediliyor ne bağlı olarak farklı tedavi edilmelidir. Prosedürün amacı oyuğuna ilave herhangi bir kimyasal (örneğin, yukarıdaki protokol bölümünde tarif edildiği gibi) varlığını analiz etmek ise, o zaman tatbik bileşikleri korumak için beynin bir flaş dondurma yapılması önerilir. Şekil 4 > Bu yaklaşımı kullanarak temsili bir sonuç göstermektedir. 24 saat süre ile bir 40 kDa floresan polimer (tetramethyrhodamine konjuge dekstran) ile dozaj beyin dokusuna fark difüzyon. Beyin dokusu içine dekstran gösteri difüzyon ile önceki sonuçları 18 saati ve molekül ağırlığı hem de bağlıdır. Küçük moleküller, büyük olanlara göre daha büyük bir ölçüde beyin parankiması içine girer, ve test edilen tüm molekül ağırlıkları için, difüzyon daha büyük bir miktarda daha büyük bir dozlama süresi ile sonuçlanır. Flaş dondurma yapılırsa kesit sonra slaytlar mount ve herhangi bir çözüm onları maruz önemlidir. Herhangi bir sıvı tatbik edilen bileşiğin çözündürülmesi ve beyin dilimin yüzey alanı arasında da yayacaktır. Immünohistokimya beyin üzerinde yapılacak ise, o zaman beyin dokusu düzeltmek için fare serpmek için tavsiye edilir.

iles/ftp_upload/51452/51452fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51452/51452fig1.jpg "/>
Şekil 1. Nazal septum hasat prosedürü Görüntüler. A) Bir ötenazi fare kafatası delme sitenin konumu. Noktalı çizgiler, doğrudan aşırı doku çıkarıldıktan sonra cerrahi çıkarılması. C) nazal septum sonra. B) nazal septum inebilecek çevresini gösterir. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Şekil 2,
Şekil 2,. Aşılanması işleminin cerrahi görüntüler. A) Kraniotomi ve durotomy aşağıdaki cerrahi sitesi. Görüntü kafatası önce onun üzerine greft yerleştirerek ne gibi görünmelidir temsiliKraniotomi siteye mukoza grefti. B) Yerleştirme. Noktalı çizgi, greft çevre gösterir. Görüntü koruyucu nitril bariyerin greft. C) İmplantasyon için istenen yüzey alanı gösterir. Gösterildiği gibi malzemenin boyutu greft kaplayacak kadar büyük ama dikilmesi ile müdahale için yeterince büyük değil. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Şekil 3,
Şekil 3,. Ilaç dozlama işleminin cerrahi görüntüler. Iyileşmiş mukozal greft cerrahi sitesinde de kafatasına bağlı bir. B) Görüntü titiz temizlik aşağıdaki gibi göründüğünü A) bir örnek. De kafatası ve arayüz sabitlenmiştirsiyanoakrilat yapıştırıcı ve iyi steril tuzlu su ile doldurulur ile. Stabil çözelti seviyesi kuyudan herhangi bir sızıntı gösteren ve Çözeltinin saydamlığına yapışkan. ° C) Tamamlanmış cerrahi görüntü ile çözeltinin hiçbir kirlenme gösterir. De dozlama solüsyonu içerir ve güvenli bir şekilde nitril bariyer ile sınırlıdır. Kemik çimentosu iyi implantı kıpırdamaz için yerinde olduğunu. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Şekil 4,
Şekil 4,., 24 saat boyunca 40 kDa tetrametilrodamin konjüge edilmiş dekstran ile transmukozal uygulamayı takiben, bir fare beyin dilim floresan mikroskop görüntüsü. 50 dilim kalınlığında -1,06 mm bregma alındı1, m. Mukozal aşı beyin yüzeyinde görülebilir. Bar = 1 mm. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada tarif edilen prosedüre en zor adım beyin yüzeyi üzerine yeterli büyüklükte bir mukoza zarının başarılı transferidir. Hasat burun septum yeterince büyük ve iyi temizlenmiş ise bu adım önemli ölçüde daha kolay yapılır. Septum ventral kısmı kesilirse, yeni bir greft elde edilmelidir. Delme açısı mukozal membran matkap tarafından zarar görmediğinden emin olmak için fare kafasına dik olmalıdır. Daha geniş bir tavsiye daha sondaj yol alınırsa bu septum bağlı olduğu ekstra doku kaldırmak için çok daha zor olacaktır. Bağ dokusunun herhangi bir büyük parçalar oldukça gevşek onları çekmeye çalışırken daha keskin makas darbeleri ile çıkarılmalıdır. Doku küçük parçaları doku mukozal zara bağlı değildir Resim makas uçları ile kazınarak çıkarılabilir. Temizleme işleminin sonunda, hala bağlı membran ile kıkırdak yüzeyi maruz kalmış olmalıdır. Occamakla birlikte yer septal kıkırdak dorsal kenarına bağlı olan kemikten ayrılmış olabilir. Bu, bir sonraki adımda kullanmak mümkündür ancak bu durumda iki nedenden dolayı daha da zordur. Kemik temizlik ve aktarırken eksplant tutmak için uygun bir kolu olduğunu. Bir kez kaldırıldı, o daha hassas kıkırdak Ön manevra zordur. Mukozal membran kıkırdak çıkarırken elde etmek için kalın ve kolay olduğu İkincisi, kıkırdak-kemik kavşak noktasıdır. Kemik, kıkırdak koparılır ise membranın bu kısmı kaybolur.

