細胞および組織メカノでのアプリケーションのためのプラットフォームをストレッチ小説

1Centre for Interdisciplinary NanoPhysics, Department of Physics, University of Ottawa, 2University of Ottawa Heart Institue, University of Ottawa, 3Libin Cardiovascular Institute of Alberta, University of Calgary, 4Department of Biology, University of Ottawa, 5Institute for Science, Society and Policy, University of Ottawa
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

我々は、この資料に複雑な異方性軸の機械的変形に単一細胞応答を調査し、生物学的組織の機械的特性を定量化するために使用することができる新規な延伸プラットフォームを提示する。

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Tremblay, D., Cuerrier, C. M., Andrzejewski, L., O'Brien, E. R., Pelling, A. E. A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology. J. Vis. Exp. (88), e51454, doi:10.3791/51454 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

細胞や組織、またはそれに機械的な力の適用は、生体組織の機械的特性を定量化することができるためのツールは、基本的なメカノの理解に劇的に貢献してきた。これらの技術は、広く様々な疾患の発症および進行を頻繁に機械的な手がかりの影響を受けているかを示すために使用されている。この記事では、機械的に、単一の細胞を刺激するか、組織の機械的剛性を定量化するか多機能二軸延伸(BAXS)プラットフォームを提供します。 BAXSプラットフォームは独立して制御することができる4つのボイスコイルモータで構成されている。単一細胞ひとつ、複雑な動的、および空間的に変化する歪み場に細胞を露出することを可能にモータに取り付けることができるフレキシブル基板上に培養することができる。逆に、力ロードセルを組み込むことによって、人はまた、それらが変形サイクルにさらさ​​れているように、一次組織の機械的特性を定量化することができる。両方の場合において、クランプの適切なセットを設計しなければならないし、しっかりとフレキシブル基板または目的の組織を保持するためにBAXSプラットフォームモータに取り付けられた。 BAXSプラットフォームは、延伸実験の間、試料の構造的または生化学的反応を調べるために同時の透過光および/または蛍光イメージングを実行するために倒立顕微鏡に装着することができる。この記事ではBAXSプラットフォームの設計と使用法の実験の詳細を提供し、単一の細胞や組織全体の研究の結果を提示します。 BAXSプラットフォームは、歪みを基板へと単離したマウス大動脈の剛性を測定するために応じて、単一のマウス筋芽細胞における核の変形を測定するために使用した。 BAXSプラットフォームは、細胞内、細胞および全組織レベルでの新たなmechanobiologicalな洞察を提供するために、様々な光学顕微鏡法と組み合わせることができる汎用性の高いツールです。

Introduction

機械的な微小環境は、組織の発生及び恒常性にし、また疾患1-6に大きな影響を与えるような、増殖、遊走、および分化のような多くの細胞機能において重要な役割を果たしている。長年にわたって、多数の実験的なツールは、機械的に細胞または組織を刺激し、基本的なメカノの我々の理解を高め、疾患6-17の発症および進行を研究することを目的として生体組織の機械的特性を測定するために使用されてきた。しかし、一つは、多くの場合、特定の研究の目標を達成するために、いくつかの異なる実験のデバイスに依存しなければならない。この記事では、機械的特性や機械的な力を全組織長さスケールに細胞内で生物学に果たす役割を調べる研究を可能にし、単一の、多機能、二軸延伸(BAXS)プラットフォームを提供します。 BAXSプラットフォームはquantificatioのためにできるだけでなく単離された組織の機械的特性のn個ではなく、単純に適用する能力を容易にし、複雑で、動的歪み場すなわちインビボで起こる延伸への応答を理解するために、生きた細胞である。 BAXSプラットフォームは、細胞や組織に機械的試験と摂動中に生細胞顕微鏡を実行する能力を維持している。

BAXSプラットフォームは、細胞レベルでの基板変形の影響を調査し、生物学的組織( 図1A)上に引張試験を行うために使用することができる特注の装置である。アルミニウムヒーターは、標準的な10cmのペトリ皿を収容し、温度制御器およびカプトンヒーター( 図1B)を用いて、37℃で、任意の生理学的溶液を維持するように作製した。このBAXSプラットフォームは、倒立位相差顕微鏡および/ ​​または蛍光顕微鏡上に集積し、同時イメージング( 図1C)を可能にすることができる。要するに、BAXSプラットフォームは、可動部品が直交する二軸( 図1D)に沿って配向されたスライド軸受ミニチュア直動ボールに搭載された4本の直線状のボイスコイルモータで構成されている。線形位置決めステージ( 図1E)に使用されるクランプシステムの垂直移動を可能にするために4つのモータのそれぞれに取り付けられている。各モータの位置は、500nmの分解能( 図1F)を有する光学式エンコーダによって監視される。すべての4つのモータは、独立して動作コマンド( 図1G)を実行するための光学エンコーダフィードバックを用いたモーションコントローラで制御される。 LabVIEWのインターフェースは、細胞または組織試料の、完全にカスタマイズ可能な静的および動的変形を生成するために、変位量、速度、及び各モータの加速度を完全に制御できる。

細胞における変形を誘導するために使用される技術は、単にallowinにより達成されるG細胞は、しっかりと柔軟で透明基材に付着した後、BAXSプラットフォームの4つのモータを使用して、この基板を延伸。 BAXSプラットフォームは、ボイスコイルモータ基板を取り付けるクランプのいずれかのカスタム設計されたセットの装着を可能にする。この目的のために、我々は、ポリジメチルシロキサン(PDMS)からなる可撓性透明基板は、( 図2A-C及び図3)を結合させることができるクランプのセットを設計した。クランプは生理学的溶液に暴露されるように、すべての部品は、滅菌を可能にするために、ステンレス鋼から機械加工した。これらのクランプは慎重に( 図2D)が延伸中に基板へのストレスを最小限に抑えつつ、画像品質を向上させるために顕微鏡対物レンズにできるだけ近接して基材をもたらすように設計されている。

