在细胞和组织力学生物学应用一种新型的拉伸平台

1Centre for Interdisciplinary NanoPhysics, Department of Physics, University of Ottawa, 2University of Ottawa Heart Institue, University of Ottawa, 3Libin Cardiovascular Institute of Alberta, University of Calgary, 4Department of Biology, University of Ottawa, 5Institute for Science, Society and Policy, University of Ottawa
Bioengineering

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Summary

我们在本文中展示了一种新的拉伸平台,可用于研究单个细胞的反应,复杂的各向异性的双轴机械变形和量化生物组织的机械性能。

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Tremblay, D., Cuerrier, C. M., Andrzejewski, L., O'Brien, E. R., Pelling, A. E. A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology. J. Vis. Exp. (88), e51454, doi:10.3791/51454 (2014).

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Abstract

工具,使机械力的应用,细胞和组织,或可量化的生物组织的机械性能有了显着的贡献基本力学生物学的理解。这些技术已被广泛使用,以说明如何各种疾病的发病和进展被很大程度上受到机械线索的影响。本文介绍了一个多功能双轴拉伸(BAXS)平台,可以通过机械刺激单细胞或组织量化的机械刚度。该BAXS平台包括可独立控制的4音圈电机。单细胞可以培养的柔性基板,可以连接到电机允许一个细胞暴露于复杂的,动态的和空间上变化的应变场上。相反,通过将力负载单元,可以同时量化初级组织的机械性能,因为它们暴露于形变周期。在这两种情况下,一组适当的夹具必须设计和安装在BAXS平台马达,以牢牢占据柔性基板或感兴趣的组织。该BAXS平台可以安装在倒置显微镜来执行同时的透射光及/或荧光成像研究中的拉伸实验样品的结构或生物化学反应。本文提供的BAXS平台的设计和使用的实验细节,并提出结果适用于单节和整个组织的研究。该BAXS平台被用来测量细胞核中单个小鼠成肌细胞在响应的变形到基板的应变与测量的离体小鼠主动脉的刚度。该BAXS平台是可以与各种光学显微术以提供在亚细胞,细胞和整体组织水平新颖mechanobiological见解进行组合的多功能工具。

Introduction

机械微环境中许多细胞功能如细胞增殖,迁移和分化,它们在组织的发育和内环境稳定,以及在疾病1-6产生深远的影响中起着重要的作用。多年来,大量的实验工具已被用于机械刺激的细胞或组织,并测量随着我们的基本力学生物学的理解和学习的疾病6-17的发病和进展的目标生物体组织的机械性能。然而,一个人必须经常依赖于几个不同的实验装置,以实现特定的研究的目标。本文介绍了一个单一的,多功能,双轴拉伸(BAXS)平台,使该调查中的作用是机械性能和机械力的亚细胞到整个组织的尺度在发挥生物学研究。该BAXS平台不仅允许quantification个孤立的组织的机械性能,而且也有利于以简单的,复杂的和动态应变场适用于活细胞,以了解他们的反应,拉伸发生在体内的能力。该BAXS平台还维护期间机械测试和扰动对细胞和组织进行活细胞显微镜的能力。

该BAXS平台是可用于研究衬底变形的效果在细胞水平和对生物体组织( 图1A)进 ​​行拉伸试验定制的设备。铝加热器制造,以适应标准的10厘米的培养皿,在37℃下用温度控制器和聚酰亚胺薄膜加热器( 图1B)维护任何生理溶液。这BAXS平台可以集成到一个倒置相差和/或荧光显微镜,并允许同时成像( 图1C)。简言之,BAXS平台包括四个线性音圈马达,其中该可移动部件被安装在沿两个垂直的轴( 图1D)面向微型直线运动球轴承的滑动。线性定位平台被安装到四个马达,以允许将用于( 图1E)的夹紧系统的垂直运动。各电动机的位置是由具有500纳米的分辨率( 图1F)的光学编码器监视。所有的四台电机独立控制,采用光电编码器反馈来执行运动命令( 图1G)运动控制器。 LabVIEW的接口提供了完全控制的位移幅度,速度,以产生细胞或组织样品的完全可定制的,静态的和动态的,变形每个电机的加速。

用于诱导细胞中的形变的方法是通过简单地allowin实现G细胞坚定奉行一个灵活和透明的衬底,然后用四台电机的BAXS平台的拉伸该基板。该BAXS平台允许安装夹附着在基材上的音圈电机的任何自定义设计的一套。为此,我们设计了一套夹具,其灵活和透明基板,制成聚二甲基硅氧烷(PDMS)的,可贴( 图2A-C图3)。作为夹具将暴露于生理溶液中,所有的份数均用不锈钢机加工,以便灭菌。这些夹具都经过精心设计,以使基底尽可能接近到显微镜物镜以提高图像质量,同时尽量减少应力在基材上伸展( 图2D)时。

同一BAXS平台还可以用于量化的小组织样本的刚度,使用一组合适的夹具与ADAP的特德支持的组织样本和称重传感器监测力量。几种方法可采取安装一个组织到BAXS平台的电机;在这种情况下,不锈钢的昆虫minutiens标签可以为了进行拉伸试验( 图4A-B)通过血管组织中的开口钩。另外,对于粗的组织未经自​​然开口,组织边缘可以被保持在适当位置与连接到音圈马达或胶合到小玻片用生物胶和附加到与夹具马达夹具。为了进行拉伸测试的微型测力传感器是必需的,并且可以很容易地合并在BAXS平台的电机和用于测量过程中的拉伸循环( 图4C)作用在组织上的力。作为BAXS平台由四个电动机,引入第二负载单元允许一个沿两个正交的方向进行拉伸试验。这种能力允许一个的量化Ý沿两个垂直方向上的相同的实验过程中的单个组织的机械刚度。

重要的是,在所有配置中,将细胞或感兴趣的组织样品始终保持在一个与温度控制槽,都可以访问的用户。这种能力允许样品中引入的药理学试剂的拉伸,以考察样品的时间响应。另外,如在倒置显微镜的光轴保持通畅,各种形式的显微仍可供用户使用。最后,所有的四个马达的BAXS平台为独立是可能的高度可配置的应变场应用到感兴趣的样品。 体内细胞和组织暴露于复杂的和各向异性的拉伸,可以更适当地模仿在这个平台上,而不是传统的单轴拉伸平台7,13,15,18,19。此外,该物理特性的应变场可以动态实验期间改变。这些能力允许用户在检查到一个宽一些的高度复杂的,各向异性的,在时间上和空间上变化的应变场的细胞和组织水平上的反应。本文介绍了BAXS平台的优势和局限性,以及其设计,工作原理和实验细节的单细胞和整个组织的实验。

图1
图1概述了BAXS平台。该BAXS平台 )顶视图显示四个音圈马达用以维持细胞和组织在37°C C)的培养皿加热器该平台可以安装在倒置显微镜进行活的B)详细图片在拉伸实验细胞成像。D)的音圈电机的详细图像;线性定位平台允许夹紧系统的光学编码器提供电机的实时位置,运动控制器。G)的详细图片。F)的详细画面的垂直位移平台的运动部件E)详细图片示出的四个音圈马达的四个光学编码器的输入和功率输出的运动控制器。

图2
图2。夹紧系统细胞拉伸实验。 A,B)的照片示出用于将PDMS衬底 ​​连接到音圈电机用于拉伸。C)该基片缠绕其锚定的featur夹具的圆筒部的夹具的细节ES坐入槽的顶部。然后将基板使用推基板/锚定功能进入前槽的固定螺丝固定。 四)插图BAXS平台与夹具夹持衬底代替。插图示出了具有连接到它的细胞坐在正上方盖玻片与显微镜物镜的基底的详细视图。

图3
图3的膜和它的夹紧系统的材料清单。图纸表示该主要部分的尺寸集成到双轴平台进行小区拉伸实验。

图4
图4实施例充足的夹紧系统,小口径血管僵硬评估用于诱导变形1毫米直径的小鼠主动脉夹紧系统。AB)的详细图片。不锈钢脚都被精心塑造成开放式的三角形,让船只在两个针脚上滑动。C)插图BAXS平台与夹具保持血管和连接固定电机和左钳之间的负载细胞。插图示出了一个详细的顶视图,安装在标签的容器。

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Protocol

单细胞1。机械变形

  1. 一个PDMS基板与嵌入式荧光珠的制作
    前基片的制造中,在水溶液中的荧光微球体悬浮于异丙醇中,以加强珠混合中,由于其疏水性的PDMS。
    1. 移液管将500μl荧光微球至1.5 ml微量离心管中并离心16,200×g离心10分钟。
    2. 弃上清,加入500μl异丙醇,随后用5分钟涡旋的。把小瓶静置过夜在黑暗中,以允许任何大颗粒聚集体,去滓。
    3. 第二天早上,小心取出上清液到一个干净的离心管中。此珠溶液可用于制造超过5基材。注:珠子的解决方案将会继续沉淀在接下来的3天。要小心避免重悬沉淀。
    4. 倾将0.5g固化剂提供与PDMS的试剂盒中使用的科学平衡1.5 ml离心管中。通过连续的步骤,共90微升的有孔玻璃珠添加(在6 15微升),加涡旋每次添加之间进行1分钟。备用。
    5. 权衡10克的PDMS并混合至少12分钟,使用的0.5克补充有荧光珠的固化剂。
    6. 制造使用标准光刻技术下制造商的说明进行SU-8 2050十字型模具。所使用的模具具有320微米的高度和13.4平方厘米面积( 图3)。模具可包含428微升或440毫克的PDMS。
    7. 倒入400毫克,在十字形模具珠的PDMS的使用移液管和固化2小时,在80℃下固化后,从模具中( 图5A)剥离衬底。衬底可以保持在一个培养皿在室温下放置2周,没有示出在其机械性能显著变化。 倾PDMS的微滴(固化剂:PDMS与1:20的比例)在培养皿中约4毫米直径的最终尺寸,并在80℃( 图5B)治愈他们颠倒2小时。这些锚定功能可以保持在一个培养皿数周。注:保持盘倒置,以防止液滴从在固化过程中压扁。
    8. 空气等离子体处理(30秒,30瓦)的基板和8个固定功能。在基板为4毫米的正方形状缩进存在于衬底( 图5C)上的距离的每个端部结合的功能。
  2. 在夹具固定膜
    1. 环绕夹具的槽的圆筒部的基片的每一端,并从顶部的2固定螺钉( 图2B图5D-E)将其固定到位。
    2. 用螺丝将4个夹子上的夹持器,并使用一次性吨倒PDMS(1:20)转拨移液管在所述基板和所述夹具的槽的圆柱形部分之间的接口。使用1.5毫米六角扳手传遍开槽圆柱部分未固化的PDMS。
    3. 在凹槽中倒入PDMS(1:20),直到通过毛细管作用完全填充并固化该组件在80℃下搅拌2小时( 图5F)。
  3. 在膜播种细胞
    1. 空气等离子体处理(30秒,30瓦)整机装配到灭菌和功能化基片,让胶原蛋白涂层。
    2. 官能化,其中细胞将被接种1毫升的0.02M的醋酸补充有鼠尾胶原在室温下搅拌1小时,16微克/毫升的底物的区域。所需的最终胶原密度是5微克/厘米2。
    3. 冲洗衬底3次,用磷酸盐缓冲液,并让它干燥在室温下放置至少10分钟。
    4. 加40微升培养基中补充了10%胎牛塞鲁米和1%含2000细胞在衬底的中心部分以覆盖1厘米2的面积青霉素-链霉素(细胞密度:20 / mm 2)。细胞密度可以根据实验的要求来改变。
    5. 把整个组件在标准细胞培养孵化器与基板朝上与含有在其上的细胞培养基中的压降。注:该组件必须保持与基底朝上至少3小时,以使细胞牢固地安装。为了防止蒸发,加入30μl温暖的培养基加入到所述衬底上的压降,每45分钟3小时。
    6. 3小时后,翻转整个组件装入培养皿中充满了新鲜的培养基中以浸没所述基板和孵育过夜,允许细胞增殖。
    7. 第二天,制备HEPES缓冲盐溶液(HBSS;的Hepes,120 mM氯化钠的,5.3 mM的氯化钾,0.8mM的MgSO 4干燥,180毫米的CaCl 2,和11.1毫之日的20毫xtrose)。将pH调节至7.4。注:HBSS溶液每天制备,并保持在37℃,在该实验。这种生理溶液是用来通过模拟正常组织/血液环境,以保持在显微镜载物台上的细胞。
    8. 安装在倒置相差或荧光显微镜装载了BAXS平台和电机上的夹紧衬底组件的设置。填培养皿培养皿加热器与HEPES缓冲液( 图2D)的内部。

2,刚度小口径血管测量

  1. 准备
    1. 克雷布斯生理溶液:制备118.1 mM氯化钠,11.1 mM的D-葡萄糖,25mM的碳酸氢钠 ,4.7 mM的氯化钾,1.2mM的MgSO 4干燥,1.2 mM的KH 2 PO 4,和2.5mM的CaCl 2溶液。将pH调节至7.4和充氧的溶液用30分钟卡波金医疗气体(95%O 2/5%CO 2)。注:克雷布斯SOLUTI上有每日进行制备,并保持在37℃时的实验。这种生理溶液是用来通过模拟正常组织/血液环境,以保持活的组织中。
    2. 收集仪器的夹层和主动脉血管的力学评估:手术剪刀,镊子弯曲,微型剪刀,外科解剖显微镜,加入50ml聚丙烯离心管中,和10毫升血清移液管。外科手术和实验过程不需要任何无菌条件。安装BAXS平台的夹具以及预先称重传感器。
  2. 组织分离和解剖
    所有涉及实验动物的实验步骤必须由用户的动物护理和使用委员会“的机构,这符合健康指南为用户的实验动物的护理和使用”的国家批准。
    1. 用99%的CO 2的吸入执行鼠标安乐死(7磅)在一个树脂玻璃腔室( 图6A)。
    2. 打开鼠标的腹部切胸主动脉流血鼠标。
    3. 取出膜片,胸廓和肺叶( 图6B)。注意:为尽量减少损坏的组织的风险,保持附着于主动脉的心脏,并避免直接接触容器,但使用的心脏操纵它。
    4. 由容器和脊柱之间轻轻地切割取出心脏,主动脉根部及胸主动脉。注意:不要诱导血管伸长任何切除时保持组织完整( 图6C)的内部结构。
    5. 立即浸入冷水并保持在Krebs溶液的心脏和主动脉。
    6. 剪下并仔细清洗主动脉Krebs溶液以去除任何血块。使用微型剪刀,镊子和手术解剖显微镜( 图6D-E)删除结缔组织。注意:请将所有的血管长度,并使用AOR抽动根,以确定血管方向。
  3. 容器尺寸的确定和安装
    以确定容器的刚度,卸载容器的尺寸是必需的,并且可以用一个校准显微镜来确定。
    1. 切成约2毫米长度的主动脉环和使用校准的显微镜设置( 图6F-G)的精确测量其长度。将这个片段在一旁Krebs溶液。
    2. 再降主动脉环尽可能小各2毫米段( 图6F)之间。把此小片段上与内腔朝上的显微镜载玻片上并用校准显微镜的设置( 图6H)测量壁厚。
    3. 填补了培养皿中BAXS平台Krebs溶液并插入上拉引脚( 图4C插入图示)与2毫米主动脉环段。

GE =“总是”> 图5
图5。PDMS基板制造和安装A)固化后,将衬底仔细剥离的SU-8 2050模具抛开在培养皿B)锚定造出来的PDMS功能,并有助于确保基板上的装在4个夹子衬底夹具C)的底物与锚定功能准备好用于安装D)的基片安装在4个夹子,然后将其安装在所述夹持器(见插图)。E)的详细图像。F )程序在基板下方的槽浇注PDMS的。箭头示出了慢慢通过毛细管填充槽的PDMS。

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图6的制备和胸主动脉的隔离。一 )准备手术器械和安乐死鼠标B)通过纵向腹部切口,胸廓和肺的高吊球被删除。 三)主动脉小心使用心脏操纵移除组织D)的心脏和主动脉被放在克雷布斯生理溶液。主动脉是通过删除所有结缔组织清洗E)详细图片放映的心脏和主动脉F)主动脉用于刚度评估以及用于厚度测量小段段。GH)的精确长度(G)和厚度(H)使用逆显微镜和分析程序的每个血管段进行评估。

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Representative Results

细胞伸展

该BAXS平台被用来研究细胞核中单小鼠成肌细胞的力学响应(C2C12)暴露于25%的基底变形。成肌细胞存在于肌肉组织内,并不断受到机械拉伸和压缩在体内 。细胞核的形状和机械性能都显示出在基因表达和转录活性20,21的调节,并在多种发育缺陷和疾病,如哈钦森- Gilford早衰综合症(HGPS),刚玉粉中发挥了重要作用-Dreifuss肌营养不良(EDMD),扩张型心肌病,过早衰老和癌症22-25。因此,理解从外部机械力的微环境如何影响核的结构和功能是极大的兴趣。该BAXS平台被用来研究的动力来自英里的传输通过拉伸基片平行于它的主要或次要轴线croenvironment到细胞核中。 图7A-F示出了用于沿两个正交的方向在基板诱导变形的平台的功能。此外,BAXS平台可诱导除了相等双轴应变场的标准单轴基板复杂应变场。 图7G-H示出了通过沿两个正交方向上的应变场的独立控制所提供的灵活性,允许我们要么产生一个标准的(压缩)或纯(非压缩)单轴应变场。该BAXS平台能够通过略微拉动的方向的基底垂直于主拉伸方向( 图7G),在一个标准的单轴拉伸( 图7H,以补偿存在于沿该方向的衬底压缩,以产生纯的单轴应变场)。

ntent“FO:保持together.within页=”总是“> 图7
图7。从执行位移-变形关系的标准和纯单轴拉伸。AB)的荧光珠的视频的第一帧上手动选择,并从一帧到另一跟踪,直到最大拉伸沿水平(C达)和垂直(D)方向。一个MATLAB脚本自动计算格林应变张量的每个帧的组成部分,并产生在相对 ​​于电动机的应变的校准曲线方向的位移27。EF)的蓝色和红色的线对应于沿水平的格林应变张量的分量和通过4毫米伸展在同一衬底沿x轴和沿略微伸展分别垂直方向G)1.5毫米(以红色突出显示)y轴上产生一个纯粹的单轴场与基体无压缩变形。高)由3.5毫米拉伸沿x轴在基板产生25%的变形和7%的压缩变形时,沿垂直轴的衬底的端部固定(以红色显示)。

随着以拉伸过程中进行活细胞显微成像能力,细胞核染色用活细胞荧光染料,它与DNA结合(赫司特33342)。在一般情况下,C2C12细胞中具有椭圆形细胞核具有长轴和短轴。第一,鉴定细胞中的或大或小的核轴被取向为平行于水平方向伸展。在这一点上,将细胞由25%的拉伸沿每一正交轴拉伸而获得的每个伸展周期( 图8A-I)之间的未变形和变形核的图像。以这种方式,我们能够评估该核的可变形性沿着精确控制基片的变形根据其长轴和短轴。 Ovuscule,ImageJ的一个插件,用于确定主要和次要核轴的长度。在未变形的状态下被记录这些长度和当原子核沿其长轴和短轴( 图8G-Ⅰ)依次拉伸。计算核的沿其短轴和长轴的变形,在长度沿每个轴的拉伸和未变形状态的相对变化计算:

其中ε是变形中,L 1是变形后的长度和L 0是未变形长度。

在C2C12细胞核的变形表现出机械各向异性,因为显示沿其短轴的显著更高的可变形性(6.3±1.1%)相比,其长轴(3.077; 0.6%)( 图8J)。此外,我们还研究了在调节核变形的肌动蛋白和微管骨架的作用。这是通过解聚微丝微管或选择性地使用细胞松弛素-D和噻氨酯哒唑,分别达到。解聚的微丝或微管,发现诱导的细胞核( 图8J)的各向异性变形性的丧失。这些结果支持这样的研究结果,即细胞骨架成分从基板传递力到细胞核并也可用于变形25期间保留核的自然机械性能是必不可少的。

图8
图8。拉伸协议和核变形AC)的示意图STRE的说明单细胞,其细胞核tching协议水平取向。一个细胞的相衬图像(DF)和外延荧光图像(GI)与染色DNA特异性荧光染料。此图像序列示出了一个典型的细胞拉伸实验,其中相同的细胞暴露于正交变形场。比例尺是25微米J)C2C12显示各向异性核变形与短轴变形显著超过了长轴。在肌动蛋白和微管剥夺细胞(CYT-D和噻氨酯哒唑,分别),这各向异性消失。在所有情况下,核变形是25%的基体变形下显著不同于零。 * p值<0.01,配对t-检验。 ††p<0.01,†††p值<0.001,单样本t检验。

容器刚度评估

T“>最近,我们小组调查了慢性的影响过度表达热休克蛋白27(HSP27 O / E),主动脉斑块在动脉粥样硬化的多发小鼠模型的形成(载脂蛋白E - / - )。我们26表明HSP27充当动脉保护蛋白质,减少斑块脂质和巨噬细胞的丰度,并增加了内膜平滑肌细胞和胶原蛋白含量( 图9A-B),为了确定这个组织重塑的容器的机械性能的影响,BAXS平台被用来测量主动脉僵硬。

图9C示出了从拉伸拉伸主动脉环的典型的应力-应变曲线。量化刚度,增量弹性模量,从应力 - 应变曲线计算出在30%的变形。刚度的切线的曲线的斜率。通过引入一个称重传感器到一个的BAXS平台的电机,同时采集displaceme的NT和力数据是可能的。位移 - 力曲线转换成基于每个主动脉环的未变形尺寸的应力 - 应变曲线。的应力和应变是使用以下公式计算:

其中ε是变形中,L 1是变形后的长度,L 0是未变形长度,s是应力,F是力和A 0是下加载该组织的非变形区。在主动脉环的具体情况下,未变形的区域(A 0)是环时间段的长度的厚度的两倍。

每个样品变形循环为40%在50微米/秒,12个循环,第11次循环允许位移速率的最大变形量的组织的预处理和拉ST一个用于数据采集。我们发现,ApoE基因的主动脉段的刚度- / -热休克蛋白27 O / E小鼠(62.8±3.0千帕)相比,apoE基因均显著增加41% - / -控制小鼠模型(44.4±3.8千帕)( 图9D)

两者合计,机械评估结合血管和斑块组织学证明,过表达HSP27的特点是增加了容器的刚度和胶原/平滑肌细胞含量。这些结果表明,HSP27可能增加动脉粥样硬化病变的稳定性,从而降低斑块破裂的危险。

图9
图9。HSP27的影响过表达对容器的刚度我们表明,HSP27改性的组织学康波和胶原蛋白含量:动脉粥样硬化病变的通过增加血管内膜平滑肌细胞(抗α-SMA A)sition(B:天狼猩红染色)由拉伸主动脉血管所在的刚度的计算在30得到C)典型应力-应变曲线。 %应变。 。刚度的切线(红色线)的曲线的斜率D)的慢性过度表达HSP27的增加容器的刚性控制的apoE比较- / -小鼠模型(D)。比例尺在(A)(B)都是40微米和插图400微米。 L =管腔,I =内膜,虚线描绘的媒体。 * p值<0.05,单因素方差分析。 *** p值<0.001,单向方差分析。图改编自Cuerrier [26]的工作。

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Discussion

该BAXS平台这里提出有利于在力学生物学的研究中无数次的实验,从单细胞的调查,以整个组织。此外,该平台具有高度的灵活性和可配置性,从而允许多个机械刺激实验和多轴向拉伸试验。该平台还可以使细胞和组织的维持在生理条件下,并在拉伸试验允许同时显微镜。上一节中介绍的两个实验证明BAXS平台的通用性使用一组适当的安装夹时。一种模块化和可定制的样品安装系统,光学连接和添加额外的传感器(例如测力传感器)的可能性,开辟更多的类型来进行实验许多可能性。

上面介绍的协议包含了必须执行许多关键步骤dequately以产生最好的结果。在细胞内拉伸协议,安装了PDMS基板上的夹具要求细腻和精准操控。将PDMS衬底必须很好地居中相对于四个夹具,以避免拉伸时的衬底的不需要的横向运动。这样的横向运动可以拉伸实验期间,使细胞的追踪困难。还有,重要的是监测培养基的过程中,当基底朝上在孵化细胞接种水滴的蒸发。取决于如何经常培养箱门的过程中打开时,蒸发速率可以改变。内的容器拉伸协议中,最关键的步骤是待测样品的尺寸的测量。因为他们都参与了组织硬度的计算,因此对业绩有直接​​影响这些尺寸必须尽可能准确。经同一人履行货船Dimension测量将有助于减少样品之间的变异性。

用于在细胞拉伸实验,以拉PDMS基板上的夹具的制造涉及到几个开发周期。该夹具的第一版本没有位于所述圆筒形部件( 图2B)的底部的锚定槽。如果没有这种槽,衬底沿圆筒部滑落,诱导在基板变形显著变异性随着时间的推移。与槽和除固化的PDMS( 图5F)的存在下,底物不再打滑。本实验装置产生在衬底随时间恒定的变形。对于组织拉伸试验,选择合适的称重传感器也是非常重要的。这里所用的测力传感器具有低负载范围(高达150克),这是足够的这里测试的样品。需要测量非常敏感的称重传感器uring小样本拉力具有相对较低的信噪(S / N)比。为了改善S / N比,从而提高分辨率,测力传感器被电从音圈马达和使用塑料螺钉和垫片任何金属部件隔离。在这种方式下一个高S / N比率0.03克的决议案获得。对于较软的样品,使用较低的范围内的负载单元的建议,以维持高的分辨率。

目前,BAXS平台的主要限制是进行长期拉伸实验由于HBSS缓冲液中随时间蒸发的能力。水分蒸发增加溶质浓度,可以潜在地对细胞产生影响。与BAXS平台的当前配置,则很难有一个实验,将机械刺激的细胞或组织在数天作为其中的细胞和组织中被淹没的缓冲器必须是supplem ented液体随着时间的推移。在当前设置中,蒸发速度为约0.9毫升/小时从25毫升HBSS缓冲溶液的初始体积。目前的设置是非常适合短期实验。来执行可靠的细胞和组织的拉伸实验在较长的时间周期,两个加法如下提示:1)一个流体系统用于保持缓冲量,以及2)增加了一个商用或家用内置培养室包围了整个系统,以便维持恒定的湿度和温度,并提供5%/ 95%CO 2 /空气的气氛。关于拉伸血管组织的选择,以上描述的设置允许我们测量的小口径血管的僵硬。使用引脚与适当的直径,以确保他们不会拉伸变形过程中是很重要的,但小到足以放进血管腔。不考虑这个细节纳入考虑可能在组织的变形测量​​误差引入。

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在生物体内,组织包埋的细胞暴露于机械力和张力变化在空间和时间,而且更重要的是它们往往多轴向。一个很好的例子是血管壁的响应血流动力学势力的力学行为。局部血液动力学力28-30用在一个复杂的机械的微环境,它公开内皮细胞和血管平滑肌细胞以复杂的多轴向的和环状的应变场血管组织13,14,16,27结果的各向异性特性的组合。虽然现有的细胞拉伸实验,极大地促进了机械传导和力学生物学的基本认识,他们传统上依靠理想化的单轴或相等双轴应变场不复重现体内应变场8-10,19,29,31-34 。该BAXS平台允许各向异性的双轴细胞与同步直播-CEL拉伸升显微镜。以控制沿两个正交方向的基板的变形的能力使我们可以完全控制的应变场。这使得生产除了简单的单轴和等双轴应变场复杂的应变场。此外,该平台允许动态相同的拉伸试验中改变应变场的方向。

集成了模块化和定制夹紧系统的选项打开了可能性使用单一平台上伸展许多应用在细胞力学生物学与组织力学。例如,用适当的夹紧系统13,27,该平台可以进行生物体组织的平面单轴和双轴拉伸试验。以这种方式,任何组织,切成长方形或正方形形状的机械性能,可沿在一个实验中两个正交轴线量化。此外,在执行组织学一nalyses机械性刺激后,可以揭示组织拉伸引起的结构变化。扭转也是机械负荷的肌肉组织中一个非常重要的类型和韧带35。该平台提供了设计的夹紧系统,可以诱发左右旋转拉伸轴产生一个组合的机械负荷,涉及扭力和拉力的潜力。另外,也可以以评估大口径血管与适当的安装销。研究细胞反应以下的机械变形也正在紧张调查。该BAXS平台提供不断变化的同样的实验,除了允许同时成像中的方向和应变场的复杂性的独特功能。重要的是,显微镜的多模态的形式仍然是可能的,因为平台不与显微镜的光轴干扰。这是一个重要的功能,因为在结构和生化活细胞的反应,机械ðeformation可以被测量。综合来看,BAXS平台设计具有几个重要的功能,促进其使用的单细胞和整个组织的实验。通过采用模块化的夹紧系统和加法最多四个可能的负载单元,该BAXS平台可用于多种实验。本文给出了实验两个例子的细节;然而,该系统的模块化和灵活性可以进一步利用在亚细胞,细胞和整体组织尺度研究力学生物学的许多不同方面。

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Disclosures

作者宣称,他们有没有竞争的财务权益。

Acknowledgements

DT是由乐全宗去RECHERCHE魁北克 - 自然等技术(FQRNT)和MITACS升降式战略奖学金博士后奖学金支持。 CMC是由乐全宗去RECHERCHE恩桑特魁北克(FRSQ)和欧内斯特并从渥太华心脏研究所大学玛格丽特福特心脏病学赋研究奖学金博士后奖学金支持。 EOB被授予经营从加拿大卫生研究院(CIHR)MOP80204,并从心T6335和中风安大略基金会的支持。该CIHR及美敦力公司共同提供平等机会条例草案与同行评审的研究主席(URC#57093)。 AEP是由自然科学和工程研究理事会(NSERC)发现格兰特,一个NSERC Discovery Accelerator的补充资金,并衷心感谢加拿大研究主席(CRC)计划和安大略省的早期研究者奖的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PDMS Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG The ratio base to cross-linker used in this protocol is 20:1. Mix in a laminar hood to keep dust from contamining your 
FluoSpheres fluorescent microspheres Invitrogen F8810 Keep away from light.
Linear voice coil Moticont LVCM-051-051-01 The motro comes in two pieces (magnet and coil). It has to be mounted on a ball bearing sytem to be functional.
Ball bearing slide Edmund Optics NT37-360 Miniature and Small Linear Motion Ball Bearing Slides
Linear positioning stage Edmund Optics 38-960 Center Drive 1.25" Square Linear Translation Stages
Optical encoder GSI microE systems Mercury II 1600S - 0.5um resolution reflective incremental encoder.
Motion controller Galil DMC-2143(DIN)-DC48 with AMP-20440 4 axis controller with a 4 axis amplifier
Load cell Honeywell 31 low miniature load cell with a range of 0-150 g
Insect minutiens pins (0.20 mm) Pin Service Austerlitz Insect pins Stainless steel pins that are bended in an opened triangle shape
SU-8 2050 Micro Chem SU-8 2050 Permanent epoxy negative photoresist. Keep away from heat and light
Air-plasma treatment system Glowresearch Autoglow Oxygen Plasma System
Rat-tail collagen Invitrogen A10483-01 Collagen I, Rat Tail 5 mg/ml
Hoechst 33342 Invitrogen R37605 DNA-specific fluorescent dye. Keep in the fridge.
Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters omega.ca KHLV-0504/(10)-P 28 V flexible heaters; can be supplied with a 24 V
1/16 DIN Autotune Temperature and Process Controllers omega.ca CN63200-R1-LV Temperature controller; supply 24 V.
DMEM culture medium Hyclone SH3024301 Dulbecco’s Modified 30 Eagle Medium. Keep at 4 °C
Penicillin-Streptomycin Hyclone SV30010 Keep stock frozen. Keep working solution at 4 °C.
Fetal bovine serum (FBS) Hyclone SH3039603C Keep frozen.
Trypsin 0.05% Hyclone SH30236.02 Keep frozen. Digestion of cell attachement proteins for subcultivation
Hepes Wisent Inc 330-050-EL HEPES-buffered salt solution 
NaCl Fisher Scientific BP358-1 HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
KCl Fisher Scientific BP366-500 HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
MgSO4 Fisher Scientific M65-500 HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
CaCl2 Fisher Scientific C614-500 HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
Dextrose Fisher Scientific BP220-1 HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
NaHCO3 Fisher Scientific BP328-1 Krebs physiological solution
KH2PO4 Fisher Scientific BP362-500 Krebs physiological solution
Carbogen 95% O2/5% CO2 Lindle DIN:02154749 Krebs physiological solution oxygenation
Nocodazole Sigma M1404 Microtubules depolymerization agent
Cytochalasin-D Sigma C8273 Actin filaments depolymerization agent
Anti-α-SMA-FITC Sigma F3777 Used to stain and quantify smooth muscle cells content
Picrosirius red stain Fluka 43665 Used to stain and quantify collagen content

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