Septal greft temizlenmiş ve kraniyotomi ve durotomy gerçekleştirilmiştir sonra, mukoza zarı maruz beyin yüzeyi üzerine yerleştirilebilir. Bu en iyi kranyotomi yerine bitişik eksplant konumlandırılmasıyla gerçekleştirilir. Zar daha sonra kafatası üzerine, kıkırdaktan çekti ve beyin üzerinden edilebilir. Birçok şey, bu süreç sırasında yanlış gidebilirs. Membran kurur paramparça olsun, kendisi üstüne veya demet yukarı katlayın. Ayrıca septum diğer tarafını kaplayan zar kafatası sürtünmekten zarar alabilirsiniz. Bu, yukarı doğru bakacak şekilde mukozal membran kaldırmak için çalışırken, tek bir aynı anda her iki taraftan zarları bertaraf etmesi de mümkündür. Tüm bu sorunların önlenmesi için, bu septum her iki tarafını gözlemlemek yavaş yavaş ve her membran taşımak için çok önemlidir. En iyi strateji, bunu kapalı slayt denemeden önce kıkırdak tabakadan zarı çıkarmak için makas ipuçlarını kullanmaktır. Zar herhangi bir bölümü bağlı kalır, bu doku elastikiyeti üzerinde çekerek sonra geri çekilir mümkündür. Küçük, asılarak hareketlerini kullanarak zar septumdan sökülebilmektedir. Sadece o zaman kolayca kaydırarak olacaktır. Membran cımbız ile ele alınması mümkün çok ince; sadece tek bir yüzeyden diğerine çekilebilir. Kendisi üzerinde devrildiğinde veya katlanmış alırsa, buatılmalıdır ve başka bir alınmalıdır.

Greft maruz kalan beynin tamamını kapsıyorsa, işlem başarılı oldu ve cerrahi alan iyileşmek böylece kafa derisi sütüre edilebilir. Cilt zarı ile temas etmeyecek şekilde bir nitril bariyer yerine koymak gerekir. Bakım, aksi aşı mevki hareket edebilir dikilmesi bu yüzden bu basınç nitril üzerine uygulanan değildir alınmalıdır. Ayrıca nitril içine dikmek için özen. Emin malzeme itaat yapmak için en iyi yolu, tuzlu su çözeltisi ile nemli tutmak ve emin sütür boyunca düz kalır yapmaktır.