同じBAXSプラットフォームは、ADAPとクランプの適切なセットを用いて、小さな組織試料の剛性を定量化するために使用することができるテッドは軍を監視するための組織サンプルとロードセルのためサポートしています。いくつかのアプローチがBAXSプラットフォームモータに組織をマウントするために撮影することができます。この場合には、ステンレス鋼昆虫minutiensピンは、引張試験( 図4A-B)を実行するために、血管組織の開口部を通してフックできる。代替的に、自然の開口部のない厚さの組織について、組織の縁部は、いずれかのボイスコイルモータに取り付けられた、または生物学的接着剤の小さなガラススライドに接着し、クランプでモータに取り付けられたクランプを所定の位置に保持することができる。引張りを行うために、小型ロードセルが必要とされるテストし、容易にBAXSプラットフォームモータに組み込ま延伸サイクル( 図4C)の間に組織に作用する力を測定するために使用することができる。 BAXSプラットフォームは4つのモータから構成されているように、第二のロードセルの導入は、いずれか2つの直交方向に沿って引張試験を行うことができる。この能力は、1がquantifすることができますYと同じ実験中の2つの垂直な方向に沿った単一組織の機械的剛性。

重要なことに、すべての構成で、目的の細胞または組織サンプルは、常にユーザがアクセス可能な恒温槽内に維持される。この能力は、試料の時間応答を調べるために、延伸試料中の薬理学的物質の導入を可能にする。倒立顕微鏡の光軸が遮られないままであるさらに、顕微鏡のすべての形態は、まだユーザーが使用できる。 BAXSプラットフォームのすべての4つのモータが独立しているように、最終的に、関心対象の試料に高度に構成可能な歪み場を適用することが可能である。 インビボ細胞および組織が ​​暴露された複合体とは対照的に、それはこのプラットフォームでは、より適切に模倣することができる延伸異方性伝統的な一軸延伸プラットフォーム7,13,15,18,19へ。また、物理的特性歪み場の実験中にオンザフライで変更することができる。これらの能力は、ユーザが時間的に非常に複雑な、異方性の広い数、および空間的に変化する歪み場に対する細胞および組織レベルの応答を調べることを可能にする。この記事では、利点と制限BAXSプラットフォームのだけでなく、その設計、動作原理、および単一セルおよび全組織実験のための実験の詳細を説明しています。

図1
図1。BAXSプラットフォームの概要。 37℃Cで細胞および組織を維持するために使用ペトリ皿加熱ヒータのA)は、4つのボイスコイルモータを示すBAXSプラットフォームの上面図である。B)詳細ピクチャ)プラットフォームは、ライブを実行するために倒立顕微鏡に装着することができるストレッチ実験中の細胞イメージング。D)ボイスコイルモータの詳細な絵;プラットホームの可動部分。E)クランプシステムの垂直方向の変位を可能にする線形位置決めステージの詳細な絵。F)モーションコントローラにモータの実時間位置を提供する光学式エンコーダの詳細な絵。G)詳細画像4つの音声コイルモータ、4つの光エンコーダ入力および電力出力を示すモーションコントローラ。

図2
図2。実験を伸ばすセル用のクランプシステム。基板は、そのアンカーfeaturとクランプの円筒部に巻き付けられる。C)を延伸するためのボイスコイルモータにPDMS基板を取り付けるために使用されるクランプの詳細を示すAB)の画像ES上部の溝に座って。次いで、基板を上部溝に特徴をアンカー/基質をプッシュ止めねじを用いて固定されている。クランプが所定の位置に基板を保持するとともにBAXSプラットフォームのD)イラストレーション。挿入図は、それだけでカバースリップと顕微鏡の対物レンズの上に座っているに付着した細胞を有する基板の詳細図を示す。

図3
図3膜及びそのクランプシステムの部品表。細胞延伸実験を行うために二軸プラットフォームに集積主要部の寸法を示す図面。

図4
図4。例クランプシステムの小口径血管の剛性評価のためのクランプシステムの十分。AB)の詳細な写真は直径1mm、マウスの大動脈の変形を誘導するために使用。ステンレス製のピンを慎重に船が両方のピンにスライドすることができるように、オープン三角形に成形した。固定されたモータと左クランプとの間に取り付け、容器とロードセルを保持するクランプを備えたBAXSプラットフォームのC)のイラスト。挿入図は、ピンの上に取り付けられた容器の詳細な平面図を示している。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

単一細胞の1。機械的変形

  1. 組み込み蛍光ビーズとPDMS基板の作製
    基板の製造の前に、水溶液中の蛍光マイクロスフェアは、その疎水性の性質に起因PDMSにおけるビーズ混合を促進するためにイソプロパノール中に再懸濁する。
    1. ピペット10分間16200×gで1.5 mlのマイクロ遠心チューブと遠心分離機への蛍光マイクロスフェアの500μL。
    2. 上澄み液を捨て、ボルテックスの5分で、その後のイソプロパノール500μlを添加する。堆積物に任意の大きな粒子の凝集を可能にするために暗闇の中で一夜放置バイアルを置きます。
    3. 翌朝、慎重にきれいな微量バイアルに上清を除去。このビーズ溶液を5つ以上の基板を製造するために使用することができる。注:ビーズ溶液は、次の3日間、沈降していきます。ペレットを再懸濁ないように注意してください。
    4. 提供硬化剤0.5グラムを注ぐ1.5mlのマイクロバイアル中のPDMSキットは、科学的なバランスを使用した。連続した工程により、各添加間の1分間ボルテックス、(6 15μlの添加で)ビーズの90μlの合計を追加します。置いておきます。
    5. PDMS 10gを秤量し、蛍光ビーズを補充した硬化剤0.5gを、少なくとも12分間混合する。
    6. 製造者の指示に従って標準的なフォトリソグラフィ技術を用いてSU-8 2050断面形状の金型を製作する。使用した金型は、320μmで13.4 cm 2で( 図3)の領域の高さを有している。金型は428μLまたはPDMSの440ミリグラムを含むことができます。
    7. 80℃で2時間、トランスファーピペットおよび硬化を用いたクロス形状の金型内にビーズをPDMS 400mgの流動硬化後、金型( 図5A)から基板をはがし。基板は、その機械的特性の有意な変化を示すことなく2週間室温でペトリ皿に維持することができる。 直径約4mmの最終的な大きさのペトリ皿に80℃( 図5B)で2時間逆さにそれらを治す:PDMSの滴(1:20の比率で、PDMS硬化剤)を注ぐ。これらの機能は、アンカー週間ペトリ皿に保つことができる。注:硬化プロセス中に平坦化から落下しないように逆さまにお皿を維持します。
    8. エアープラズマトリート(30 Wで30秒)基板および8アンカー機能。基板( 図5C)上に存在する正方形のくぼみから4ミリメートルの距離で基板の両端に機能的に結合する。
  2. クランプ上に膜を取り付け
    1. クランプの溝付き円筒部の周囲の基板のそれぞれの端部を包み、上から2止めネジ( 図2B及び図5D-E)で固定します。
    2. クランプホルダーに4クランプをねじ込み、使い捨てのTを使用して、PDMS(比率1:20)注ぐ基板とクランプの溝付き円筒部との界面での順伝達ピペット。 1.5mmの六角レンチを使用して、溝付き円筒部の周囲に、未硬化のPDMSを広げた。
    3. 完全に毛細管現象によって充填され、2時間後( 図5F)、80℃でアセンブリを治すまで溝に、PDMS(1:20)注ぐ。
  3. 膜上で細胞を播種
    1. エアープラズマトリート(30 Wで30秒)コラーゲンコーティングを可能にするために基板を殺菌し、機能化、アセンブリ全体。
    2. 細胞を、1時間室温でラット尾部コラーゲンの16μg/ mlのを補充した0.02 M酢酸1mlで播種される基板の面積を官能。所望の最終コラーゲン濃度は、5μgの/ cm 2である。
    3. リン酸緩衝液で基板3回すすぎ、それは、室温で乾燥を少なくとも10分間のためにしてみましょう。
    4. 10%ウシ胎児干せるを添加した培養培地を40μl加えmおよび1cm 2の (セル密度:20細胞/ mm 2)の面積を覆うように基板の中心部に2,000細胞を含有する1%ペニシリン-ストレプトマイシン。細胞密度は、実験の要件に応じて変更することができる。
    5. 基板は、その上に細胞を含む培養液滴の上にして、標準的な細胞培養インキュベーター内で、アセンブリ全体を置きます。注:アセンブリは、細胞がしっかりとそれを添付することを可能にするために、少なくとも3時間、上に向けて基板を保持する必要があります。蒸発を防ぐために、暖かい培養培地の30μlを、基板上の液滴で3時間毎に45分間に添加する。
    6. 3時間後、基板を浸して、細胞が増殖することを可能にするために一晩インキュベートし、新鮮な培養培地で満たされたペトリ皿に、アセンブリ全体を反転させる。
    7. 次の日、HEPES緩衝塩溶液(HBSSを準備し、ヘペス、NaClを120 mMの塩化カリウムの5.3mmで、 硫酸マグネシウムの0.8 mMのCaCl 2を 1.8 mmであり、デの11.1 mMと20 mMのxtrose)。 pHを7.4に調整する。 NOTE:HBSS溶液を毎日調製し、実験の間37℃に維持されなければならない。この生理学的溶液を、正常組織/血液の環境を模倣することによって、顕微鏡ステージ上の細胞を維持するために使用される。
    8. 倒立位相差または蛍光顕微鏡マウントBAXSプラットフォームおよびモータのクランプ基板アセンブリ上のセットアップをマウントします。 HEPES緩衝液( 図2D)でシャーレヒーター内部のペトリ皿を埋める。

小口径血管の2。剛性測定

  1. 準備
    1. クレブス生理的溶液:118.1のNaCl、11.1 mMのD-グルコース、25 mMの炭酸水素ナトリウム、4.7のKCl、1.2のMgSO 4、1.2mMのKH 2 PO 4、および2.5mMのCaCl 2の溶液を調製する。 pHを7.4に調整し、30分間カーボゲン医療ガス(95%O 2/5%CO 2)で溶液に酸素。注:クレブスsolutiには、実験中毎日調製し、37℃に維持されなければならない。この生理学的溶液を、正常組織/血液の環境を模倣することによって生きている組織を維持するために使用される。
    2. 外科はさみ、曲がったピンセット、マイクロはさみ、外科解剖顕微鏡、50ミリリットルのポリプロピレン遠心管、および10ミリリットル血清学的ピペット:解剖と大動脈血管の機械的な評価のための計測機器を収集します。外科的および実験手順は、任意の無菌状態を必要としません。あらかじめロードセルとともにBAXSプラットフォームのクランプを取り付けます。
  2. 組織分離と解剖
    実験動物に関連するすべての実験手順は国の利用者の実験動物の管理と使用に関する健康ガイドに準拠機関、「利用者の動物実験委員会によって承認されなければならない。
    1. 99パーセントのCO 2の吸入(7 PSI)で、マウスの安楽死を実行するプレキシグラス室( 図6A)内。
    2. 開いたマウスの腹部とマウスを出血する胸部大動脈を切った。
    3. 横隔膜、胸郭および肺葉( 図6B)を取り外します。注:組織を損傷する危険性を最小限に大動脈に装着心を保ち、直接容器に触れないように、心臓を使って操作します。
    4. そっと容器と背骨の間切断することにより、心臓、大動脈根および胸部大動脈を削除します。注:完全な組織( 図6C)の内部構造を維持するために、切除の際に容器内のいずれかの伸長を誘導しないでください。
    5. すぐに浸すとクレブス液中の心臓と大動脈を保つ。
    6. カットして慎重に血の塊を取り除くためにクレブス液中に大動脈を洗う。マイクロハサミ、ピンセット、外科解剖顕微鏡( 図6D-E)を使用して結合組織を除去します。注:すべての血管長を保持し、AORを使用容器の向きを決定するために、TICルート。
  3. 血管寸法判別の取付け
    容器の剛性を決定するために、アンロードされ、容器の寸法は必要とされ、較正された顕微鏡を用いて決定することができる。
    1. 長さ約2mmの大動脈輪を切断して、正確に( 図6F-G)を設定するキャリブレーション顕微鏡を用いて、長さを測定します。クレブス液中にわきこのセグメントを置く。
    2. 2ミリメートルのセグメント( 図6F)の各々の間の可能な限り小さく、他の大動脈のリングをカット。ルーメンを上にして顕微鏡スライドガラス上にこの小さなセグメントを入れて、校正された顕微鏡の設定( 図6H)を使用して、壁の厚さを測定します。
    3. クレブス溶液でBAXSプラットフォーム上でペトリ皿を記入します( 図4(c)に挿入図)引っ張ってピンの2ミリメートルの大動脈リングセグメントを挿入します。

GE = "常に"> 図5
図5。PDMS基板の製造および硬化の後、A)を搭載 、基板を慎重に、SU-8 2050金型から剥離し、シャーレに脇に置くされています。) は、PDMSで作られた機能を係留し、基板を固定するのに役立つクランプ4に搭載された基板の基板は、次いで、クランプホルダに取り付けられているクランプ4、(挿入図を参照)に取り付けられている。D)を取り付けるための準備機能を有する固定クランプ。C)基質。E)詳しい画像。F基板の下の溝に、PDMSを注ぐの)手順。矢印は、ゆっくりと、毛細管現象により溝を埋めるPDMSを示しています。

454fig6highres.jpg "幅=" 500 "/>
図6。準備および胸部大動脈の単離A)の縦方向の腹部切開を通して手術器具や安楽死マウス。B)を製造、胸郭および肺のLOBが削除されます。C)大動脈を慎重に操作するために心を用いて除去される組織。D)に心臓と大動脈をクレブス生理的溶液に入れられる。大動脈は、すべての結合組織を除去して洗浄される。E)心臓および大動脈を示す詳細な絵。F厚さ測定に使用される小さなセグメントに沿って剛性評価のために使用される)大動脈セグメント。GH)正確な長さ(G)及び厚さ(H)各血管セグメントは、逆顕微鏡および分析プログラムを用いて評価される。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

細胞体を伸ばす

BAXSプラットフォームは、25%の基板変形に露出シングルマウス筋芽細胞(C2C12)における核の機械的応答を調べるために使用した。筋芽細胞は、筋肉組織に見出され、常に生体内で機械的伸張および圧縮に曝される。細胞核の形状及び機械的特性は、遺伝子発現および転写活性20,21の制御に、また、発達障害や、ハッチンソン-ギルフォード早老症症候群(HGPS)、エメリー等の種々の疾患において主要な役割を果たすことが示されている·ドレフュス型筋ジストロフィー(EDMD)、拡張型心筋症、早期老化やがん22〜25。そのため、外部の機械的微小環境からの力が核の構造と機能をどのように影響するか理解することは、極端な関心事である。 BAXSプラットフォームは、マイルからの力の伝達を調べたその長又は短軸に平行な基板を延伸することにより核にcroenvironment。 図7A-Fは、2つの直交する方向に沿って基板の変形を誘発するためのプラットフォームの機能を示している。また、BAXSプラットフォームは、等軸ひずみ場の標準単軸に加えて、基板内の複雑な歪場を誘導することができる。7G-Hは 、私たちが生産するかできるように、2つの直交方向に沿ってひずみ場の独立制御が提供する柔軟性を示している標準(圧縮)または純粋な(非圧縮)の一軸歪み場。 BAXSプラットフォームはわずかに標準一軸延伸( 図7H中にこの方向に沿って基板の圧縮を補償するために存在する方向( 図7G)を延伸プリンシパルに垂直な方向に基板を引っ張ることによって、純粋な一軸性ひずみ場を生成することが可能である)。

常に ">" =キープtogether.withinページFO」ntent 図7
図7。標準および一軸延伸純粋な実行からの変位·変形の関係の最大伸びを横(Cに沿って到達するまで。A-B)蛍光ビーズを手動でビデオの最初のフレームに選択され、他に1フレームから追跡さ)、縦(D)方向。 MATLABスクリプトは、自動的にフレームごとにグリーンひずみテンソルの成分を計算し、27をな変位運動に対するひずみの検量線を作成します。EF)青と赤のラインが水平に沿って緑のひずみテンソルのコンポーネントに対応し、 x軸に沿って4ミリメートル同一基板を延伸し、わずかに沿って延伸それぞれ上下方向。G)(赤でハイライト)1.5ミリメートルによってY軸が基板無し圧縮変形して、純粋な単軸フィールドを生成します。垂直軸に沿って基板の端部)は赤色で強調表示(固定されている場合H)3.5ミリメートルx軸に沿って基板の伸縮25%の変形と7%の圧縮変形を生じる。

延伸時の生細胞顕微鏡イメージングを実行する機能と、核DNA(ヘキスト33342)に特異的に結合する生細胞蛍光色素で染色した。一般的に、C2C12細胞は、メジャーとマイナーの軸と楕円形の核を有する。まず、細胞を、メジャーまたはマイナー核軸が水平延伸方向に平行に配向された同定された。各延伸サイクル( 図8A-I)の間で変形していない変形核の画像を取得しながら、この時点で、細胞をそれぞれの直交延伸軸に沿って25%延伸した。このように、我々は核の変形能を評価することができ正確に制御された基板変形下でのメ​​ジャーとマイナーの軸に沿って。 Ovuscule、ImageJのプラグインは、メジャーおよびマイナー核軸の長さを決定するために使用した。これらの長さは、変形していない状態の中に記録された核を順次、その長軸と短軸( 図8G-I)に沿って延伸したとき。その短軸および長軸に沿って核の変形を計算するために、延伸·未変形状態での各軸に沿った長さの相対的変化を計算した。

εは変形であり、L 1は変形し、長さであり、L 0は変形されていない長さです。

それは3.0(その主軸と比較して(6.3±1.1%)をその短軸に沿って顕著に高い変形能を表示するように、C2C12における核の変形性、機械的異方性を示す77; 0.6%)( 図8J)。加えて、我々はまた、核変形能を調節するアクチンおよび微小管細胞骨格の役割を調べた。これは、それぞれ、サイトカラシンDおよびノコダゾールを用いて選択的にアクチンフィラメント又は微小管を脱重合することによって達成された。アクチンフィラメントを解重合または微小管は、核( 図8J)の異方性変形能の喪失を誘導することが見出された。これらの結果は、細胞骨格の構成要素が基板から核に力を伝達し、また、変形25の間に核の自然な機械的挙動を維持するために不可欠であるとの調査結果を支持している。

図8
図8。プロトコルと核変形能を伸ばす。交流)STREの模式図その核と単セルの手引きプロトコルは、水平方向に配置。細胞の位相コントラスト画像(DF)及びエピ蛍光画像(GI)は、DNA特異的蛍光色素で染色した。この画像シーケンスは、同一のセルは、直交変形場に露出される典型的な細胞延伸実験を示す。スケールバーは25μmである。J)C2C12は長軸よりもはるかに多くを変形させる短軸を有する異方性の核変形能を示しています。アクチンや微小管奪わ細胞(CYT-Dおよびノコダゾール、それぞれ)で、この異方性が消えます。全ての条件において、核変形が25%の下で基板変形ゼロと有意に異なっている。 ** p値<0.01、対応のあるt検定。 ††p<0.01、†††p値<0.001、1標本t検定。

容器の剛性評価

T ">最近、私たちのグループは、慢性の効果を調べ過剰発現熱ショック、アテローム性動脈硬化症を起こしやすいマウスモデルにおける大動脈プラークの形成にプロテイン27(HSP27のO / E)の(アポE - / - )。26我々 HSP27は、プラーク脂質およびマクロファージの存在量を減少させ、内膜平滑筋細胞およびコラーゲン含有量( 図9A-B)を増加させるアテロームタンパク質として作用することが示された。容器機械的特性に対するこの組織リモデリングの影響を決定するために、BAXSプラットフォームが使用された大動脈の剛性を測定する。

図9Cは、大動脈リングの伸び引っ張りからの典型的な応力-ひずみ曲線を示す。剛性を定量化するために、増分弾性率は、30%の変形における応力 - ひずみ曲線から計算した。剛性は、曲線の接線の傾きである。 BAXSプラットフォームモータの一方、displacemeの同時取得にロードセルを導入することによってntの力データが可能である。変位力曲線を各大動脈輪の変形前の寸法に基づいて応力 - ひずみ曲線に変換した。応力およびひずみは、次の式を用いて計算される。

εは変形であり、L 1は変形し、長さであり、L 0は変形されていない長さであり、Sはストレスで、Fは力であり、0は荷重下組織の変形されていない領域です。大動脈輪の特定の場合においては、変形していないエリア(0)がリング時間セグメントの長さの厚さの2倍である。

各試料を許可する最初の11サイクルと12サイクルの間、50ミクロン/秒の変位速度で40%の最大変形に周期的に変形していた組織のプレコンディショニング、ラデータ収集のためのST 1。 - / - 、HSP27のO / Eマウス (62.8±3.0 kPa)で大幅にアポに比べて41%増加した-私たちは、アポEの大動脈セグメントの剛性があることを発見/ -コントロールマウスモデル(44.4±3.8キロパスカル)( 図9D)

一緒になって、血管プラーク組織学と組み合わせ機械的評価は、HSP27の過剰発現が増加した血管の剛性およびコラーゲン/平滑筋細胞含有量によって特徴付けられることを実証した。これらの結果は、HSP27が潜在的にアテローム硬化性病変の安定性を増加させるので、プラークの破裂の危険性を減少させることが示唆された。

図9
図9。過剰発現血管剛性にHSP27の効果。我々は、HSP27は組織学的部品を変更したことを示したおよびコラーゲン含有量(B:ピクロシリウスレッド染色):内膜平滑筋細胞(抗-α-SMA A)を増加させることによってアテローム性動脈硬化病変のsition。剛性が30で計算される大動脈血管延伸から得られたC)典型的な応力-歪み曲線株の%。剛性は、曲線の接線(赤線)の傾きであるD)の過剰発現は、HSP27の慢性制御apoEの比較の血管剛性増大- / -マウスモデル(D)を 。スケールの(A)のバー(B)は 40μmでインセットでの400μmの商標です。 Lは=ルーメン、I =内膜、点線はメディアの輪​​郭を描く。 * p値<0.05、一元配置分散分析。 *** p値<0.001、一元配置ANOVA。 Cuerrier 26の作品から適応図。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ここで紹介するBAXSプラットフォームは、組織全体に対する単一の細胞の調査から、メカノの研究に多くの実験を容易にします。また、プラットフォームは、多数の機械的刺激実験や多軸引張試験を可能にし、非常に柔軟で設定可能です。プラットフォームはまた、生理学的条件下で細胞および組織の維持を可能にし、延伸実験の間、同時顕微鏡検査を可能にする。取り付けクランプの適切なセットを使用するときに、前のセクションで説明2の実験はBAXSプラットフォームの汎用性を示しています。モジュラーとカスタマイズ可能なサンプルマウントシステム、光アクセスおよび追加のセンサ(例えば、ロードセル)を追加する可能性が、実行されるべき実験の追加のタイプのための多数の可能性を開く。

上記のプロトコルが実行されなければならない多くの重要な手順が含まれていますdequately最良の結果を生成するために。プロトコルを伸ばし、細胞内では、クランプに上のPDMS基板をマウントする繊細で正確な操作が要求されます。 PDMS基板はよく延伸時の基板の不要な横方向の動きを回避するために、4のクランプに対して中心なければなりません。このような横方向の動きは、実験を延伸時の細胞の追跡が困難になります。また、基板は、インキュベーター内で上を向いている細胞播種時の培養培地の液滴の蒸発を監視することが重要である。インキュベーターのドアが処理中に開かれた頻度に応じて、蒸発速度が変更できます。容器延伸プロトコル内で、最も重要な工程は、試験される試料の大きさの測定値である。これらの寸法は、彼らは組織の硬さの計算に関与しているため、結果に直接影響を与えるように、可能な限り正確でなければなりません。同一人物を有する容器dを実行するimension測定は、サンプル間のばらつきを低減するのに役立つであろう。

セル引き伸ばし実験中にPDMS基板を引っ張るために使用するクランプの製造には、いくつかの開発サイクルを含んだ。クランプの最初のバージョンは、円筒状の部分( 図2B)の底部に位置するアンカーの溝がありませんでした。この溝なしで、基板は、経時的に基板変形の有意な変動性を誘導する、円筒部に沿って滑っ。溝の存在、硬化PDMS( 図5F)を追加することで、基板はもはやスリップません。この実験は、時間の経過とともに基板内に一定の変形を生成します。組織が適切なロードセルを選択する、実験を延伸するためにも非常に重要である。ここで使用されるロードセルは、ここで試験試料に適しており、低負荷域(〜150 g)を有する。体の測定のために必要な非常に敏感ロードセルuring少量の試料に力を引っ張ることにより、ノイズ(S / N)比が比較的低いシグナルを有していた。 S / N比を向上させるので、解像度を向上させるために、ロードセルは、電気的に、ボイスコイルモータやプラスチックネジとスペーサーを使用して、任意の金属部品から単離した。このようにして、0.03グラムの分解能で高いS / N比が得られた。軟らかい試料について、より低い範囲のロードセルの使用は、高解像度を維持するために推奨される。

現在、BAXSプラットフォームの主な制限は、時間の経過とともにHBSS緩衝の蒸発による実験を伸ばし、長期的に実行する機能です。水の蒸発は、潜在的に細胞に対する効果を有することができる溶質濃度を増加させる。 BAXSプラットフォームの現在の構成によれば、機械的に細胞および組織が浸漬されたバッファがsupplemなければならないとして日間にわたって細胞または組織を刺激する実験を持たせることが困難である時間をかけて、液体で取得済み。現在の設定では、蒸発速度は、HBSS緩衝溶液25mlの初期体積から約0.9ミリリットル/時間である。現在の設定は、短期的な実験に最適です。長期間にわたって実験を延伸信頼性の細胞および組織を実行するために、2つの加算が提案されているバッファボリュームを維持すること、および2)組み込み目的または家庭インキュベーターチャンバーの添加は、システム全体を囲む1)流体システム維持するために一定の湿度、温度および5%/ 95%CO 2 /空気雰囲気を提供する。血管組織を延伸するオプションについては、上記の設定は、私たちは小口径血管の硬さを測定することができました。それは彼らが延伸中に変形しないことを確認するために、適切な径のピンを使用することが重要であるが、血管内腔に収まるほど小さい。考慮にこのディテールを取っていないと、組織の測定された変形で不正確さを紹介することができます。

"ve_content>

インビボ、組織埋め込まれた細胞を、空間的にも時間的にも変化する機械的な力とひずみにさらされるが、より重要なことは、多くの場合、多軸であるている。良い例が、血行動態力に応じて血管系の壁の機械的な動作です。複雑な多軸及び環状ひずみ分野に内皮細胞および血管平滑筋細胞を公開する複雑な機械的微小環境における血管組織13,14,16,27結果の異方性を持つローカル血行動態力の組合せ28〜30。既存のセルストレッチの実験を大幅にメカノとメカノの基本的な理解に貢献してきたが、これらは伝統的に、複雑なin vivoでの歪場8-10,19,29,31-34を再現しない理想化された一軸または、等二軸ひずみのフィールドに依存してきた。 BAXSプラットフォームは、異方性軸のセルが同時ライブCELとストレッチができますL顕微鏡。 2つの直交方向に沿って基板の変形を制御する能力は、私たちは歪場を完全に制御することを可能にする。これは、単純な一軸と、等二軸歪み場に加えて、複雑な歪み場を製造することができる。また、プラットフォームは、私たちがダイナミックに同じストレッチ実験内ひずみ場の方向を変更することができます。

モジュラーおよびカスタムクランプシステムを統合するオプションは、単一のストレッチプラットフォームを使用して、多くの細胞メカノ内のアプリケーションおよび組織力学のための可能性を開く。例えば、適切なクランピングシステム13,27と、このプラットフォームは、生体組織の平面的な一軸、二軸引張試験を行うことができます。このように、長方形または正方形に切断任意の組織の機械的特性は、単一の実験における2つの直交軸に沿って定量化することができる。また、組織学的aを行うnalyses機械的刺激後の組織でストレッチ誘起構造変化を明らかにすることができます。ねじれも筋肉組織や靭帯35のための機械的負荷の非常に重要な種類である。このプラットフォームは、ねじれや緊張を伴うコンビナトリー機械的負荷を生成するために延伸軸周りの回転を誘発する可能性がクランプシステムを設計する可能性を提供します。これは、適切な取付けピンとより大きな口径の血管を評価することも可能である。機械的変形後の細胞応答を研究することは、強い調査中である。 BAXSプラットフォームは、同時イメージングを可能に加えて、同じ実験内の方向とひずみ場の複雑さを変更するユニークな機能を提供しています。プラットフォームは、顕微鏡の光軸とが干渉しないよう重要なことは、顕微鏡のマルチモーダル形態は、依然として可能である。これは、機械的なdまでの構造的および生化学的な生細胞応答などの重要な特徴であるeformationを測定することができる。まとめると、BAXSプラットフォーム設計は、単一細胞および組織全体の実験のためのその使用を容易にするいくつかの重要な特徴を有する。モジュラークランプシステムと、最大4つの可能なロードセルの添加を用いることにより、BAXSプラットフォームは、多数の実験のために使用することができる。この記事では、実験の2つの例の詳細を示している。しかし、システムのモジュール性と柔軟性、さらに、細胞内の細胞および全組織長さスケールでのメカノの多くの多様な側面を調査するために悪用される可能性があります。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

Acknowledgements

DTは、ル·フォン·ド·ルシェルシュ·デュ·ケベックネイチャーらテクノロジーズ(FQRNT)とMITACS昇格戦略的フェローシップからのポスドク学生の身分によってサポートされていました。 CMCは、ル·フォン·ド·ルシェルシュアンサンテ·デュ·ケベック(FRSQ)とアーネストオタワ心臓研究所の大学からマーガレットフォード心臓病恵まれ研究フェローシップからのポスドク学生の身分によってサポートされていました。 EOBは、オンタリオ州の心臓と脳卒中財団から健康の研究(CIHR)およびT6335のためのカナダの協会からの補助金のMOP80204を操作することでサポートされていました。 CIHRとメドトロニックは、集合の査読研究議長(URC#57093)でEOBを提供しています。 AEPは、自然科学と工学研究評議会(NSERC)ディスカバリーグラント、NSERC Discovery Acceleratorのサプリメントによって資金を供給し、感謝してカナダのリサーチチェア(CRC)プログラムとオンタリオ州からの早期リサーチャー賞のサポートを認めている。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PDMS Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG The ratio base to cross-linker used in this protocol is 20:1. Mix in a laminar hood to keep dust from contamining your 
FluoSpheres fluorescent microspheres Invitrogen F8810 Keep away from light.
Linear voice coil Moticont LVCM-051-051-01 The motro comes in two pieces (magnet and coil). It has to be mounted on a ball bearing sytem to be functional.
Ball bearing slide Edmund Optics NT37-360 Miniature and Small Linear Motion Ball Bearing Slides
Linear positioning stage Edmund Optics 38-960 Center Drive 1.25" Square Linear Translation Stages
Optical encoder GSI microE systems Mercury II 1600S - 0.5um resolution reflective incremental encoder.
Motion controller Galil DMC-2143(DIN)-DC48 with AMP-20440 4 axis controller with a 4 axis amplifier
Load cell Honeywell 31 low miniature load cell with a range of 0-150 g
Insect minutiens pins (0.20 mm) Pin Service Austerlitz Insect pins Stainless steel pins that are bended in an opened triangle shape
SU-8 2050 Micro Chem SU-8 2050 Permanent epoxy negative photoresist. Keep away from heat and light
Air-plasma treatment system Glowresearch Autoglow Oxygen Plasma System
Rat-tail collagen Invitrogen A10483-01 Collagen I, Rat Tail 5 mg/ml
Hoechst 33342 Invitrogen R37605 DNA-specific fluorescent dye. Keep in the fridge.
Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters omega.ca KHLV-0504/(10)-P 28 V flexible heaters; can be supplied with a 24 V
1/16 DIN Autotune Temperature and Process Controllers omega.ca CN63200-R1-LV Temperature controller; supply 24 V.
DMEM culture medium Hyclone SH3024301 Dulbecco’s Modified 30 Eagle Medium. Keep at 4 °C
Penicillin-Streptomycin Hyclone SV30010 Keep stock frozen. Keep working solution at 4 °C.
Fetal bovine serum (FBS) Hyclone SH3039603C Keep frozen.
Trypsin 0.05% Hyclone SH30236.02 Keep frozen. Digestion of cell attachement proteins for subcultivation
Hepes Wisent Inc 330-050-EL HEPES-buffered salt solution 
NaCl Fisher Scientific BP358-1 HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
KCl Fisher Scientific BP366-500 HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
MgSO4 Fisher Scientific M65-500 HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
CaCl2 Fisher Scientific C614-500 HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
Dextrose Fisher Scientific BP220-1 HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution
NaHCO3 Fisher Scientific BP328-1 Krebs physiological solution
KH2PO4 Fisher Scientific BP362-500 Krebs physiological solution
Carbogen 95% O2/5% CO2 Lindle DIN:02154749 Krebs physiological solution oxygenation
Nocodazole Sigma M1404 Microtubules depolymerization agent
Cytochalasin-D Sigma C8273 Actin filaments depolymerization agent
Anti-α-SMA-FITC Sigma F3777 Used to stain and quantify smooth muscle cells content
Picrosirius red stain Fluka 43665 Used to stain and quantify collagen content

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yim, E. K., Sheetz, M. P. Force-dependent cell signaling in stem cell differentiation. Stem Cell Res Ther. 3, (2012).
  2. Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 265-275 (2006).
  3. Wang, N., Tytell, J. D., Ingber, D. E. Mechanotransduction at a distance: mechanically coupling the extracellular matrix with the nucleus. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 75-82 (2009).
  4. Ingber, D. E. Mechanobiology and diseases of mechanotransduction. Ann Med. 35, 564-577 (2003).
  5. Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. J Cell Sci. 124, 9-18 (2011).
  6. Bukoreshtliev, N. V., Haase, K., Pelling, A. E. Mechanical cues in cellular signalling and communication. Cell Tissue Res. 352, 77-94 (2013).
  7. Chen, Y., Pasapera, A. M., Koretsky, A. P., Waterman, C. M. Orientation-specific responses to sustained uniaxial stretching in focal adhesion growth and turnover. Proc Natl Acad Sci USA. 110, (2013).
  8. Rosenzweig, D. H., Matmati, M., Khayat, G., Chaudhry, S., Hinz, B., Quinn, T. M. Culture of Primary Bovine Chondrocytes on a Continuously Expanding Surface Inhibits Dedifferentiation. Tissue Eng Part A. 18, 2466-2476 (2012).
  9. Balachandran, K., et al. Cyclic strain induces dual-mode endothelial-mesenchymal transformation of the cardiac valve. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 19943-19948 (1994).
  10. Steward, R., Cheng, C. M., Ye, J., Bellin, R., LeDuc, P. Mechanical stretch and shear flow induced reorganization and recruitment of fibronectin in fibroblasts. Sci Rep. 1, (2011).
  11. Wang, D., Xie, Y., Yuan, B., Xu, J., Gong, P., Jiang, X. A stretching device for imaging real-time molecular dynamics of live cells adhering to elastic membranes on inverted microscopes during the entire process of the stretch. Integr Biol (Camb). 2, 288-293 (2010).
  12. Haskett, D., Johnson, G., Zhou, A., Utzinger, U., Van de Geest, J. Microstructural and biomechanical alterations of the human aorta as a function of age and location. Biomech Model Mechanobiol. 9, 725-736 (2010).
  13. Duprey, A., Khanafer, K., Schlicht, M., Avril, S., Williams, D., Berguer, R. In vitro characterisation of physiological and maximum elastic modulus of ascending thoracic aortic aneurysms using uniaxial tensile testing. Eur J Vasc Endovasc Surg. 39, 700-707 (2010).
  14. Tremblay, D., et al. A comparison of mechanical properties of materials used in aortic arch reconstruction. Ann Thorac Surg. 88, 1484-1491 (2009).
  15. Khanafer, K., Duprey, A., Zainal, M., Schlicht, M., Williams, D., Berguer, R. Determination of the elastic modulus of ascending thoracic aortic aneurysm at different ranges of pressure using uniaxial tensile testing. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 142, 682-686 (2011).
  16. Van de Geest, J. P., Sacks, M. S., Vorp, D. A. The effects of aneurysm on the biaxial mechanical behavior of human abdominal aorta. J Biomech. 39, 1324-1334 (2006).
  17. Guolla, L., Bertrand, M., Haase, K., Pelling, A. E. Force transduction and strain dynamics in actin stress fibres in response to nanonewton forces. J Cell Sci. 125, 603-613 (2012).
  18. Wang, J. H., Goldschmidt-Clermont, P., Wille, J., Yin, F. C. Specificity of endothelial cell reorientation in response to cyclic mechanical stretching. J Biomech. 34, 1563-1572 (2001).
  19. Jungbauer, S., Gao, H., Spatz, J. P., Kemkemer, R. Two characteristic regimes in frequency-dependent dynamic reorientation of fibroblasts on cyclically stretched substrates. Biophys J. 95, 3470-3478 (2008).
  20. Dahl, K. N., Ribeiro, A. J. S., Lammerding, J. Nuclear shape, mechanics, and mechanotransduction. Circ Res. 102, 1307-1318 (2008).
  21. Shivashankar, G. V. Mechanosignaling to the cell nucleus and gene regulation. Annu Rev Biophys. 40, 361-378 (2011).
  22. Chiquet, M., Gelman, L., Lutz, R., Maier, S. From mechanotransduction to extracellular matrix gene expression in fibroblasts. Biochim Biophys Acta. 1793, 911-920 (2009).
  23. Sullivan, T., et al. Loss of A-type lamin expression compromises nuclear envelope integrity leading to muscular dystrophy. J Cell Biol. 147, 913-920 (1999).
  24. Lammerding, J., et al. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. J Clin Invest. 113, 370-378 (2004).
  25. Tremblay, D., Andrzejewski, L., Leclerc, A., Pelling, A. E. Actin and microtubules play distinct roles in governing the anisotropic deformation of cell nuclei in response to substrate strain. Cytoskeleton. (2013).
  26. Cuerrier, C. M., et al. Chronic over-expression of heat shock protein 27 attenuates atherogenesis and enhances plaque remodeling: a combined histological and mechanical assessment of aortic lesions. PLoS ONE. 8, (2013).
  27. Tremblay, D., Cartier, R., Mongrain, R., Leask, R. L. Regional dependency of the vascular smooth muscle cell contribution to the mechanical properties of the pig ascending aortic tissue. J Biomech. 43, 2448-2451 (2010).
  28. Barker, A. J., Lanning, C., Shandas, R. Quantification of hemodynamic wall shear stress in patients with bicuspid aortic valve using phase-contrast MRI. Ann Biomed Eng. 38, 788-800 (2010).
  29. Haga, J. H., Li, Y. S. J., Chien, S. Molecular basis of the effects of mechanical stretch on vascular smooth muscle cells. J Biomech. 40, 947-960 (2007).
  30. Frydrychowicz, A., et al. Time-resolved magnetic resonance angiography and flow-sensitive 4-dimensional magnetic resonance imaging at 3 Tesla for blood flow and wall shear stress analysis. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 136, 400-407 (2008).
  31. Boccafoschi, F., Mosca, C., Bosetti, M., Cannas, M. The role of mechanical stretching in the activation and localization of adhesion proteins and related intracellular molecules. J Cell Biochem. 112, 1403-1409 (2011).
  32. Yang, G., Crawford, R. C., Wang, J. H. C. Proliferation and collagen production of human patellar tendon fibroblasts in response to cyclic uniaxial stretching in serum-free conditions. J Biomech. 37, 1543-1550 (2004).
  33. Goldyn, A. M., Rioja, B. A., Spatz, J. P., Ballestrem, C., Kemkemer, R. Force-induced cell polarisation is linked to RhoA-driven microtubule-independent focal-adhesion sliding. J Cell Sci. 122, 3644-3651 (2009).
  34. Heo, S. J., et al. Fiber stretch and reorientation modulates mesenchymal stem cell morphology and fibrous gene expression on oriented nanofibrous microenvironments. Ann Biomed Eng. 39, 2780-2790 (2011).
  35. Zdero, R., et al. Linear and torsional mechanical characteristics of intact and reconstructed scapholunate ligaments. J Biomech Eng. 131, (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics