एक जीनोम व्यापक पैमाने पर Polysome Fractionation और स्तनधारी Translatomes का विश्लेषण

Biology
 

Summary

राइबोसोम प्रोटीन संश्लेषण में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं. सुक्रोज घनत्व ढाल centrifugation द्वारा Polyribosome (polysome) विभाजन एक जीनोम व्यापक पैमाने पर व्यक्तिगत mRNAs का अनुवाद क्षमता का प्रत्यक्ष निर्धारण की अनुमति देता. इसके अलावा, इस पद्धति ऐसी संरक्षिकाओं और संकेतन अणुओं के रूप में राइबोसोम और polysome जुड़े कारकों की जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Gandin, V., Sikström, K., Alain, T., Morita, M., McLaughlan, S., Larsson, O., Topisirovic, I. Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale. J. Vis. Exp. (87), e51455, doi:10.3791/51455 (2014).

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Abstract

mRNA अनुवाद जीन अभिव्यक्ति के नियमन में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है और स्तनधारी कोशिकाओं में सबसे अधिक ऊर्जा लेने वाली प्रक्रिया का प्रतिनिधित्व करता है. तदनुसार, mRNA अनुवाद के अनियंत्रण कैंसर सहित रोग राज्यों की एक किस्म में एक प्रमुख भूमिका निभाने के लिए माना जाता है. राइबोसोम भी जिससे समारोह और नव संश्लेषित polypeptides की स्थिरता नियमन करने, नवजात polypeptides के तह की सुविधा जो संरक्षिकाओं, मेजबानी. इसके अलावा, उभरते डेटा राइबोसोम संकेत वे राइबोसोम से उभरने के रूप में नए संश्लेषित polypeptides के बाद translational संशोधनों की एक किस्म में फंसा रहे हैं जो अणुओं, और / या translational मशीनरी के घटकों में से एक प्रदर्शनों की सूची के लिए एक मंच के रूप में सेवा है कि संकेत मिलता है. इस के साथ साथ, सूक्रोज घनत्व ढाल centrifugation का उपयोग राइबोसोम विभाजन की एक अच्छी तरह से स्थापित विधि वर्णित है. घर में विकसित "anota" एल्गोरिथ्म के साथ संयोजन के रूप में इस विधि की अनुमति देता है diffe के प्रत्यक्ष निर्धारणएक जीनोम व्यापक पैमाने पर व्यक्तिगत mRNAs का rential अनुवाद. इसके अलावा, इस बहुमुखी प्रोटोकॉल नए संश्लेषित polypeptides की तह और गिरावट में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं कि उन सहित राइबोसोम जुड़े प्रोटीन परिसरों, के समारोह को काटना लक्ष्य जैव रासायनिक अध्ययन की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Introduction

जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित कि विनियामक नेटवर्क बड़े पैमाने पर पिछले दो दशकों में अध्ययन किया गया है. एक जीनोम व्यापक पैमाने पर स्थिर राज्य mRNA स्तर में परिवर्तन तथाकथित "जीन अभिव्यक्ति" प्रोफाइल को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया जिससे transcriptional विनियमन, पर ध्यान केंद्रित इन अनुसंधान के प्रयासों के विशाल बहुमत. हाल के अध्ययनों से स्थिर राज्य mRNA स्तर केवल शिथिल जिससे mRNA अनुवाद सहित बाद transcriptional तंत्र, जीन अभिव्यक्ति 3,4 के नियमन में एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं, यह दर्शाता है proteome 1,2 की रचना करने के लिए संगत प्रकट करते हैं. दरअसल, यह ~ प्रोटीन के स्तर का 50% अमर माउस fibroblasts 5 में mRNA अनुवाद के स्तर पर निर्धारित कर रहे हैं कि अनुमान लगाया गया है.

mRNA अनुवाद mRNAs करवाया राइबोसोम, स्थानांतरण RNAs (tRNAs) की कार्रवाई और सहायक कारकों सह के माध्यम से प्रोटीन में अनुवाद कर रहे हैं, जिसके दौरान एक उच्च विनियमित प्रक्रिया हैmmonly अनुवाद कारकों (TFS) 6 के रूप में भेजा. प्रोटीन संश्लेषण स्तनधारी कोशिकाओं 7 में सबसे अधिक ऊर्जा लेने वाली प्रक्रिया है और इसलिए वैश्विक mRNA अनुवाद दरों पोषक तत्वों की उपलब्धता और सेल प्रसार दरें 8 को समायोजित करने के लिए समायोजित कर रहे हैं. वैश्विक mRNA अनुवाद एक्सचेंज, विभिन्न बाह्य उत्तेजनाओं (जैसे हार्मोन और वृद्धि कारकों), intracellular cues (जैसे अमीनो एसिड का स्तर) और तनाव के विभिन्न प्रकार (जैसे ईआर तनाव) कर रहे हैं कि mRNAs के पूल में चयनात्मक परिवर्तन प्रेरित में परिवर्तन के अलावा (translatome) 6 अनुवाद किया जा रहा. प्रोत्साहन के प्रकार, कुछ का अनुवाद गतिविधि नहीं, बल्कि सभी mRNAs नाटकीय रूप से इस तरह एक तेजी से सेलुलर प्रतिक्रिया 6 माउंट करने के लिए आवश्यक हैं कि proteome में परिवर्तन के परिणामस्वरूप, प्रभावित कर रहे हैं पर निर्भर करता है. Translatome में ये गुणात्मक और मात्रात्मक परिवर्तन के पार अभिनय कारकों के बीच परस्पर क्रिया (द्वारा मध्यस्थता माना जाता है जैसे 6,9 के चयनित सबसेट में मौजूद सीआईएस तत्वों (आरएनए तत्व या सुविधाओं) के घटकों. उदाहरण के लिए, स्तर और / या दर सीमित अनुवाद दीक्षा की गतिविधि में परिवर्तन eIF4E और eIF2 चुनिंदा विशिष्ट 5'UTR सुविधाओं 6 पर आधारित टेप के अनुवाद मिलाना कारकों. eIF4E और eIF2 क्रमश: 6, राइबोसोम के लिए mRNA और सर्जक tRNA की भर्ती के लिए आवश्यक हैं. EIF4E गतिविधि में वृद्धि के चुनिंदा cyclins, सी Myc और बीसीएल एक्सएल 10 सहित प्रोटीन उत्तेजक उन एन्कोडिंग प्रसार और अस्तित्व सहित लंबी और उच्च संरचित 5'UTRs शरण mRNAs का अनुवाद bolsters. बदले में, eIF2 की निष्क्रियता चुनिंदा ऊपर इस तरह उन एन्कोडिंग मास्टर टी के रूप में उनके 5'UTRs में कम निरोधात्मक नदी के ऊपर खुला पढ़ने फ्रेम (uORFs), युक्त mRNAs का अनुवाद को विनियमित करने, whilst एक वैश्विक प्रोटीन संश्लेषण बंद नीचे की ओर जाता हैप्रोटीन प्रतिक्रिया सामने आया (जैसे ATF4) की ranscriptional नियामकों. पोषक तत्वों, वृद्धि कारक है और हार्मोन, rapamycin के यंत्रवत / स्तनधारी लक्ष्य MAPK मार्ग सीधे phosphorylates जबकि (mTOR) मार्ग, 4E बाध्यकारी प्रोटीन अनुवाद दमन की (4E-BP) परिवार निष्क्रिय द्वारा eIF4E गतिविधियों को बढ़ावा देने सहित विभिन्न उत्तेजनाओं के जवाब में 6,11 eIF4E. बदले में, eIF2α kinases (यानी अतिरिक्त लाभ PKR, HRI और GCN2) पोषक अभाव, ईआर तनाव और वायरस के संक्रमण 6,12 के जवाब में अपनी eIF2α विनियामक सबयूनिट phosphorylating द्वारा eIF2 रोकना. TFS की गतिविधि और / या अभिव्यक्ति में परिवर्तन, translational मशीनरी और miRNAs सहित विनियामक कारकों के अन्य घटकों के कैंसर, चयापचय सिंड्रोम, तंत्रिका विज्ञान और मनोरोग विकार, और गुर्दे और हृदय रोगों 13-19 सहित विभिन्न रोग राज्यों में मनाया गया है. सामूहिक रूप से, इन आंकड़ों है कि मुझे translational का संकेतchanisms सेल homeostasis को बनाए रखने में और उनके निराकरण विभिन्न मानव रोगों के एटियलजि में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है कि एक निर्णायक भूमिका निभाते हैं.

इस के साथ साथ, monosomes, ribosomal सब यूनिटों और दूत Ribonucleoprotein कणों (mRNPs) से polysomes अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है जो स्तनधारी कोशिकाओं में सुक्रोज घनत्व ढाल centrifugation द्वारा polysomes के विभाजन के लिए एक प्रोटोकॉल में वर्णित है. इस खराब अनुवादित (प्रकाश polysomes से जुड़े) mRNAs से (भारी polysomes से जुड़े) कुशलता से अनुवादित बीच भेदभाव सक्षम बनाता है. इस परख में, राइबोसोम ऐसे cycloheximide 20 और साइटोसोलिक अर्क ultracentrifugation द्वारा 5-50% रैखिक sucrose gradients घनत्व पर अलग हो रहे हैं के रूप में अनुवाद बढ़ाव inhibitors का उपयोग mRNA पर स्थिर रहे हैं. सुक्रोज ढ़ाल के बाद fractionation वे करने के लिए बाध्य राइबोसोम की संख्या के हिसाब से mRNAs का अलगाव की अनुमति देता है. प्रत्येक अंश से निकाले आरएनए तो निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैविभिन्न परिस्थितियों के बीच ढाल भर mRNAs का वितरण में परिवर्तन, जिससे ढाल के ऊपर से नीचे तक translational क्षमता बढ़ जाती है. उत्तरी सोख्ता या मात्रात्मक रिवर्स प्रतिलेखन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (QRT-पीसीआर) प्रत्येक अंश में mRNAs का स्तर निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है.

वैकल्पिक रूप से, भारी polysomes (आमतौर पर 3 से अधिक राइबोसोम) युक्त भिन्न जमा कर रहे हैं और जीनोम चौड़ा polysome जुड़े mRNA स्तर माइक्रोएरे या गहरे अनुक्रमण का उपयोग निर्धारित कर रहे हैं. यह polysome जुड़े mRNAs के स्तर साइटोसोलिक mRNAs का स्तर 21 कि प्रभावित ट्रांसक्रिप्शनल और बाद transcriptional तंत्र से प्रभावित, अनुवाद के अलावा, कर रहे हैं कि बल देने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है. इसलिए, polysome जुड़े mRNA से जीनोम चौड़ा डेटा का उपयोग कर अनुवाद में मतभेद निर्धारित करने के लिए यह transla के अपस्ट्रीम हैं कि जीन की अभिव्यक्ति मार्ग में कदम से प्रभाव के लिए सही करने के लिए आवश्यक हैtion 21. इस तरह के एक सुधार करने के लिए, साइटोसोलिक आरएनए 21 निर्धारित कर रहे हैं प्रत्येक नमूने से polysome जुड़े शाही सेना और जीनोम चौड़ा स्थिर राज्य mRNA स्तर के साथ समानांतर में तैयार किया जाता है. वर्तमान में, "अनुवाद दक्षता" (ते) अंक तथाकथित (polysome जुड़े mRNA डेटा और साइटोसोलिक mRNA डेटा के बीच प्रवेश अनुपात यानी) अक्सर एक का अनुवाद दक्षता पर साइटोसोलिक mRNA स्तर में परिवर्तन के प्रभावों के लिए सही करने के लिए नियोजित कर रहे हैं mRNA 22 दिया. हालांकि, अंतर अनुवाद की पहचान करने के लिए ते स्कोर का उपयोग के कारण सामान्यतः के रूप में नकली सहसंबंध 27 में भेजा ते स्कोर का एक गणितीय संपत्ति के लिए झूठी सकारात्मक और नकारात्मक झूठी निष्कर्षों की पर्याप्त संख्या के साथ जुड़ा हुआ है. दरअसल कई प्रयोगशालाओं से डेटा सेट के एक सर्वेक्षण में इस तरह के नकली सहसंबंध translatomes 23 में परिवर्तन का विश्लेषण करते समय अपरिहार्य होने लगते हैं कि संकेत दिया. इस अंतर टीआर की "विश्लेषण के विकास के लिये कहा aforementioned कमियों 23 से ग्रस्त नहीं है जो anslation "(anota) एल्गोरिथ्म,. Anota विश्लेषण के दौरान एक प्रतिगमन मॉडल साइटोसोलिक शाही सेना के स्तर का स्वतंत्र translational गतिविधि के उपायों प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इस तरह के उपाय तो स्थितियां और एक आँकड़े गणना की है के बीच तुलना कर रहे हैं. उपयोगकर्ता सांख्यिकीय शक्ति में सुधार और कुछ replicates 24 के साथ पढ़ाई में झूठी सकारात्मक निष्कर्ष की घटना को कम कर देता है जो एक विचरण संकोचन पद्धति लागू करने का विकल्प है. गौरतलब है कि हाल ही में यह translatome में perturbations anota ने कब्जा कर लिया है कि प्रदर्शन किया गया, लेकिन ते नहीं स्कोर, proteome 25 में परिवर्तन के साथ सहसंबंधी. इसलिए, यह अत्यधिक एक जीनोम व्यापक पैमाने पर अनुवाद में परिवर्तन की पहचान के लिए anota विश्लेषण लागू करने की सिफारिश की है. Anota कलन विधि का सैद्धांतिक आधार पहले से 21,23,26 विस्तार से चर्चा कर रहे थे, यहाँ ध्यान अभ्यास में इसे लागू करने के बारे में है.

सेल में mRNA अनुवाद गतिविधि में परिवर्तन का अध्ययन करने के अलावा ve_content ">, इस राइबोसोम fractionation प्रोटोकॉल अलग और biochemically और कार्यात्मक राइबोसोम और polysome जुड़े प्रोटीन परिसरों को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह दृष्टिकोण सफलतापूर्वक पहचान करने के लिए अतीत में तैनात कर दिया गया है नए संश्लेषित polypeptides 27 और / या translational मशीनरी के घटकों की phosphorylation में शामिल कर रहे हैं की स्थिरता को विनियमित कि परिसरों. polysome विभाजन विधि का यह आवेदन भी संक्षेप में चर्चा की जाएगी.

Protocol

1. Sucrose के ढाल तैयारी

  1. 60% की 100 मिलीलीटर DDH 2 ओ में (w / v) sucrose के समाधान की तैयारी समाधान fractionation कदम (3.5 कदम) के दौरान ट्यूबिंग के clogging रोकने के लिए एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से हटा दिया जाना चाहिए.
  2. 200 मिमी HEPES (पीएच 7.6), 1 एम KCl, 50 मिमी 2 MgCl, 100 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर cycloheximide, 1x protease अवरोध कॉकटेल (EDTA मुक्त), 100 इकाइयों / मिलीलीटर RNase अवरोध करनेवाला: 10x sucrose ढाल बफर के 5 एमएल तैयार करें.
  3. 1.1 चरण में वर्णित के रूप में तैयार 60% समाधान का उपयोग करना, 40 5% की मिलीलीटर और 1x sucrose ढाल बफर में 50% sucrose के समाधान करते हैं.
  4. (कुल 6 ultracentrifugation ट्यूब) layering के लिए प्रत्येक polyallomer ultracentrifugation ट्यूब पर आधा भरा बिंदु चिह्नित करने के लिए ढाल निर्माता के साथ प्रदान मार्कर ब्लॉक का प्रयोग करें. यह आधा भरा बिंदु तक पहुँच जाता है जब तक ढाल निर्माता के साथ प्रदान की लेयरिंग डिवाइस का प्रयोग, 5% sucrose के समाधान जोड़ने. फिर, interf तक तल से 50% sucrose के समाधान जोड़नादो समाधान के बीच इक्का आधा भरा बिंदु तक पहुँच जाता है. इस (नीचे देखें) उच्च reproducibility प्राप्त करने के लिए आवश्यक है के रूप में ढ़ाल, संभव के रूप में इसी तरह के हैं कि इतना खास ख्याल इस कदम के दौरान लिया जाना चाहिए.
  5. ढाल निर्माता के साथ प्रदान की दर जोनल टोपी के साथ ट्यूब सील और ढाल निर्माता पर ट्यूब धारक को सील ट्यूब हस्तांतरण.
  6. एक रेखीय 5% से 50% ढाल प्राप्त करने के लिए ढाल निर्माता चलाएँ. 6 रैखिक ढ़ाल उच्च झुकाव कोण पर रोटेशन से कुछ ही मिनटों में गठन किया जाएगा.
    नोट: सुक्रोज ढ़ाल 6 महीने के लिए तुरंत इस्तेमाल किया या -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है.

2. अलगाव और Polysomes की अवसादन

  1. सेल के प्रकार पर निर्भर करता है, 1-5 15 सेमी पेट्री डिश (~ 15 x 10 6 कोशिकाओं) सेल से पहले कम से कम एक दिन में कोशिकाओं बीज. प्रयोगों के दिन कोशिकाओं ~ 80% मिला हुआ होना चाहिए. नोट: अनुवाद और प्रसार दरों सीधे हैं क्योंकि इष्टतम confluency महत्वपूर्ण है8 आनुपातिक है, और इसलिए polysomes सक्रिय रूप से proliferating कोशिकाओं में विश्लेषण किया जाना चाहिए (कोशिकाओं का कम confluency आगे के विश्लेषण के लिए पर्याप्त सामग्री प्रदान नहीं कर सकते, जबकि यानी अनुवाद की दरों में काफी मिला हुआ कोशिकाओं ओवर में छोड़ देंगे). उदाहरण के लिए प्रयोगकर्ता के अनुवाद पर संपर्क निषेध के प्रभाव का अध्ययन करने में रुचि है, तो इस नियम के अपवाद बनाया जा सकता है. हालांकि, कोशिकाओं को इस translatome पर अनजाने प्रभाव हो सकता है, के रूप में भी लंबे समय के लिए मिला हुआ स्थितियों से अधिक के तहत नहीं रखा जाना चाहिए.
    अभिकर्मक की आवश्यकता है, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट की सबसे polysome के स्तर को प्रभावित नहीं करते. अभिकर्मक कोशिकाओं के दिन पर 80-90% मिला हुआ होना चाहिए, क्योंकि यह ~ 80% मिला हुआ कोशिकाओं 24 घंटा बाद अभिकर्मक प्रचार और कोशिकाओं से polysomes 48 घंटा बाद अभिकर्मक को अलग करने की सिफारिश की है.
  2. 5 37 डिग्री सेल्सियस न्यूनतम और 5 के लिए विकास मीडिया में 100 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में cycloheximide के साथ कोशिकाओं को सेते% सीओ 2; और 100 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर cycloheximide युक्त ठंडा 1x पीबीएस के 10 एमएल के साथ दो बार धोने कोशिकाओं. Cycloheximide जिससे राइबोसोम चलाने के 20 बंद को रोकने, mRNA पर राइबोसोम "जमा देता है कि" एक अनुवाद बढ़ाव अवरोध करनेवाला है.
  3. 100 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर cycloheximide युक्त ठंडा 1x पीबीएस के 5 एमएल में, धीरे परिमार्जन कोशिकाओं और एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में उन्हें इकट्ठा. यह इस कदम काफी तेजी से समय की एक लम्बी अवधि के लिए बर्फ पर कोशिकाओं को छोड़ने के रूप में काफी polysome तैयारी की गुणवत्ता कम हो जाएगा किया जाता है कि महत्वपूर्ण है.
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 XG पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं लीजिए
  5. Hypotonic बफर के 425 μl में सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं त्यागने [(5 मिमी Tris-एचसीएल (7.5 पीएच), 2.5 मिमी 2 MgCl, 1.5 मिमी KCl और 1x protease अवरोध कॉकटेल (EDTA मुक्त)], 10 मिलीग्राम के 5 μl जोड़ने / मिलीलीटर CHX, 1 एम डीटीटी का 1 μl, 10% Trito के 25 μl के अलावा द्वारा पीछा 5 सेकंड के लिए RNAse अवरोध करनेवाला और भंवर की 100 इकाइयोंएन एक्स 100 (अंतिम एकाग्रता 0.5%) और 10% सोडियम Deoxycholate के 25 μl (अंतिम एकाग्रता 0.5%) और 5 सेकंड के लिए भंवर. हल्के साबुन शर्तों परमाणु लिफाफा में खलल न डालें बिना साइटोसोलिक और जालिका जुड़े राइबोसोम solubilize के लिए उपयोग किया जाता है, जबकि कारण सेल सूजन, hypotonic बफर, प्लाज्मा झिल्ली को बाधित करेगा.
  6. 7 4 डिग्री सेल्सियस न्यूनतम और एक नया पूर्व ठंडा 1.5 मिलीलीटर ट्यूब को हस्तांतरण पर तैरनेवाला (~ 500 μl) के लिए 16,000 XG पर अपकेंद्रित्र lysates. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग प्रत्येक नमूना के लिए 260 एनएम आयुध डिपो उपाय और साइटोसोलिक स्थिर राज्य mRNA स्तर निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाएगा जो इनपुट के रूप में lysate के 10% रखना. , RNase मुक्त एच 2 ओ में 750 μl के लिए इनपुट पतला 750 Trizol के μl और तरल नाइट्रोजन में फ़्लैश फ्रीज जोड़ें.
  7. पूर्व ठंडा रोटर बाल्टी में सुक्रोज ढ़ाल युक्त ultracentrifuge ट्यूब स्थानांतरण. सुक्रोज ढ़ाल के ऊपर से 500 μl निकालें. वे एक ही ओवर ड्राफ्ट (10-2 होते हैं कि इतने lysates समायोजितLysis बफर के 500 μl में 260 एनएम 0 आयुध डिपो) (2.5 कदम में वर्णित) और प्रत्येक sucrose ढाल पर उन्हें लोड.
    नोट: इस गंभीर polysome तैयारी की गुणवत्ता में सुधार होगा, क्योंकि यह तुरंत ढ़ाल पर lysates लोड करने के लिए महत्वपूर्ण है.
  8. वजन और अल्ट्रा centrifugation से पहले प्रत्येक ढाल संतुलन.
  9. SW41Ti रोटर का उपयोग कर 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए 222,228 XG (36,000 आरपीएम) पर अपकेंद्रित्र,.
    नोट: सुक्रोज ढ़ाल को बाधित करने के क्रम में नहीं, "कम" ब्रेक विकल्प का चयन किया जाना चाहिए.

3. Polysome Fractionation और शाही सेना निष्कर्षण

  1. RNase जैप (कुछ स्प्रे) युक्त गर्म RNase मुफ्त पानी के साथ सफाई से अंश कलेक्टर तैयार करें. केवल गर्म RNase मुफ्त पानी के साथ इस चरण को दोहराएँ. यूवी दीपक स्विच और हरे रंग का प्रकाश प्रकट करने के लिए प्रतीक्षा करें.
  2. ध्यान से रोटर से ट्यूबों निकालें और बर्फ पर उन्हें जगह है. कंप्यूटर, पंप, यूवी डिटेक्टर और अंश कलेक्टर को स्विच ऑन करें. 3 मिलीग्राम / मिनट और fil पर सेट पंपएल यह सुई तक पहुँच जाता है जब तक पीछा करते हुए समाधान [60% (w / v) 0.02% से युक्त सुक्रोज (w / v) bromophenol नीला] के साथ ट्यूबिंग. यकीन है कि कम से कम एक बूंद सुई से बाहर आ रही देखने के लिए बनाने, और कोई बुलबुले पंप सिरिंज या ट्यूबिंग में पेश कर रहे हैं कि पता लगाना.
  3. एक अंश कलेक्टर में 2 मिलीलीटर ट्यूबों रखें. विश्लेषण प्रोग्राम लॉन्च और + / करने के लिए संवेदनशीलता सेट - 10 MeV. 100 सेकंड के लिए "timebase" सेट.
  4. ट्यूब orthogonal स्थिति में है कि सुनिश्चित कर रही है, जबकि यूवी डिटेक्टर में प्रत्येक ultracentrifugation ट्यूब रखें. ट्यूब धारक नीचे घुंडी घुमा द्वारा सुई के साथ ट्यूब पियर्स.
  5. 1.5 मिलीग्राम / मिनट पर पंप सेट और (यह प्रत्येक अंश में ~ 750 μl में परिणाम होगा) अंश कलेक्टर पर 30 सेकंड के लिए समय की स्थापना भिन्न इकट्ठा. "दूरस्थ स्थिति" में पंप रखो, पंप और अंश कलेक्टर शुरू, और एक ही समय में DAQ अनुरेखक का उपयोग रिकॉर्डिंग शुरू. इस सुक्रोज gra के एक ऊपर की ओर विस्थापन शुरू होगाdient और 254 एनएम पर यूवी absorbance के एक साथ पता लगाने. जैसे ही पीछा करते हुए समाधान की पहली बूंद के रूप में ट्यूब का संग्रह एक 2 मिलीलीटर में पड़ता संग्रह करना बंद.
  6. . सीएसवी प्रारूप में ट्रेसिंग सहेजें और यूवी absorbance के प्रोफाइल में प्रत्येक अंश की स्थिति की पहचान करने के लिए निम्नलिखित है, एक स्प्रेडशीट अनुप्रयोग में, (एक बार 3.7 पूरा हो गया है कदम):
    1. 254 एनएम पर absorbance के लिए इसी मूल्यों से युक्त स्तंभ का चयन करें (चैनल 0).
    2. Absorbances का एक सरल रेखा तितर बितर साजिश बनाएँ.
    3. प्रत्येक अंश (30 सेकंड) का संग्रह समय से 5% -50% sucrose ढाल (~ 12 मिलीग्राम) की मात्रा को विभाजित करके प्राप्त 300 (मूल्य के लिए एक्स अक्ष की प्रमुख इकाई सेट करें.
  7. प्रत्येक अंश में Trizol के 750 μl जोड़ें और फ़्लैश तरल नाइट्रोजन में भिन्न फ्रीज.
  8. निर्माता के निर्देशों के अनुसार Trizol प्रोटोकॉल का उपयोग polysome जुड़े और (2.6) से साइटोसोलिक शाही सेना को अलग. शाही सेना उपज बढ़ाने के लिए, शाही सेना preci के साथ आगे बढ़ना30 मिनट या -20 डिग्री सेल्सियस रात भर के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर pitation.
    नोट: polysomal अंशों से उपजी शाही सेना की राशि स्पष्ट रूप से दिखाई नहीं हो सकता क्योंकि यह वाहक जोड़ने की सिफारिश की है. Trizol प्रोटोकॉल के दौरान शाही सेना तेज़ी कदम से पहले ट्यूब के लिए वाहक का 1 μl जोड़ें.
  9. भिन्न (दृष्टिकोण 3.6 वर्णित का उपयोग करके)> 3 राइबोसोम के साथ जुड़े mRNA के अनुरूप जो निर्धारित और इन भिन्न पूल. (2.6) से जमा polysome जुड़े और साइटोसोलिक शाही सेना की सफाई प्रदर्शन करने के लिए शाही सेना सफाई किट का प्रयोग करें. प्रोटीन या गहरे अनुक्रमण का उपयोग कर जीनोम चौड़ा mRNA स्तर निर्धारित करने के लिए एक सुविधा के लिए नमूने जमा करें.
    विशिष्ट mRNAs का अनुवाद RT-qPCR द्वारा निगरानी की जरूरत है, यह सीडीएनए synthesize करने के लिए (> 3 राइबोसोम या कुल शाही सेना युक्त जमा भिन्न से) शाही सेना के 500 एनजी उपयोग करने के लिए सिफारिश की है.
    नोट:> 3 राइबोसोम के साथ जुड़े mRNAs कुशलता से अनुवादित mRNAs का प्रतिनिधित्व करते हैं और नव सिंथे के 80% से अधिक शामिल करने के लिए मनमाने ढंग से सेट किया गया हैआकार polypeptides 28,29. (1-2) प्रकाश को इसी भिन्न, मध्यम (2-3) और भारी polysomes सहित (> 3) इस प्रकार फायदेमंद होगा, लेकिन ये (हालत प्रति 2 बनाम 4) 2 गुना से नमूनों की संख्या में वृद्धि होगी और प्रयोग की लागत. यह भविष्य में गहरे अनुक्रमण और माइक्रोएरे विश्लेषण की लागत में कमी, उत्तरार्द्ध दृष्टिकोण एहसान चाहिए कि अनुमान है कि के होते हुए भी, यह सत्यापन के दौरान, व्यक्ति mRNAs का वितरण प्रत्येक अंश में निगरानी की सलाह दी है.

MRNA अनुवाद के 4. जीनोम चौड़ा विश्लेषण

  1. स्थापित करें आर, bioconductor और anota पैकेज:
    1. आर (R-project.org से डाउनलोड) स्थापित करें और एक आर सत्र शुरू.
      नोट: A सभी ऑपरेटिंग सिस्टम के लिए उपलब्ध है और anota उन सभी पर चलेंगे.
    2. Bioconductor स्थापित करें (bioconductor.org). Do द्वारा शुरू की है जो - आर कोड विंडोज में आर टर्मिनल (जैसे आर सांत्वना के माध्यम से व्याख्या की हैuble) आर शॉर्टकट क्लिक करें. Bioconductor (आर टर्मिनल में) लिखकर स्थापित है:

      स्रोत ("http://bioconductor.org/biocLite.R")

      biocLite ()
    3. (आर टर्मिनल में) लिखकर anota bioconductor पैकेज (और anota की आवश्यकता है कि qvalue पैकेज) को स्थापित करें:

      स्रोत ("http://bioconductor.org/biocLite.R")

      biocLite (ग ("anota", "qvalue"))
    4. पैकेज सफलतापूर्वक स्थापित और (आर टर्मिनल में) लिखकर anota पुस्तिका खुला था कि टेस्ट:

      पुस्तकालय ("anota")

      शब्दचित्र ("anota")
    5. नोट: anota पैकेज में उपयोग किया जाता है कि सभी कार्यों के लिए अतिरिक्त मदद anota वेब पेज (http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/anota.html) पर या का उपयोग करके या तो पाया जा सकता है उदाहरण के लिए आर भीतर सहायता समारोह, anotaPerformQc समारोह पर मदद पाने के लिए आर ते के लिए जानाrminal और प्रकार (anota पैकेज लोड किया गया है जब यह केवल काम करता है) नोट:

      पुस्तकालय ("anota") # anota पैकेज को लोड

      ? AnotaPerformQc # इस समारोह के लिए मदद खुलती
  2. आर के लिए डेटा आयात करें:
    1. विश्लेषण के लिए अभिव्यक्ति डेटा तैयार करें. डाटा mRNA स्तर को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था कि तकनीक के संबंध में (जैसे सामान्यीकृत और गुणवत्ता नियंत्रण) पूर्व संसाधित किया जाना चाहिए. Log2 इनपुट मानों, लॉग तब्दील किया जाना चाहिए सबसे आम है. सभी polysome जुड़े शाही सेना के नमूने और सभी साइटोसोलिक शाही सेना के नमूने के लिए एक के लिए डेटा के साथ एक मेज संकलित करें. पहले कॉलम नमूना प्रति एक डेटा स्तंभ द्वारा पीछा जीन पहचानकर्ता शामिल करना चाहिए; पहली पंक्ति के नमूने लिए नामों को शामिल करना चाहिए. यह टेबल समान नमूना आदेश और समान जीन आदेश है कि महत्वपूर्ण है. "MyPolysomeData.txt" और "myCytosolicData.txt" कहा जाता है टैब सीमांकित पाठ फ़ाइलों के रूप में फाइल को बचाने के.
    2. सी 1, सी 2, सी 3, डी 1, डी 2, दोनों myCytosolicData.txt और myPolysomeData.txt फाइलों में डी 3: इस उदाहरण में दो नमूना वर्गों जिससे इस आदेश के साथ 6 नमूने पैदा करने, प्रति वर्ग 3 प्रतिकृति के साथ (नियंत्रण या रोगग्रस्त) किया जाता है. दो नमूना वर्गों रहे हैं जब Anota शर्त के अनुसार कम से कम 3 replicates की आवश्यकता है. ये स्वतंत्र जैविक प्रतिकृति होना चाहिए.
    3. डेटा इनपुट फाइलें (myPolysomeData.txt और myCytosolicData.txt) शामिल हैं एक निर्देशिका बनाएँ. इस निर्देशिका से खोलें आर. विंडोज़ / मैक में इस इस निर्देशिका में एक आर शॉर्टकट नकल और इस शॉर्टकट का उपयोग कर अनुसंधान शुरू करने से किया जा सकता है (सीधे काम भी ड्रॉप डाउन मेनू का उपयोग बदला जा सकता है).
    4. नव निर्मित निर्देशिका के भीतर myCode.R नामक एक फ़ाइल बनाएँ और एक पाठ संपादन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर खुला. इस फ़ाइल में कोड लिखें.
    5. आर में डेटा लोड करने के लिए (कोड के बाद इसके अलावा फिर से बचाने के लिए इस फ़ाइल को याद) myCode.R फ़ाइल के लिए निम्न कोड लिखें. नीचे एक कदम-Sकोड लेकिन सभी कोड की TEP स्पष्टीकरण भी केवल एक बार इस्तेमाल किया (जो नीचे देख, कोड चलाता है) शुरू में और स्रोत समारोह में लिखा जा सकता है:

      # # इस anota पुस्तकालय लोड करता है

      पुस्तकालय (anota)

      # # इस अनुसंधान में इनपुट डेटा लोड करता है

      dataCyto <- as.matrix (read.table ("myCytosolicData.txt", हेडर = सच, row.names = 1 सितम्बर = " t"))

      dataPoly <- as.matrix (read.table ("myPolysomeData.txt", हेडर = सच, row.names = 1 सितम्बर = " t"))
    6. आर टर्मिनल में सीधे टाइप करके अनुसंधान में कोड चलाने:

      स्रोत ("myCode.R")
    7. डेटा (आर टर्मिनल में) लिखकर सफलतापूर्वक लोड किया गया था कि जांच:
      सिर (dataCyto) # dataCyto तालिका के शीर्ष दिखाएगा
      सिर (dataPoly)
  3. विभिन्न अनुवादित जीन की पहचान:
    1. वर्णन करता है कि एक वेक्टर उत्पन्ननमूना श्रेणियाँ (एक वेक्टर आर में वस्तु का एक प्रकार है). सभी तीन वस्तुओं के नमूने के एक समान आदेश दिया है कि ताकि यह वेक्टर myPolysomeData.txt और myCytosolicData.txt में नमूना आदेश को प्रतिबिंबित करना चाहिए. नमूनों की तुलना करने के बारे में जो anota आज्ञा जब वेक्टर उपयोग किया जाएगा. MyCode.R फ़ाइल के लिए निम्न करें:

      # # दोहराने के नमूने समान नमूना वर्ग है कि नोट

      # # वर्णन इस सदिश में (यानी 'सी' या 'डी').

      myPhenotypes <- सी ('सी', 'सी', 'सी', 'डी', 'डी', 'डी')
    2. डेटा सेट की गुणवत्ता नियंत्रण कार्य करें. Anota विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है पहले का मूल्यांकन करने की आवश्यकता है कि गुणवत्ता के उपायों के एक नंबर रहे हैं. ये anota पुस्तिका में विस्तार से चर्चा कर रहे हैं. MyCode.R फाइल करने के लिए इस कोड को जोड़ने और बचा:

      anotaQcOut <- anotaPerformQc (dataT = dataCyto, dataP = dataPoly,phenoVec = myPhenotypes)

      anotaResidOut <- anotaResidOutlierTest (anotaQcObj = anotaQcOut)
    3. आर टर्मिनल में लिखकर कोड चलाने:

      स्रोत ("myCode.R")

      इस anota मैनुअल में निर्देश के रूप में जांच की जा सकती है, जो उत्पादन फ़ाइलों की एक संख्या उत्पन्न होगा.
    4. विभिन्न अनुवादित जीन की पहचान. नमूने वे ("विरोधाभासों" पैरामीटर का उपयोग) उपयोगकर्ता द्वारा निर्दिष्ट कर रहे हैं (जब तक "myPhenotypes" वेक्टर आईई) "phenoVec" पैरामीटर के लिए आपूर्ति के नाम के वर्णमाला के क्रम के आधार पर तुलना की जाएगी. अंदर "स्रोत" आदेश का उपयोग कर फ़ाइल और खत्म myCode.R के लिए निम्न कोड जोड़ें आर टर्मिनल ऊपर वर्णित है:

      anotaSigOut <- anotaGetSigGenes (dataT = dataCyto, dataP = dataPoly, phenoVec = myPhenotypes, anotaQcObj = anotaQcOut)
    5. AnotaGetSigGenes समझने के लिए मदद का उपयोग कैसे करते हेutput स्वरूपित और (आर टर्मिनल में) लिखकर तुलना करने के लिए नमूना श्रेणियों का चयन करने के लिए कैसे देख रहा है:

      ? AnotaGetSigGenes
    6. विभिन्न अनुवाद कर रहे हैं कि फिल्टर और साजिश जीन. AnotaPlotSigGenes समारोह के भीतर लागू किया जा सकता है और मदद का उपयोग वैसे सीमा के कस्टम संयोजन सरल होगा कि कई थ्रेसहोल्ड रहे हैं. मज़बूती से विश्लेषण किया जीनों के लिए चयन करने के लिए minSlope (-0.5), maxSlope (1.5) और slopeP (0.01) सेटिंग्स लागू होते हैं.
      नोट: इसके अलावा, RVM 23,26,30 झूठे खोज दर (एफडीआर) (0.15) को लागू करने से सेटिंग और (log2 [1.5]) जैसे विभिन्न अनुवादित जीन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है परिवर्तन गुना. इस तरह के "selDeltaPT" के रूप में अन्य फिल्टर ([1.5] log2 को selDeltaPT सेटिंग उदाहरण के लिए) एक सख्त फ़िल्टरिंग के लिए उपयोगी हो सकता है. यह तुलना (selCont तर्क का उपयोग करके) फ़िल्टर करना चाहिए जो निर्दिष्ट करने के लिए भी आवश्यक है. MyCode.R को निम्न पंक्ति जोड़कर वर्णित सेटिंग्स लागूफ़ाइल:

      anotaSigFiltered <- anotaPlotSigGenes (anotaSigObj = anotaSigOut, selContr = 1, minSlope = (-0.5), = 1.5 maxSlope, slopeP = 0.01, maxRvmPAdj = 0.15, minEff = LOG2 (1.5), selDeltaPT = LOG2 (1.5))
    7. से स्रोत समारोह का उपयोग करके विश्लेषण प्रदर्शन आर टर्मिनल ऊपर वर्णित है. यह भी एक चित्रमय उत्पादन उत्पन्न होगा. इस निर्गम की जांच विश्लेषण के प्रदर्शन का आकलन और सेटिंग्स में आवश्यक परिवर्तन की पहचान करने के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है.
    8. एक आउटपुट तालिका उत्पन्न. MyCode.R फ़ाइल के लिए निम्न कोड जोड़ें:

      write.table (anotaSigFiltered $ selectedRvmData, फ़ाइल = "MySignificantGenes.txt" सितम्बर = " t")
    9. आर टर्मिनल में स्रोत समारोह का उपयोग कर कोड को चलाने. परिणामस्वरूप तालिका में स्तंभों anotaPlotSigGenes समारोह के लिए सहायता में समझाया जाता है.

Representative Results

mTOR पोषक तत्वों की उपलब्धता 19 के साथ वैश्विक प्रोटीन संश्लेषण की दर निर्देशांक कि सेलुलर नेटवर्क के एक प्रमुख नोड है. mRNA अनुवाद दर सीमित दीक्षा चरण 6 पर मुख्य रूप से नियंत्रित किया जाता है. polysomes में लगे हुए राइबोसोम के अनुपात सकारात्मक अनुवाद दीक्षा दरें 28 के साथ संबद्ध करता है. MRNA अनुवाद पर इंसुलिन के प्रभाव mediating में संकेत mTOR की भूमिका की जांच करने के लिए polysome fractionation पद्धति लागू करने का एक उदाहरण प्रस्तुत किया है. यह अंत करने, MCF7 मानव स्तन कैंसर की कोशिकाओं को कम सीरम में बनाए रखा गया और फिर इंसुलिन अकेले या सक्रिय साइट mTOR अवरोध करनेवाला Torin1 साथ संयोजन में साथ प्रेरित किया. लगातार कम सीरम में रखा गया था कि गैर उत्तेजित कोशिकाओं, एक नियंत्रण के रूप में सेवा की. mRNPs, monosome (80) और polysome भिन्न polysome fractionation पद्धति का उपयोग करके अलग हो गए थे. नियंत्रण कक्षों के सापेक्ष, इंसुलिन इसी ढाल भागों में absorbance में वृद्धि प्रेरितpolysomes करने, monosome अंश में absorbance में एक सहवर्ती कमी (चित्रा 1) के साथ. इन निष्कर्षों polysomes में लगे हुए राइबोसोम के अनुपात इसलिए उम्मीद के रूप में, इंसुलिन वैश्विक अनुवाद दीक्षा दरों को उत्तेजित करता है, यह दर्शाता है कि नियंत्रण कक्षों की तुलना में इलाज के लिए इंसुलिन में वृद्धि हुई है शो. Torin1 जिससे संकेत mTOR अनुवाद मशीनरी 19 पर इंसुलिन के प्रभाव mediating में एक प्रमुख भूमिका निभाता है कि निष्कर्षों की पुष्टि, absorbance के प्रोफाइल पर इंसुलिन के प्रभाव (चित्रा 1) के उलट.

ढाल तैयारी में विसंगतियों को टाला नहीं जा सकता है कि एक सिद्धांत के आधार पर, सवाल polysome विभाजन विधि 22 का उपयोग कर प्राप्त डेटा के reproducibility के संबंध में उठाया गया है. अनुभव से इस संभावित हानिकारक मुद्दा, साइटोसोलिक और भारी polysome जुड़े शाही सेना (4 और अधिक राइबोसोम के साथ जुड़े mRNA) की परीक्षा के लिए अलग थे 4 स्वतंत्र जैविक प्रतिकृति से Torin1 (चित्रा 2) के साथ संयोजन में अकेले इंसुलिन या इंसुलिन के साथ इलाज MCF7 कोशिकाओं से. साइटोसोलिक और प्रत्येक को दोहराने में भारी polysome जुड़े mRNA की रचना पर इंसुलिन और Torin1 का प्रभाव एक माइक्रोएरे दृष्टिकोण का उपयोग कर एक जीनोम व्यापक पैमाने पर निर्धारित किया गया था. प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) लागू किया गया था polysome विभाजन विधि के reproducibility निर्धारित करने के लिए. इस तरह के विश्लेषण अलग अलग परिस्थितियों में अच्छी तरह से (चित्रा 2) अलग हो गए थे, जबकि हर हालत से संबंधित नमूने कसकर दो पहले घटकों के भीतर तैनात थे. इन निष्कर्षों रूप में यहाँ वर्णित polysome fractionation पद्धति अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और एक जीनोम चौड़ा स्तर पर अनुवाद में मात्रात्मक और गुणात्मक परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए इसलिए उपयुक्त है कि दिखा.

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सीरम भुखमरी, इंसुलिन और mTOR MCF7 कोशिकाओं में वैश्विक अनुवाद पर संकेत का प्रभाव दिखा चित्रा 1. Polysomal प्रोफाइल. MCF7 कोशिकाओं 16 घंटे के लिए (0.1% FBS में बनाए रखा) पोषक तत्वों से वंचित और 5 एनएम इंसुलिन (आईएनएस) अकेले या साथ इलाज किया गया 4 घंटे के लिए 250 एनएम Torin1 (आईएनएस + Torin1) के साथ संयोजन में. लगातार पोषक तत्वों (0.1% FBS) से वंचित थे कि अनुपचारित कोशिकाओं एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया. इसी साइटोसोलिक अर्क 5-50% sucrose ढ़ाल पर centrifugation द्वारा sedimented गया. मुफ्त ribosomal सब यूनिटों (40 और 60 के दशकों), monosomes (80) और polysome भागों में राइबोसोम की संख्या संकेत कर रहे हैं.

चित्रा 2
चित्रा 2. पी का उपयोग कर प्राप्त जीनोम चौड़ा डेटाolysome रूपरेखा अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है. MCF7 कोशिकाओं. साइटोसोलिक और polysome जुड़े शाही सेना (> 3 राइबोसोम) GeneTitan सरणियों (Affymetrix) का उपयोग निर्धारित किया गया है 4 स्वतंत्र जैविक replicates और उनके जीनोम चौड़ा mRNA स्तर से निकाला गया था चित्रा 1 के रूप में इलाज किया गया. पीसीए परिणामी डेटा के reproducibility का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. शाही सेना के मूल (सी = साइटोसोलिक, पी = polysome जुड़े) सभी उपचार के लिए पहले दो पीसीए घटकों (; CTRL = नियंत्रण इन्स = इंसुलिन T1 = Torin 1) कर रहे हैं दिखाया गया है और replicates. एक ही हालत और आरएनए मूल से नमूने बारीकी से उच्च reproducibility का संकेत तैनात हैं.

Discussion

यह लेख स्तनधारी कोशिकाओं में एक जीनोम व्यापक पैमाने पर translational गतिविधि में गुणात्मक और मात्रात्मक परिवर्तन पर कब्जा करने के लिए एक घर में विकसित विश्लेषण विधि के बाद अच्छी तरह से स्थापित polysome fractionation प्रोटोकॉल का वर्णन करता है. इस प्रोटोकॉल विशेष ध्यान के सफल समापन 1) सेल confluency करने के लिए भुगतान किया जाना चाहिए के लिए प्रसार दर और पोषक तत्वों की उपलब्धता mRNA अनुवाद गतिविधि के साथ सहसंबंधी और translatome की संरचना को प्रभावित कर सकते हैं के रूप में (, सेल confluency) replicates और प्रयोगात्मक शर्तों में संगत होना चाहिए, 2) रैपिड सेल (cycloheximide और बफ़र्स में RNAse inhibitors की मौजूदगी के बावजूद, सेल तेज और सेलुलर अर्क तुरंत आरएनए गिरावट और polysomes की हदबंदी को रोकने के लिए सेल के बाद सुक्रोज ढ़ाल पर मढ़ा जाना चाहिए होना चाहिए), 3) ढाल तैयारी (सुनिश्चित करने के लिए उच्च डेटा reproducibility, सूक्रोज ढ़ाल ढाल निर्माता और विशेष उपयोग कर तैयार किया जाना चाहिए) उन्हें संभाल जब सामाजिक ध्यान रखा जाना चाहिए.

Translational गतिविधि में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल राइबोसोम जुड़े प्रोटीन परिसरों को अलग करने और उनके शारीरिक कार्यों की स्थापना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. राइबोसोम जुड़े प्रोटीन परिसरों ढाल भागों से immunoprecipitated और पश्चिमी सोख्ता या जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है, जबकि यह अंत करने के लिए, स्तर और विभिन्न राइबोसोम जुड़े प्रोटीन की phosphorylation स्थिति, टीसीए तेज़ी से निर्धारित किया जा सकता पश्चिमी सोख्ता द्वारा पीछा किया. इस तकनीक की कमी धीमी ढाल अंश विधि जिसका बाध्यकारी कैनेटीक्स तेजी एसोसिएशन / हदबंदी में हैं भी कसकर बाध्य प्रोटीन की हदबंदी में परिणाम सकता है. नए संश्लेषित polypeptides तक जुड़े कारकों विशिष्ट उदाहरण हैं. राइबोसोम फार्म उभरते नए संश्लेषित polypeptides 3 जैसे रासायनिक पार linkers उपयोग कर राइबोसोम के साथ जुड़े प्रोटीन परिसरों पर स्थिर किया जा सकता है, 3'-dithiobis [sulfosuccinimidylpropionate] (DTSSP) 31. इस दृष्टिकोण से पता चला है कि सक्रिय सी Kinase 1 (RACK1) / C-Jun एन टर्मिनल kinase (JNK) / यूकेरियोटिक अनुवाद बढ़ाव कारक के लिए रिसेप्टर 1A2 (eEF1A2) जटिल 27 तनाव के जवाब में नए संश्लेषित polypeptides की गिरावट को नियंत्रित करता है. इसके अलावा, इसी तरह की कार्यप्रणाली प्रोटीन kinase सी Bii (PKCbII) यह नव संश्लेषित AKT polypeptides phosphorylates और नियंत्रित करता है जहां राइबोसोम पर होता RACK1 32 और mTOR जटिल 2 (mTORC2) की कि सक्रियण से राइबोसोम के लिए भर्ती किया गया है दिखा रहा है कि अध्ययन में इस्तेमाल किया गया था उनके स्थिरता 33,34.

Anota विश्लेषण के बाद polysome विभाजन विधि का प्रमुख सीमाएं हैं: कक्षों की एक अपेक्षाकृत उच्च संख्या (~ 15 x 10 6 कोशिकाओं) के लिए 1) आवश्यकता, 2) एक दिया mRNA अणु पर राइबोसोम के स्थानीयकरण के बारे में स्थितीय जानकारी की कमी है, और 3 सेलुलर और आणविक असमलैंगिक से संबंधित मुद्दों)सामान्य और ट्यूमर ऊतकों की geneity. आवश्यक सेल नंबर से संबंधित मुद्दों जिसका मात्रा में उच्च बहुतायत कोशिकाओं से प्राप्त उन लोगों (जैसे HELA कोशिकाओं) 35 के साथ सीमित कर रहे हैं कोशिकाओं की monosomes (80) को इसी absorbance के स्पेक्ट्रा चोटियों aligning से सुलझाया जा सकता है. इस तरह मानव ऊतकों के रूप में जटिल प्रणालियों से प्राप्त जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन की व्याख्या पर ऊतक विविधता के confounding प्रभाव से संबंधित मुद्दों पर चर्चा कर रहे हैं जबकि राइबोसोम की रूपरेखा तकनीक (नीचे देखें), एक दिया mRNA अणु पर राइबोसोम की सही स्थिति का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है लीक और मंजिला 36 द्वारा एक प्रकाशन में विस्तार से.

राइबोसोम संरक्षित टुकड़े (RPFs) RNAse मैं उपचार द्वारा उत्पन्न और गहरे अनुक्रमण 22 से विश्लेषण कर रहे हैं जिसमें हाल ही में, तकनीक रूपरेखा एक उपन्यास राइबोसोम, विकसित किया गया था. इस तकनीक है, जिससे अब तक unpr उपलब्ध कराने, एक एकल nucleotide संकल्प पर राइबोसोम स्थिति के निर्धारण की अनुमति देता हैराइबोसोम जीव विज्ञान में ecedented अंतर्दृष्टि. उदाहरण के लिए, राइबोसोम की रूपरेखा एक दिया mRNA अणु या तत्वों की पहचान पर राइबोसोम घनत्व के निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि इस तरह के वैकल्पिक दीक्षा साइटों, गैर-Aug codons में दीक्षा और ऐसे uORFs रूप नियामक तत्व के रूप में प्रभाव अनुवाद दीक्षा दरों. हालांकि, सही mRNA अनुवाद दक्षता आकलन करने के लिए राइबोसोम की रूपरेखा की क्षमता सीमित है कि कई पद्धति सीमाएं हैं. ये यादृच्छिक विखंडन और RNase मैं पाचन द्वारा शुरू की स्वतंत्र पूर्वाग्रहों शामिल, अनुवाद संदमक (जैसे इमेटिन और cycloheximide उदाहरण के रूप में बढ़ाव inhibitors अनुवाद दीक्षा स्थलों पर राइबोसोम संचय के लिए प्रेरित करने की संभावना है) द्वारा शुरू की पूर्वाग्रहों, झूठी सकारात्मक और नकारात्मक झूठी परिणामों की एक बड़ी संख्या में जुड़े ते स्कोर के रूप में अच्छी तरह से भविष्यवाणी करने में उनकी अशुद्धि के साथ कि प्रोटीन कोडिंग mRNAs 37 से ही शुरू पढ़ता है. शायद सबसे महत्वपूर्ण बात, जबकिराइबोसोम की रूपरेखा एक दिया mRNA अणु पर राइबोसोम स्थिति का प्रत्यक्ष पहचान देता है, एक दिया mRNA के साथ जुड़ा हुआ है कि राइबोसोम की संख्या परोक्ष रूप से कुल (बेतरतीब ढंग से खंडित mRNAs में मनाया उन पर RPFs (राइबोसोम जुड़े mRNA) में पढ़ता की आवृत्तियों सामान्य से अनुमान लगाया गया है mRNA). उदाहरण के लिए, चार "बी" mRNA अणुओं (बीए, बी बी, बी सी और बी) के पदों के लिए 1, 2, 3 और 4, राइबोसोम की रूपरेखा तकनीक का एक अंतर्निहित कमी पर चार राइबोसोम के कब्जे में हैं, जहां एक साधारण सेटिंग में अनुमति नहीं होगी एक सभी 4 राइबोसोम पदों 1 में बीए mRNA के साथ ही सहयोगी जहां परिदृश्य, 2, 3, और 4 और बा, बी बी, एबी और BD mRNA स्थिति 1, 2 पर एक भी राइबोसोम से प्रत्येक कब्जा कर रहे हैं, जहां एक परिदृश्य के बीच एक अंतर क्रमश: 3, और 4,. इसके विपरीत, polysome विभाजन के दौरान, polysome अखंडता जिससे राइबोसोम की एक निर्धारित संख्या (चित्रा 1) के साथ जुड़े mRNAs का ताल के अलगाव की अनुमति, संरक्षित है. यह आयातpolysome विभाजन और राइबोसोम की रूपरेखा के बीच चींटी भेद पूर्व विधि सीधे mRNP में mRNAs तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जबकि प्रकाश और भारी polysome भिन्न, बाद विधि संभावना mRNAs की वजह से हैं कि translatome में परिवर्तन पर कब्जा करने के लिए असफल हो जायेगी कि पता चलता है कि संक्रमण से भारी polysomes को mRNP अंश से बदलाव है कि उन का योगदान overestimating, जबकि भारी polysomes को प्रकाश. aforementioned तरीकों के बीच इन विसंगतियों के जैविक महत्व ऐसे eIF4E के प्रति संवेदनशील हैं कि उन के रूप में mRNAs का एक सबसेट की कि translational सक्रियण दिखा डेटा की एक बड़ी शरीर से रेखांकित किया गया है, जैसे कि उन के रूप में दूसरों को शरण भारी polysomes को प्रकाश से संक्रमण, जबकि 5'TOP तत्वों, सीधे राइबोसोम मुक्त mRNA 6 के पूल से भारी polysomes को भर्ती कर रहे हैं. दिलचस्प है, mTOR मार्ग समन्वित रूप से "eIF4E के प्रति संवेदनशील" और 5'TOP mRNAs 1 का अनुवाद मिलाना दिखाया गया है1. इसलिए, ऊपर चर्चा कर रहे हैं कि methodological मतभेद translatome पर mTOR अवरोध के प्रभाव का आकलन करने के लिए 38,39 और polysome fractionation 24 रूपरेखा राइबोसोम का उपयोग पढ़ाई के बीच निष्कर्ष के स्पष्ट मतभेद समझा जा सकता है.

अंत में, polysome विभाजन और राइबोसोम की रूपरेखा मुख्य रूप से क्रमश: mRNA, पर mRNA और राइबोसोम की स्थिति के साथ जुड़े राइबोसोम की संख्या के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं कि पूरक तरीके हैं. महत्वपूर्ण बात है, इन तरीकों की कमियों और फायदे होते हुए भी, यह दोनों प्रक्रियाओं द्वारा प्राप्त जीनोम चौड़ा डेटा पर्याप्त रूप से विश्लेषण किया और कार्यात्मक और biochemically पुष्टि कर रहे हैं कि आवश्यक रहता है.

Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की घोषणा.

Acknowledgments

इस शोध भी CIHR युवा अन्वेषक पुरस्कार के एक प्राप्तकर्ता है जो आईटी के लिए स्वास्थ्य अनुसंधान अनुदान की कनाडा के संस्थानों (CIHR एमओपी 115,195) और FRQ-एस, द्वारा समर्थित किया गया था; और स्वीडिश अनुसंधान परिषद और स्वीडिश कैंसर सोसायटी राजभाषा

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEPES Biobasic HB0264
MgCl2 Sigma M8266
KCl VWR CABDH4532
Dithiothreitol (DTT) Biobasic DB0058
Tris Biobasic TB0196
Glycoblue Ambion AM9515 RNA precipitation carrier
Sodium Deoxycholate  Sigma D6750
Triton X-100 Sigma X100
Cycloheximide Sigma C1988
Protease inhibitor cocktail  Roche 04693132001 Tablets (EDTA-free)
RNase inhibitor  Promega N2515
0.45 µm Filter System 150 ml Corning 431155
Sucrose Sigma S0389
RNeasy MinElute Cleanup kit  Qiagen 74204 RNA cleanup kit
Thin wall polyallomer ultracentrifuge tubes  Beckman Coulter 331372
SW41Ti Rotor Package with accessories Beckman Coulter 331336
Optima L100 XP ultra centrifuge Beckman Coulter DS-9340A
ISCO fraction collector  Brandel FC-176-R1
Type II Detector with Chart Recorder Brandel UA-6 UV detector
Tube Piercer w/Flow Cell and Syringe Pump Brandel BR-A86-5
UA-6 Detector Cable Brandel 60-1020-211
FC-176 Communication Cable Brandel FCC-176
Gradient Master Base Unit Biocomp 108-1 Gradient Maker
Gradient Forming Attachments Biocomp 105-914A-1R Gradient Maker attachment
Measurement Computing 8-channel 50 kHz Data Acquisition Device MicroDAQ USB-1208FS Analysis software attachment
Measurement Computing Data Acquisition Software MicroDAQ TracerDAQ Pro Analysis software (Download only)
10x buffer for sucrose gradients:
200 mM HEPES (pH7.6)
1 M KCl
50 mM MgCl2
100 µg/ml cycloheximide
1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free)
100 units/ml RNase inhibitor
Lysis buffer
5 mM Tris-HCl (pH7.5)
2.5 mM MgCl2
1.5 mM KCl 
1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free)]
Then add cycloheximide (CHX), DTT, RNAse inhibitor, Triton and Sodium Deoxycholate as indicated in the main text

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References

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