Greft (3-7 gün) iyileştikten sonra iyi dozlama çözeltisi içeren aşı yukarıdaki kafatasına tutturulabilir. Bu yapışkan yapıştırıcı ile kafatasına geçici olarak sabit ve kalıcı olarak kemik çimentosu ile olabilir. Kemik çimentosu uygulandıktan sonra, bu iyi pozisyon therefo için herhangi bir düzeltme yapmak mümkün olmayacaktırYeniden tüm optimizasyon önce kendi uygulama yapılmalıdır. Iyi konumu ve siyanoakrilat yapıştırıcı madde ile yerinde tutulur Bir kez, steril tuzlu su ile doldurulmalıdır. Yordamı başarıyla yapıldığını ise sıvı seviyesi değişmez ve çözüm açık olacak. Bir sızıntı varsa, seviyesi düşecek ve su kaçan nerede konumu görünür olmalıdır. Sızıntı sitede daha fazla yapıştırıcı madde uygulandıktan sonra, daha tuzlu sızıntı sızdırmaz kılınmış doğrulamak için eklenmelidir. Yapışkan, iyi bir çözüm karışması durumunda, bir yarı saydam film, sıvı seviyesinin üstünde görülebilir. Eğer bu olursa, çözelti berrak olana kadar de tuzlu su ile bir kaç kez yıkanmıştır olmalıdır. Buna ek olarak, bir pamuk takas sıvı yüzeyine dokunarak film kaldırmak için kullanılabilir. Iyi çözüm kararlı ve net olduğunda çimento uygulanmalıdır. Çimento kuruduğunda, kuyudan tuzlu su çıkarılır ve dozlama solüsyonu ile değiştirilebilir. Care alınmalıdıriçine ve dışına iyice pipetlerken zara zarar değil. Sonra dolu, kuyunun üst siyano akrilat yapıştırıcı madde kullanılarak nitril bir parça ile sızdırmaz olmalıdır. Bu alan çözeltinin yüzey ve kuyunun üst kısmı arasında kalan önemlidir. Bu nitril bariyer koyarak zaman yapışkan çözüm temas etmemesini sağlayacaktır.

Bu dozaj prosedürün etkisini analiz etmek için bir zaman sonra, beyin ayrılmakta ve görüntülü gerekir. Immünohistokimya yapılacak olursa, standart perfüzyon ve antikor boyama yapılabilir. Dozlanan bileşiğin yer tespit edilmesi ise, bir kuru buz / izobutan çözeltisi içindeki beyin flaş dondurma önerilir. Bu, beyin dilimleri bileşiğin konumu ötenazi hemen önce olduğu gibi aynı olmasını sağlayacaktır.

Burada tarif edilen protokol, cerrahi ile fare beyninin ilaç teslim araştırmak için bir yöntem tarifyarı-geçirgen bir zarın 18 mukozal aşılanmış. Bu kafa tabanı kusurları bir kanlanan burun mukoza zarı 19,20 ile tamir edildiği insanlarda transnasal tümörün çıkartılması ameliyatı sonucu benzer. Bu fare modeli kullanarak, bu mukozal greft BBB atlayarak ve beyine doğrudan yüksek molekül ağırlıklı bir ilaç verilmesi için izin verme yeteneğine sahip nasıl çalışma mümkündür. Biz şimdi 100 kere bu işlemi gerçekleştirdik. Bu prosedür için çok önemli bir verici fareden alınan bir nazal septum greft başarıyla toplanması ve test fare üzerine greft mukoza zarının transferidir. Bu işlem, ilk kez, nörolojik ve psikiyatrik bozukluklarının çeşitli için yüksek moleküler ağırlıklı terapötik maddelerin klinik öncesi test sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Benjamin S. Bleier MD, merkezi sinir sistemine ilaç verilmesinin geçici patent kaplama yöntemleri talebi mucidi.

Acknowledgments

Bu çalışma Parkinson Araştırma 2011 Rapid Response Yenilikler Ödülleri Programı için Mcihael J. Fox Vakfı tarafından finanse edildi. Maliyeciler, çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlamak kararı, ya da yazının hazırlanmasında herhangi bir rolü vardı.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mice Taconic C57BL/6
Isoflurane Piramal Healthcare
Student fine scissors Fine Science Tools 91461-11
Pneumatic drill MTI Dental 333-CB
Drill bit
Forceps Fine Science Tools 91106-12
0.9% Sodium chloride injection USP Abbott Laboratories 4925
Polystyrene Petri dish Fisher 08-757-12 for temporarily storing graft
Bead sterilizer Fine Science Tools 18000-45
Oxygen/Isoflurane System SurgiVet V720100
Temperature Control System Physitemp TCAT-2LV
Small animal stereotaxic instrument KOPF Model 940
Eye ointment
Electric shaver
Cotton-tipped applicators Fisher 23-400-106
7.5% Providone iodine Betadine surgical scrub
70% Ethanol
Surgical blade stainless Feather 2976#10
Scalpel handle - #3 Fine Science Tools 10003-12
3% Hydogen peroxide for cleaning the skull
Vetbond tissue adhesive 3M 1469SB
Needles Becton, Dickinson and Company 305176 needle tip cut off and used as well
Syringes Becton, Dickinson and Company 309597
Nitrile gloves Denville Scientific Inc G4162 for well closure and protection of graft
5-0 Nylon suture thread
Student Halsey needle holder Fine Science Tools 91201-13
Cyanoacrylate adhesive commecially available super glue
Dental cement kit, 1 lb, pink opaque Stoelting 51458
Isobutane (2-methylbutane) Aldrich M32631 for dry ice bath
Dry ice

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cardoso, F. L., et al. Looking at the blood-brain barrier: Molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Res. Rev. 64, 328-363 (2010).
  2. Pardridge, W. M. Drug transport across the blood-brain barrier. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32, 1959-1972 (2012).
  3. Chen, Y., Liu, L. Modern methods for delivery of drugs across the blood-brain barrier. Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 640-665 (2012).
  4. Cheng, F. -C., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor protects against 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)-induced neurotoxicity in C57BL/6 mice. Neurosci. Lett. 252, 87-90 (1998).
  5. Grondin, R., et al. controlled GDNF infusion promotes structural and functional recovery in advanced parkinsonian monkeys. Brain. 125, 2191-2201 (2002).
  6. Kirik, D., et al. Localized striatal delivery of GDNF as a treatment for Parkinson disease. Nat. Neurosci. 7, 105-110 (2004).
  7. Pardridge, W. M. Drug and gene targeting to the brain with molecular trojan horses. Nat. Rev. Drug Discov. 1, 131-139 (2002).
  8. Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery of protein and non-viral gene therapeutics with molecular Trojan horses. J. Control. Release. 122, 345-348 (2007).
  9. Bellavance, M. -A., et al. Recent advances in blood-brain barrier disruption as a CNS delivery strategy. AAPS J. 10, 166-177 (2008).
  10. Merkus, F. H. M., Berg, M. Can nasal drug delivery bypass the blood-brain barrier. Drugs R. D. 8, 133-144 (2007).
  11. Dhuria, S. V., et al. Intranasal delivery to the central nervous system: Mechanisms and experimental considerations. J. Pharm. Sci. 99, 1654-1673 (2010).
  12. Illum, L. Nasal drug delivery-possibilities, problems and solutions. J. Control. Release. 87, 187-198 (2003).
  13. Craft, S., et al. Intranasal insulin therapy for alzheimer disease and amnestic mild cognitive impairment: A pilot clinical trial. Arch. Neurol. 69, 29-38 (2012).
  14. Freiherr, J., et al. Intranasal insulin as a treatment for Alzheimer's Disease: A review of basic research and clinical evidence. CNS Drugs. 27, 505-514 (2013).
  15. Gill, S. S., et al. Direct brain infusion of glial cell line-derived neurotrophic factor in Parkinson disease. Nat. Med. 9, 589-595 (2003).
  16. Love, S., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor induces neuronal sprouting in human brain. Nat. Med. 11, 703-704 (2005).
  17. Antunes, M. B., et al. Murine nasal septa for respiratory epithelial air-liquid interface cultures. BioTechniques. 43, 195-204 (2007).
  18. Bleier, B. S., et al. Permeabilization of the blood-brain barrier via mucosal engrafting: implications for drug delivery to the brain. PLoS ONE. 8, (2013).
  19. Bernal-Sprekelsen, M., et al. Closure of cerebrospinal fluid leaks prevents ascending bacterial meningitis. Rhinology. 43, 277-281 (2005).
  20. Bleier, B. S., et al. Laser-assisted cerebrospinal fluid leak repair: An animal model to test feasibility. Otolaryngol. Head Neck Surg. 137, 810-814 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics