Heterotópico mucosas Procedimiento La incorporación del trasplante de Drogas entrega directa al cerebro en ratones

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Un modelo de ratón de la reconstrucción endoscópica de base de cráneo humano se ha desarrollado que crea una interfaz semipermeable entre el cerebro y la nariz con injertos de mucosa nasal. Este método permite a los investigadores estudiar la entrega al sistema nervioso central de la terapéutica de alto peso molecular que se excluyen de otra manera por la barrera sangre-cerebro cuando se administra sistémicamente.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Kohman, R. E., Han, X., Bleier, B. S. Heterotopic Mucosal Engrafting Procedure for Direct Drug Delivery to the Brain in Mice. J. Vis. Exp. (89), e51452, doi:10.3791/51452 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Entrega de agentes terapéuticos en el cerebro se ve impedida por la presencia de la barrera sangre-cerebro (BBB), que restringe el paso de compuestos polares y de alto peso molecular de la sangre y en el tejido cerebral. Algún éxito la entrega directa en los seres humanos se ha logrado a través de la implantación de catéteres transcraneal; Sin embargo este método es altamente invasivo y asociada con numerosas complicaciones. Una alternativa menos invasiva sería para dosificar el cerebro a través de un implantado quirúrgicamente, membrana semipermeable tal como la mucosa nasal que se utiliza para reparar defectos de la base del cráneo siguiente transnasal tumor de la cirugía de extracción endoscópica en los seres humanos. Transferencia del fármaco a pesar de esta membrana evitaría eficazmente la acreditación y difundirse directamente en el cerebro y líquido cefalorraquídeo. Inspirado por este enfoque, un enfoque quirúrgico en ratones fue desarrollado que utiliza una membrana donante de la mucosa septal injertado sobre un extracraneal quirúrgica acreditación defecto. Este modelo se ha demostrado que efectivamentepermitir el paso de compuestos de alto peso molecular en el cerebro. Puesto que numerosos fármacos candidatos son incapaces de cruzar la BHE, este modelo es valiosa para la realización de los ensayos preclínicos de nuevas terapias para enfermedades neurológicas y psiquiátricas.

Introduction

El tratamiento de la enfermedad neurológica y psiquiátrica está severamente obstaculizada por la presencia de la barrera sangre-cerebro (BBB) ​​que impide que más del 95% de todos los posibles agentes farmacéuticos de alcanzar el sistema nervioso central 1-3. Por ejemplo, factor neurotrófico derivado del glial (GDNF) ha demostrado ser eficaz en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson cuando se inyecta directamente en el cerebro, sin embargo, es ineficaz cuando se entrega sistémica, ya que no puede penetrar la acreditación 4-6.

Numerosos acercado se han desarrollado para tratar de solventar este problema. Mejoras en la administración sistémica de neurotheraputics se ha demostrado mediante el uso de conjugados de fármaco que contienen anticuerpos selectivos para proteínas de transporte situados sobre el endotelio capilar cerebral; Sin embargo este método no ha demostrado ser aplicable para una amplia gama de productos farmacéuticos 7,8. Además, la apertura osmótica de la BBB ha sido utilizado clínicaaliado, sin embargo, este método adolece de la dosificación del fármaco sistémico en oposición a una entrega más directo a la región del cerebro de interés 9. Esfuerzo considerable se ha puesto en la optimización de la entrega transnasal con la esperanza de dirigirse directamente al cerebro 10-12. Aunque algo de éxito se ha logrado, resultados concluyentes sólo se han obtenido para fármacos que poseen receptores endógenos, tales como la insulina 13,14. Además, el mecanismo de entrega transnasal ha sido motivo de controversia con la evidencia que sugiere la entrada indirecta en el cerebro a través de la captación de la neurona olfatoria o por el torrente sanguíneo 11. La entrega directa, transcraneal utilizando catéteres implantables se ha conseguido, sin embargo este procedimiento es altamente invasiva y asociada con numerosas complicaciones 15,16. Hasta la fecha, no hay ningún método general, mínimamente invasivo para entregar compuestos de alto peso molecular en el cerebro.

Presentado en el presente documento es un procedimiento quirúrgico murinoque crea una interfaz semipermeable con el cerebro. Esto se logra de injerto de un explante de la membrana mucosa 17 sobre un defecto craneotomía quirúrgica en un ratón. El uso de este procedimiento se ha demostrado que los compuestos solubles de hasta 500 kDa pueden ser entregados en el sistema nervioso central (directamente en el parénquima cerebral, así como en el líquido cefalorraquídeo) tanto en un tiempo y manera dependiente de peso molecular 18. Este método de pasar por la acreditación es un modelo para la reparación de defectos de base de cráneo en los seres humanos que utiliza injertos de mucosa vascularizados para reparar agujeros en el cráneo después de la cirugía endoscópica transnasal 19,20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Antes de la cirugía asegúrese de todos los procedimientos que hay que hacer son aprobados por IACUC y las autoridades éticas o legales adicionales y utilizan prácticas de tratamiento de los animales sin causarles daño. Esto incluye el uso de cirugía condiciones estériles, anestesiar el ratón usando IACUC método aprobado, lubricantes ojos ratones con la pomada de veterinario durante la cirugía, y la prestación de atención posquirúrgica. No continúe con la cirugía si hay alguna cuestión de si se aprueban aspectos del procedimiento. Todos los procedimientos realizados en este documento fueron aprobados por el Comité Universitario Institucional Cuidado de Animales y Uso Boston.

1. Preparación de los animales y Suministros Quirúrgicos

  1. Autoclave todo instrumento quirúrgico que se utiliza durante la cirugía.
  2. Asegúrese de que todas las técnicas que se van a realizar son aprobados por los organismos reguladores de los animales.

2. La recolección de la mucosa del injerto

  1. Elija un ratón genéticamente idéntico de edad similar a lael ratón experimental y practicar la eutanasia en un método aprobado IACUC (aquí: la asfixia isoflurano seguido por dislocación cervical).
  2. Con unas tijeras quirúrgicas, quitar la piel alrededor de la región nasal de la cabeza del ratón exponer el cráneo.
  3. Con un taladro neumático, marca con tres líneas dos de los cuales flanquean lateralmente la región nasal y una tercera en la línea de los ojos que conecta las dos líneas perpendiculares.
  4. Perforar abajo ventralmente con el fin de separar el tabique nasal del tejido circundante. Un camino más amplio evitará daños a la membrana de la mucosa sin embargo, también hará que sea más difícil aislar la membrana. Se recomienda un corte estrecho cerca de la línea media.
  5. Utilice unas tijeras para cortar el tabique libre de cualquier tejido adherido al mismo y guárdelo en una solución salina estéril. En este momento el injerto se puede limpiar para eliminar cualquier tejido conectado. La situación ideal es tener las membranas mucosas no dañadas expuestas en ambos lados del tabique cartílago. Uno grpopa se puede suministrar de membrana para dos ratones proporcionó el área de la superficie de la membrana es suficiente para cubrir los sitios de craneotomía. Se recomienda que el injerto se utiliza lo más rápidamente posible y el investigador procede a la etapa 3, tan pronto como se aísla el injerto.

3. Implantación quirúrgica de la mucosa del injerto

  1. El uso de procedimientos estándar, asépticas murinos quirúrgicos, anestesiar y montar un ratón en el marco estereológico. Utilice aproximadamente 2% de isoflurano en oxígeno puro usando una máquina de anestesia de roedores.
  2. Inmovilizar el ratón en un aparato estereotáxico con barras de oído y un soporte de la nariz. Aplique una pomada oftálmica para los ojos y frote el cuero cabelludo con betadine y etanol al 75% durante tres rondas. El uso de cualquiera de tijeras o un cortador de pelo, quitar el pelo de la cabeza. Exponer el cráneo con una hoja de afeitar y nivelar la cabeza. Realizar una craneotomía por encima de la ubicación del cerebro que se dosifica. Por ejemplo, cuando la orientación del cuerpo estriado cortar un 1,25 mmdiámetro del orificio circular en el cráneo (con centro en AP: 1,00 mm; ML: 0,88 mm) usando un taladro neumático. Humedecer la zona perforada con solución salina estéril y utilizar una hoja de afeitar para quitar el cráneo.
  3. Retire con cuidado la duramadre con la punta de una aguja. Además, esto se puede lograr mediante la aplicación de una cantidad mínima de adhesivo tisular a la superficie de la duramadre húmedo. Una vez que esta capa se ha endurecido, el movimiento lateral con una punta de cuchilla de afeitar se puede utilizar para eliminar la membrana.
  4. Coloque la membrana de la mucosa por encima de la superficie del cerebro teniendo cuidado extremo para mantener el lado epitelial hacia fuera de la herida. Esto se hace mejor mediante la transferencia de todo el tabique sobre la superficie del cráneo adyacente al sitio de la craneotomía con pinzas. Con la punta de un par de tijeras quirúrgicas, tire de la membrana fuera del cartílago y en la superficie del cráneo y del cerebro. No deje que la membrana se seque o toque con cualquier material absorbente. El injerto debe superponerse generosamente todos los bordes óseos de la craneotomía site.
  5. Cubra el injerto con una pieza estéril de nitrilo. Esto actúa para impedir la adherencia de la piel al injerto durante la cicatrización. El nitrilo necesita ser lo suficientemente grande como para cubrir toda la membrana de la mucosa. Recorte membrana excesiva si es necesario. Evite cualquier movimiento del nitrilo, una vez que ha entrado en contacto con el injerto.
  6. Cierre la piel con una sutura 5-0 estéril y dejar correr el ratón recuperar durante 3-7 días antes de proceder a la siguiente etapa. Tenga cuidado de no perturbar la barrera de nitrilo o el injerto de mucosa durante el cierre de la piel.

4. Administración de la solución de dosificación

  1. Después de asegurar el ratón anestesiado en el marco estereotáxico, cortar la sutura con unas tijeras y eliminar el exceso de piel alrededor del cráneo.
  2. Retire la barrera de nitrilo y limpiar la superficie del cráneo. Utilice salinos y algodón hisopos estériles para limpiar el área hasta que el injerto es visible. Puede ser necesario cortar el injerto con una maquinilla de afeitar si ha crecido más grande que el desired superficie.
  3. Si el experimento será más de unos pocos días, es conveniente implantar al menos dos tornillos del cráneo para reforzar el implante de cabeza.
  4. Coloque el muy por encima del injerto de modo que los bordes están en contacto con el cráneo. Aplicar el adhesivo de cianoacrilato en la unión entre el pozo y el cráneo. Llene el bien con solución salina estéril y comprobar para asegurarse de que no haya fugas. Wells se hacen de agujas de jeringa corte.
  5. Aplique cemento para huesos en el cráneo para asegurar el bien en su lugar.
  6. Quitar la solución salina desde el pozo con una pipeta. Lave bien las varias veces para verificar que el adhesivo no se ha filtrado in Agregar la solución deseada; en este caso se utiliza 50 l de dextrano fluorescente. Se espera que los compuestos solubles en agua de una polaridad similar se comportan de la misma como dextrano. Entrega de compuestos hidrófobos o suspensiones no ha sido explorado con este método.
  7. Se tapa la parte superior del pozo mediante el uso de una pieza circular de nitrilo asegurado a laarriba usando adhesivo de cianoacrilato. Asegúrese de que el adhesivo no entre en contacto con los contenidos del pocillo.

5. Análisis de transmucosa de entrega

  1. Una vez transcurrido el período de tiempo deseado, anestesiar el ratón y el intercambio de los contenidos del pocillo con una solución de colorante azul de Evan. Este colorante se utiliza para verificar que el injerto estaba intacto.
  2. Después de 30 min, anestesiar el ratón en gran medida, se retira la solución colorante, y la eutanasia mediante decapitación.
  3. Elimine manualmente el implante y retire el cerebro utilizando tijeras quirúrgicas. Tenga cuidado de mantener el injerto en su lugar.
  4. Una vez retirado, el flash-congelar el cerebro en una solución de isobutano se enfrió en un baño de hielo seco.
  5. Incrustar el cerebro en temperatura óptima de corte solución (OCT) y el tramo a 50 micras.
  6. Colocar las rebanadas deseadas directamente en un portaobjetos de microscopio.
  7. Imagen de la rebanada utilizando un microscopio de fluorescencia tan pronto como la solución de octubre se ha secado.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

La obtención de una lo suficientemente grande como explante tabique nasal es crucial para las etapas subsiguientes. Esto se puede lograr mediante la perforación en el lugar en el cráneo del ratón donante se muestra en la Figura 1a. Corte a lo largo de este camino producirá un explante de suficiente tamaño como se muestra en la Figura 1b. Si la profundidad de la perforación no es lo suficientemente profunda, el injerto será truncado y que será difícil obtener una membrana lo suficientemente grande como para cubrir la superficie del cerebro. De perforación más lateralmente que el camino sugerido no es aconsejable debido a que más tejido permanecerá en el tabique nasal, y el siguiente paso será más difícil. Antes de la transferencia de la membrana de la mucosa, la superficie del tabique tiene que ser limpiado de todo exceso de tejido conectivo. Una vez hecho esto, la membrana de la mucosa debe ser visible en la superficie del cartílago. Figura 1C muestra lo que el tejido se ve como después de la limpieza.

Antes de transferir la membrane, necesita una craneotomía y durotomía a realizar para exponer la superficie del cerebro. Sólo después de la hemorragia post-durotomía ha parado se puede transferir la membrana. Figura 2a muestra lo que el sitio de la cirugía debe ser similar antes de continuar con el siguiente paso. La transferencia de la membrana mucosa del cartílago en la superficie del cerebro es el paso más difícil técnicamente de todo el procedimiento quirúrgico y debe hacerse con cuidado. Si el tabique cosechado es lo suficientemente grande, el área de superficie del injerto de la mucosa debe ser lo suficientemente grande como para cubrir la superficie del cerebro. Una vez transferido, el área quirúrgica debe parece similar a la de la Figura 2b. Es importante asegurarse de que el lado de la membrana que está en contacto con el cartílago es el mismo que está en contacto con la superficie del cerebro. Si la membrana se dio la vuelta o plegada sobre sí misma, que debe ser desechada y otro debe ser utilizado. Una vez completado este paso, el cuero cabelludo se puede suturarde modo que el ratón puede recuperarse y que el injerto pueda sanar. Con el fin de evitar cualquier reacción adversa desde el injerto de entrar en contacto con la superficie interna del cuero cabelludo, una pieza de protección de nitrilo debe estar por encima de la zona quirúrgica. Como se muestra en la Figura 2c, la pieza insertada debería ser suficiente para cubrir la membrana grande, pero no lo suficientemente grande como para impedir la sutura de la piel cerrada.

Durante el período de recuperación, el tejido sustancial en el crecimiento se produce del periostio circundante que tiene que ser eliminado antes de la dosificación de la membrana. Después de volver a abrir el cuero cabelludo, tendrán que ser utilizado para limpiar el sitio hasta que tenga un aspecto similar al de la figura 3a hisopos de algodón estériles y solución salina. No hemos observado ninguna respuesta inmune sustancial; sin embargo, esto no ha sido confirmado histológicamente. El injerto puede ser necesario cortar con una maquinilla de afeitar si ha crecido a través de la superficie del cráneo. En esta etapa el bien que va a contener la solución de dosificaciónción debe ser implantado por encima del injerto. Varios tornillos cráneo se pueden poner en en este paso si la estabilidad mecánica a largo plazo del implante es una preocupación. Asegúrese de que el pozo se coloca de modo que no toque el injerto. Una vez en su lugar, adhesivo de cianoacrilato se puede aplicar a pegarlo al cráneo. Para evitar que el adhesivo entre en contacto con el injerto debe ser aplicado a la superficie del pozo y empuja hacia abajo para sellar la brecha. Una vez que el pozo es segura, debe ser llenado temporalmente con solución salina para ambos hidrato de injerto y revise si hay fugas. El bien adherida debería parecerse a la de la Figura 3b y el solución debe quedar claro que indica que no contiene ningún adhesivo. Cualquier fuga serán obvias ya que el nivel de líquido en el pozo caerá. Si se encuentran filtraciones tienen que ser fijados con más adhesivo. El pozo se refuerza entonces con cemento óseo. En este punto la solución salina en el pozo se puede quitar con una pipeta y sereemplazado con la solución de dosificación deseada. Al cubrir el pozo con un pedazo de la atención de nitrilo se debe tomar para asegurarse de que el adhesivo no entre en contacto la solución en el pozo. Al final de todo el procedimiento, la cabeza del ratón debe ser similar a la de la Figura 3c. El cemento óseo es ligeramente translúcido, por tanto, si el contenido de la bien son sensibles a la luz, tinte o tinta se pueden añadir a la superficie del cemento en polvo o a la mezcla de cemento para prevenir la fotodegradación de los contenidos del pocillo.

Después del período deseado de tiempo de espera, el cerebro debe ser analizado para descubrir los efectos de la dosificación. El cerebro debe ser tratado de manera diferente dependiendo de lo que está siendo examinada. Si el propósito del procedimiento es analizar la presencia de cualquier producto químico añadido a la bien, (tal como se describe en la sección de protocolo anterior), entonces se recomienda hacer una congelación de flash del cerebro para preservar los compuestos administrados. Figura 4 > Muestra un resultado representativo de la utilización de este enfoque. Dosificación con un polímero fluorescente de 40 kDa (dextrano conjugado tetramethyrhodamine) durante 24 horas muestra la difusión notable en el tejido cerebral. Nuestros resultados previos con dextrano espectáculo difusión en el tejido cerebral es a la vez el tiempo y el peso molecular dependiente 18. Moléculas más pequeñas se difunden en el parénquima cerebral en mayor medida que los más grandes, y una más grande resultados de tiempo de dosificación en una cantidad más grande de difusión para todos los pesos moleculares que hemos probado. Si el flash de congelación se lleva a cabo, es importante montar las diapositivas después de la sección y no los exponga a cualquier solución. Cualquier líquido que va a solubilizar el compuesto administrado y difundirla a través de la superficie de la rebanada de cerebro. Si inmunohistoquímica se va a realizar en el cerebro, entonces es recomendable para perfundir el ratón para fijar el tejido cerebral.

iles/ftp_upload/51452/51452fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51452/51452fig1.jpg "/>
Figura 1. Imágenes del procedimiento de cosecha tabique nasal. A) La ubicación del sitio de perforación en el cráneo de un ratón sacrificado. Las líneas de puntos indican el perímetro para perforar. B) El tabique nasal directamente después de la extirpación quirúrgica. C) El tabique nasal después de retirar el exceso de tejido. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 2
Figura 2. Imágenes quirúrgicas del proceso de injerto. A) La herida quirúrgica después de la craneotomía y durotomía. La imagen puede no ser lo que el cráneo debe ser similar antes de colocar el injerto sobre ella. B) La colocación del injerto de mucosa en el sitio de la craneotomía. La línea punteada indica el perímetro del injerto. La imagen muestra el área de superficie deseada del injerto. C) Implantación de la barrera de protección de nitrilo. El tamaño del material como se muestra es suficiente para cubrir el injerto grande, pero no lo suficientemente grande como para interferir con la sutura. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 3
Figura 3. Imágenes quirúrgicas del proceso de dosificación de fármacos. A) Un ejemplo de lo que el injerto de mucosa sanado parece después de la limpieza rigurosa de la zona quirúrgica. B) Imagen de bien ajustado al cráneo. La interfaz del cráneo y así se aseguracon el pegamento de cianoacrilato y el pozo se llena con solución salina estéril. El nivel de la solución estable indica que no hay fugas en el pozo y la claridad de la solución indica que no hay contaminación de la solución con adhesivo. C) La imagen de la cirugía completado. El pozo contiene la solución de dosificación y se tapa con seguridad con una barrera de nitrilo. El cemento óseo esté en su lugar para dar rigidez del implante. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 4
Figura 4. Imagen de microscopio fluorescente de una rebanada de cerebro de ratón después de la dosificación transmucosa con 40 kDa tetrametilrodamina dextrano conjugado durante 24 horas. El rebanada fue tomada en -1,06 mm bregma con un espesor de 501; m. El injerto de la mucosa es visible en la superficie del cerebro. Barra = 1 mm. Haz clic aquí para ver la imagen más grande.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

El paso más difícil del procedimiento descrito en el presente documento es la transferencia con éxito de una membrana mucosa de tamaño adecuado sobre la superficie del cerebro. Este paso se hace mucho más fácil si el tabique nasal cosechado es lo suficientemente grande y las limpiaban bien. Si se trunca la porción ventral del septum, se debe obtener un nuevo injerto. El ángulo de perforación debe ser perpendicular a la cabeza del ratón para asegurar que la membrana de la mucosa no es dañado por el taladro. Si se toma un camino de perforación más amplia de lo recomendado será mucho más difícil de eliminar el tejido adicional que está conectada al tabique. Cualquier grandes piezas de tejido conectivo se deben quitar con cortes de tijeras afiladas en lugar de tratar de tirar de ellos suelta. Los trozos más pequeños de tejido se pueden retirar por raspado con la punta de las tijeras presentó el tejido no está conectado a la membrana de la mucosa. Al final del proceso de limpieza, la superficie del cartílago con la membrana todavía unido debe ser expuesta. Occaprovisionalmente el cartílago septal puede desprenderse del hueso que está conectado a en el borde dorsal. Si esto ocurre, todavía es posible utilizarlo en la siguiente etapa sin embargo, es más difícil por dos razones. El hueso es una cómoda asa para sujetar el explante al limpiar y transferirla. Una vez retirado, es más difícil de manejar la hoja de cartílago más delicado. En segundo lugar, la unión cartílago-hueso es donde la membrana mucosa es más gruesa y más fácil de obtener para desenchufarlo de cartílago. Si el hueso se separa del cartílago se pierde esta porción de la membrana.

Una vez que el injerto septal ha sido limpiado y se han realizado la craneotomía y durotomía, la membrana de la mucosa se puede colocar sobre la superficie del cerebro expuesto. Esto se logra mejor colocando el explante adyacente al sitio de la craneotomía. La membrana puede entonces ser retirado del cartílago, en el cráneo, y sobre el cerebro. Muchas cosas pueden salir mal durante este process. La membrana puede secarse, se rasga, doble en la parte superior de la misma, o se amontonen. También la membrana que cubre el otro lado del tabique puede ser dañado por la fricción contra el cráneo. También es posible que al intentar quitar la membrana de la mucosa hacia arriba, se quita las membranas de ambos lados al mismo tiempo. Con el fin de evitar todos estos problemas es crucial para mover la membrana lentamente y siempre tenga en ambos lados del tabique. La mejor estrategia es utilizar las puntas de las tijeras para desalojar a la membrana de la lámina de cartílago antes de tratar de deslizarse apagado. Si cualquier porción de la membrana permanece unida, es posible que la elasticidad del tejido se retrae después tirando de él. Mediante el uso de pequeños movimientos, que tiran de la membrana puede ser separado del tabique. Sólo entonces se deslice fácilmente fuera. La membrana es demasiado delgada para ser capaz de ser manejado con pinzas; sólo se puede jalar de una superficie a otra. Si se dio la vuelta o plegada sobre sí misma,deben ser descartados y otro se debe obtener.

Si el injerto cubre toda la superficie del cerebro expuesto, el proceso se ha realizado correctamente y el cuero cabelludo puede ser suturado de manera que el sitio de la cirugía puede curar. Una barrera de nitrilo debe ser puesto en su lugar para que la piel no entre en contacto con la membrana. Se debe tener cuidado para que no se ejerce presión sobre el nitrilo al suturar lo contrario la posición de injerto puede moverse. También tenga cuidado de no suturar en el nitrilo. La mejor manera de asegurarse de que el material obedece es para mantenerla húmeda con solución salina y asegurarse de que se mantiene plana en toda la sutura.

Una vez que el injerto se haya curado (3-7 días), el pocillo que contiene la solución de dosificación se puede fijar al cráneo por encima del injerto. Se puede fijar temporalmente en el cráneo con pegamento adhesivo y de forma permanente con cemento óseo. Una vez que se aplica el cemento óseo, no será posible hacer las correcciones a la posición therefo asíre toda optimización debe hacerse antes de su aplicación. Una vez que el bien esté en posición y se mantiene en su lugar con pegamento de cianoacrilato, que debe estar lleno de solución salina estéril. Si el procedimiento se realizó con éxito el nivel de líquido no va a cambiar y la solución será clara. Si hay una fuga, el nivel se reducirá y la ubicación de donde se escapó el agua debe estar visible. Después de aplicar más adhesivo en el sitio de la fuga, se debe agregar más solución salina para verificar que la fuga fue sellada. Si el adhesivo contamina la solución así, una película translúcida será visible en la parte superior del nivel de fluido. Si esto ocurre, el pozo debe ser lavado varias veces con solución salina hasta que la solución es clara. Además, un intercambio de algodón se puede utilizar para quitar la película tocando a la superficie del líquido. Sólo cuando la solución así es estable y claro se debe aplicar el cemento. Cuando el cemento es seco, la solución salina desde el pozo puede ser eliminado y reemplazado con la solución de dosificación. Se debe tener cuidado alno dañar la membrana al pipetear dentro y fuera del pozo. Una vez llena, la parte superior del pozo debe estar sellada con una pieza de nitrilo usando adhesivo de cianoacrilato. Es importante que el espacio se deja entre la superficie de la solución y la parte superior del pozo. Esto asegurará que el adhesivo no toca la solución al ponerse la barrera de nitrilo.

Una vez que es hora de analizar el efecto del procedimiento de dosificación, el cerebro debe ser removido y la imagen. Si inmunohistoquímica se va a realizar, tinción de perfusión y estándar de anticuerpos se puede hacer. Si la ubicación del compuesto dosificado se ha de determinar, se recomienda Congelación del cerebro en una solución de hielo / isobutano seco. Esto asegurará que la ubicación del compuesto en los cortes de cerebro es el mismo que el que estaba inmediatamente antes de la eutanasia.

El protocolo descrito en el presente documento se describe un método para investigar la administración de fármacos al cerebro de ratón a través de un quirúrgicamenteinjertado membrana mucosa semipermeable 18. Esto es análogo a los resultados de la cirugía de extirpación de tumores transnasal en los seres humanos en los que los defectos de la base del cráneo se reparan con una membrana de la mucosa nasal vascularizado 19,20. El uso de este modelo de ratón, ahora es posible estudiar cómo estos injertos mucosos son capaces de pasar por la acreditación y permitiendo la administración de fármacos directa de alto peso molecular en el cerebro. Hemos realizado este procedimiento más de 100 veces. Crucial para este procedimiento es la recolección exitosa de un injerto tabique nasal de un ratón donante y la transferencia de la membrana de la mucosa del injerto en el ratón de prueba. Este procedimiento, por primera vez, permite a las pruebas preclínicas de la terapéutica de alto peso molecular para una variedad de trastornos neurológicos y psiquiátricos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Benjamin S. Bleier MD es el inventor de plomo de los métodos de recubrimiento de patente provisional de la administración de fármacos al sistema nervioso central.

Acknowledgments

Este estudio fue financiado por la Fundación Mcihael J. Fox para la Investigación del 2011 Innovaciones de Respuesta Rápida de Parkinson Programa de Premios. Los financiadores no tenía papel en el diseño del estudio, recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mice Taconic C57BL/6
Isoflurane Piramal Healthcare
Student fine scissors Fine Science Tools 91461-11
Pneumatic drill MTI Dental 333-CB
Drill bit
Forceps Fine Science Tools 91106-12
0.9% Sodium chloride injection USP Abbott Laboratories 4925
Polystyrene Petri dish Fisher 08-757-12 for temporarily storing graft
Bead sterilizer Fine Science Tools 18000-45
Oxygen/Isoflurane System SurgiVet V720100
Temperature Control System Physitemp TCAT-2LV
Small animal stereotaxic instrument KOPF Model 940
Eye ointment
Electric shaver
Cotton-tipped applicators Fisher 23-400-106
7.5% Providone iodine Betadine surgical scrub
70% Ethanol
Surgical blade stainless Feather 2976#10
Scalpel handle - #3 Fine Science Tools 10003-12
3% Hydogen peroxide for cleaning the skull
Vetbond tissue adhesive 3M 1469SB
Needles Becton, Dickinson and Company 305176 needle tip cut off and used as well
Syringes Becton, Dickinson and Company 309597
Nitrile gloves Denville Scientific Inc G4162 for well closure and protection of graft
5-0 Nylon suture thread
Student Halsey needle holder Fine Science Tools 91201-13
Cyanoacrylate adhesive commecially available super glue
Dental cement kit, 1 lb, pink opaque Stoelting 51458
Isobutane (2-methylbutane) Aldrich M32631 for dry ice bath
Dry ice

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cardoso, F. L., et al. Looking at the blood-brain barrier: Molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Res. Rev. 64, 328-363 (2010).
  2. Pardridge, W. M. Drug transport across the blood-brain barrier. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32, 1959-1972 (2012).
  3. Chen, Y., Liu, L. Modern methods for delivery of drugs across the blood-brain barrier. Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 640-665 (2012).
  4. Cheng, F. -C., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor protects against 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)-induced neurotoxicity in C57BL/6 mice. Neurosci. Lett. 252, 87-90 (1998).
  5. Grondin, R., et al. controlled GDNF infusion promotes structural and functional recovery in advanced parkinsonian monkeys. Brain. 125, 2191-2201 (2002).
  6. Kirik, D., et al. Localized striatal delivery of GDNF as a treatment for Parkinson disease. Nat. Neurosci. 7, 105-110 (2004).
  7. Pardridge, W. M. Drug and gene targeting to the brain with molecular trojan horses. Nat. Rev. Drug Discov. 1, 131-139 (2002).
  8. Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery of protein and non-viral gene therapeutics with molecular Trojan horses. J. Control. Release. 122, 345-348 (2007).
  9. Bellavance, M. -A., et al. Recent advances in blood-brain barrier disruption as a CNS delivery strategy. AAPS J. 10, 166-177 (2008).
  10. Merkus, F. H. M., Berg, M. Can nasal drug delivery bypass the blood-brain barrier. Drugs R. D. 8, 133-144 (2007).
  11. Dhuria, S. V., et al. Intranasal delivery to the central nervous system: Mechanisms and experimental considerations. J. Pharm. Sci. 99, 1654-1673 (2010).
  12. Illum, L. Nasal drug delivery-possibilities, problems and solutions. J. Control. Release. 87, 187-198 (2003).
  13. Craft, S., et al. Intranasal insulin therapy for alzheimer disease and amnestic mild cognitive impairment: A pilot clinical trial. Arch. Neurol. 69, 29-38 (2012).
  14. Freiherr, J., et al. Intranasal insulin as a treatment for Alzheimer's Disease: A review of basic research and clinical evidence. CNS Drugs. 27, 505-514 (2013).
  15. Gill, S. S., et al. Direct brain infusion of glial cell line-derived neurotrophic factor in Parkinson disease. Nat. Med. 9, 589-595 (2003).
  16. Love, S., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor induces neuronal sprouting in human brain. Nat. Med. 11, 703-704 (2005).
  17. Antunes, M. B., et al. Murine nasal septa for respiratory epithelial air-liquid interface cultures. BioTechniques. 43, 195-204 (2007).
  18. Bleier, B. S., et al. Permeabilization of the blood-brain barrier via mucosal engrafting: implications for drug delivery to the brain. PLoS ONE. 8, (2013).
  19. Bernal-Sprekelsen, M., et al. Closure of cerebrospinal fluid leaks prevents ascending bacterial meningitis. Rhinology. 43, 277-281 (2005).
  20. Bleier, B. S., et al. Laser-assisted cerebrospinal fluid leak repair: An animal model to test feasibility. Otolaryngol. Head Neck Surg. 137, 810-814 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics