Polisoma Frazionamento e analisi dei mammiferi Translatomes su scala Genome-wide

Biology
 

Summary

Ribosomi svolgono un ruolo centrale nella sintesi proteica. Polyribosome (polisoma) frazionamento da saccarosio centrifugazione in gradiente di densità permette la determinazione diretta delle efficienze traduzione di mRNA individuali su una scala genome-wide. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per l'analisi biochimica dei ribosomi e fattori polisoma associati come accompagnatori e molecole di segnalazione.

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Gandin, V., Sikström, K., Alain, T., Morita, M., McLaughlan, S., Larsson, O., Topisirovic, I. Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale. J. Vis. Exp. (87), e51455, doi:10.3791/51455 (2014).

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Abstract

traduzione dell'mRNA gioca un ruolo centrale nella regolazione dell'espressione genica e rappresenta il processo che richiede più energia nelle cellule di mammifero. Pertanto, disregolazione della traduzione dell'mRNA è considerato a svolgere un ruolo importante in una varietà di stati patologici tra cui il cancro. I ribosomi ospitano anche accompagnatori, che facilitano la piegatura di polipeptidi nascenti, la funzione e la stabilità dei polipeptidi di nuova sintesi modulando in tal modo. Inoltre, dati emersi indicano che i ribosomi servono come piattaforma per un repertorio di molecole di segnalazione, che sono implicati in una varietà di modificazioni post-traduzionali di polipeptidi di nuova sintesi che emergono dal ribosoma, e / o componenti di macchine traslazionale. Qui, un metodo consolidato di frazionamento ribosoma con densità di saccarosio centrifugazione in gradiente è descritto. In concomitanza con l'algoritmo sviluppato in-house "anota" questo metodo consente la determinazione diretta di differentitraduzione renziale dei singoli mRNA su scala genoma. Inoltre, questo protocollo versatile può essere utilizzato per una varietà di studi biochimici volti a sezionare la funzione di complessi proteici ribosoma-associata, compresi quelli che svolgono un ruolo centrale nella piegatura e degradazione di polipeptidi di nuova sintesi.

Introduction

Le reti di regolazione che controllano l'espressione genica sono stati ampiamente studiati negli ultimi due decenni. La stragrande maggioranza di questi sforzi di ricerca focalizzati su regolazione trascrizionale, per cui i cambiamenti nei livelli di mRNA steady-state su scala genome-wide sono stati usati per determinare i cosiddetti "profili di espressione genica". Recenti studi rivelano che i livelli di mRNA di stato stazionario solo vagamente corrispondono alla composizione del proteoma 1,2, indicando così che i meccanismi post-trascrizionali, compresa la traduzione dell'mRNA, svolgono un ruolo importante nella regolazione dell'espressione genica 3,4. Infatti, è stato stimato che circa il 50% dei livelli di proteine ​​è determinato a livello di traduzione dell'mRNA in immortalizzate fibroblasti di topo 5.

Traduzione mRNA è un processo altamente regolato durante il quale mRNA vengono tradotti in proteine ​​con un'azione orchestrata dei ribosomi, RNA transfer (tRNA) e fattori accessori commonly indicato come fattori di traduzione (TFS) 6. La sintesi proteica è la più processo di consumo di energia nelle cellule di mammifero 7 e quindi tariffe di traduzione mRNA globali sono adeguati per accogliere la disponibilità di nutrienti e tassi di proliferazione delle cellule 8. Oltre ad alterazioni dei tassi globali di traduzione mRNA, vari stimoli extracellulari (ad esempio ormoni e fattori di crescita), segnali intracellulari (ad esempio, i livelli di aminoacidi) e diversi tipi di stress (ad esempio ER-stress) indurre modifiche selettive nelle piscine di mRNA che sono corso di traduzione (translatome) 6. A seconda del tipo di stimolo, attività definizione di alcuni, ma non tutti gli mRNA sono notevolmente influenzate, ottenendo in tal modo variazioni del proteoma necessari per montare una risposta cellulare rapida 6. Questi cambiamenti qualitativi e quantitativi nella translatome sono pensati per essere mediata dalla interazione tra fattori trans-acting (es. 6,9. Ad esempio, i cambiamenti nei livelli e / o attività di rate-limiting inizio della traduzione fattori eIF4E e eIF2 selettivamente modulano la traduzione di trascrizioni in base alle caratteristiche specifiche 5'UTR 6. eIF4E e eIF2 sono necessari per l'assunzione di mRNA e tRNA iniziatore al ribosoma, rispettivamente, 6. Un aumento dell'attività eIF4E rafforza selettivamente traduzione di mRNA ospitano 5'UTRs lunghe e altamente strutturate, comprese quelle proliferazione codifica e la sopravvivenza stimolante proteine, tra cui cicline, c-myc e Bcl-xL 10. A sua volta, l'inattivazione di eIF2 porta ad una proteina sintesi arresto globale, mentre selettivamente regolando traduzione di mRNA contenenti brevi inibitori monte open reading frames (uORFs) nelle loro 5'UTRs, come quelli che codificano maestro tregolatori ranscriptional della risposta spiegata della proteina (ad es ATF4). In risposta a vari stimoli, tra cui nutrienti, fattori di crescita e ormoni, l'obiettivo meccanicistico / mammifero della rapamicina (mTOR) percorso stimola l'attività eIF4E inattivando la proteina 4E-binding (4E-BP) famiglia di soppressori di traduzione, mentre la via MAPK fosforila direttamente eIF4E 6,11. A sua volta, chinasi eIF2α (cioè Perk, PKR, HRI e GCN2) inibiscono eIF2 fosforilando sua subunità regolatoria eIF2α in risposta alla privazione di nutrienti, ER-stress e infezione da virus 6,12. Alterazioni dell'attività e / o espressione di TF, altri componenti del macchinario traduzionale e fattori regolatori compresi miRNAs sono stati osservati in diversi stati patologici tra cui il cancro, sindrome metabolica, disturbi neurologici e psichiatrici e malattie renali e cardiovascolari 13-19. Collettivamente, questi dati indicano che me traslazionalechanisms giocano un ruolo centrale nel mantenimento della omeostasi cellulare e che la loro abrogazione gioca un ruolo centrale nell'eziologia di varie malattie umane.

Qui, un protocollo per frazionamento di polisomi da saccarosio gradiente di densità centrifugazione in cellule di mammifero, che viene utilizzato per separare polisomi da monosomes, subunità ribosomiale e particelle messaggero ribonucleoproteiche (mRNPs) è descritto. Ciò consente discriminazioni tra tradotto in modo efficiente (associata con polisomi pesanti) da mal tradotte (associata a polisomi leggeri) mRNA. In questo saggio, ribosomi sono immobilizzati sul mRNA utilizzando inibitori traduzione allungamento come cycloheximide 20 e estratti citosolici sono separati sul 5-50% di saccarosio lineare gradienti di densità mediante ultracentrifugazione. Frazionamento posteriori dei gradienti di saccarosio permette l'isolamento di mRNA in base al numero di ribosomi si legano a. RNA estratto da ogni frazione può essere quindi utilizzato per determinarecambiamenti nelle distribuzioni di mRNA in tutto il gradiente tra condizioni diverse, per cui l'aumento dell'efficienza traduzionali dalla parte superiore alla parte inferiore del gradiente. Northern Blotting o trascrizione inversa della polimerasi quantitativa reazione a catena (qRT-PCR) vengono utilizzati per determinare i livelli di mRNA in ogni frazione.

In alternativa, frazioni contenenti polisomi pesanti (tipicamente più di 3 ribosomi) sono raggruppati e livelli di mRNA polisoma associati genome-wide sono determinati utilizzando microarray o deep-sequencing. E 'della massima importanza sottolineare che i livelli di mRNA polisoma associati sono, oltre alla traduzione, colpiti da meccanismi trascrizionali e post-trascrizionali che influenzano i livelli di mRNA citosolici 21. Pertanto, per determinare le differenze nella traduzione, utilizzando i dati a livello di genoma da mRNA polisoma associata è necessario correggere gli effetti dai passi nell'espressione via gene che sono a monte di traduzionizione 21. Per consentire tale correzione, RNA citosolico viene preparato in parallelo con polisoma associata RNA da ogni campione e dei livelli di mRNA steady-state genome-wide sono determinati 21. Attualmente, la cosiddetta "traduzione-efficienza" (TE) punteggi (cioè il log-rapporto tra i dati di mRNA polisoma associati e dati di mRNA citosolici) sono spesso impiegati per correggere gli effetti dei cambiamenti nei livelli di mRNA citosolici sull'efficienza definizione di un dato mRNA 22. Tuttavia, utilizzando i punteggi TE per identificare traduzione differenziale è associata a un numero considerevole di falsi risultati positivi e falsi negativi a causa di una proprietà matematica dei punteggi TE comunemente indicato come correlazione spuria 27. Infatti un sondaggio di insiemi di dati provenienti da più laboratori indicato che tali correlazioni spurie sembrano essere inevitabili quando si analizzano i cambiamenti nei translatomes 23. Ciò ha indotto lo sviluppo della "analisi di tr differenziale anslation "(anota) algoritmo, che non soffre delle carenze di cui sopra 23. Durante anota-analisi di un modello di regressione viene utilizzata per ricavare le misure di attività traslazionale indipendenti dei livelli di RNA citosolici. Tali misure sono poi confrontati tra le condizioni e le statistiche viene calcolato. L'utente ha la possibilità di applicare un metodo restringimento varianza, che migliora potenza statistica e riduce la comparsa di risultati falsi positivi in studi con poche ripetizioni 24. Significativamente, è stato recentemente dimostrato che perturbazioni nella translatome catturati da anota, ma i punteggi non TE, correla con variazioni del proteoma 25. Pertanto, si raccomanda vivamente di applicare l'analisi anota per l'identificazione delle variazioni di traduzione su scala genome-wide. Mentre i fondamenti teorici dell'algoritmo anota sono state discusse in dettaglio in precedenza 21,23,26, qui focus è su come applicare in pratica.

ve_content "> Oltre a studiare i cambiamenti nell'attività traduzione dell'mRNA nella cella, questo protocollo frazionamento ribosoma può essere utilizzata per isolare e caratterizzare biochimicamente e funzionalmente ribosomi e complessi proteici polisoma-associata. Questo approccio è stato impiegato con successo in passato per identificare complessi che regolano la stabilità dei polipeptidi di nuova sintesi 27 e / o sono coinvolti nella fosforilazione di componenti del macchinario traduzionale. L'applicazione del metodo polisoma frazionamento saranno discussi brevemente.

Protocol

1. Gradiente di saccarosio Preparazione

  1. Preparare 100 ml di 60% (w / v) di soluzione di saccarosio in DDH 2 O. Soluzione deve essere filtrata attraverso un filtro da 0,22 micron per impedire intasamento del tubo durante la fase di frazionamento (passo 3.5).
  2. Preparare 5 ml di 10x tampone di gradiente di saccarosio: HEPES 200 mM (pH 7.6), 1 M KCl, 50 mM MgCl 2, 100 pg / ml cycloheximide, 1x inibitore della proteasi cocktail (gratuito-EDTA), 100 unità / inibitore della RNasi ml.
  3. Utilizzando la soluzione al 60% preparata come descritto al punto 1.1, fare 40 ml di 5% e soluzioni di saccarosio 50% in 1x tampone gradiente di saccarosio.
  4. Utilizzare il blocco Marker fornito con il produttore di sfumatura per segnare il punto mezzo pieno su ciascun tubo ultracentrifugazione polyallomer per la stratificazione (6 tubi ultracentrifugazione in totale). Utilizzo del dispositivo di stratificazione fornito con la macchina gradiente, aggiungere la soluzione di saccarosio 5% fino a raggiungere il punto di mezzo pieno. Quindi, aggiungere una soluzione di saccarosio al 50% dal fondo fino alla interfasso tra le due soluzioni raggiunge il punto di mezzo pieno. Particolare attenzione deve essere assunto durante questa fase in modo che le sfumature siano il più possibile simili, in quanto ciò è essenziale per ottenere un'alta riproducibilità (vedi sotto).
  5. Sigillare i tubi con tariffa tappi zonali forniti con il produttore di gradiente e trasferire i tubi sigillati al titolare tubo sul creatore di gradiente.
  6. Eseguire il creatore gradiente per ottenere un 5% al ​​50% gradiente lineare. 6 gradienti lineari saranno formati in pochi minuti dalla rotazione ad alta inclinazione.
    Nota: gradienti di saccarosio possono essere utilizzati immediatamente o conservati a -80 ° C per 6 mesi.

2. Isolamento e sedimentazione di polisomi

  1. A seconda del tipo di cellula, sementi celle in 1-5 15 cm piastre Petri (~ 15 x 10 6 cellule) almeno un giorno prima della lisi. Il giorno degli esperimenti celle devono essere ~ 80% confluenti. Nota: confluenza ottimale è fondamentale perché i tassi di traduzione e di proliferazione sono direttamenteproporzionali 8, e quindi polisomi dovrebbero essere analizzati in cellule attivamente proliferanti (cioè tassi di conversione saranno significativamente goccia in più di cellule confluenti che bassa confluenza di cellule non può fornire materiale sufficiente per ulteriori analisi). Le eccezioni a questa regola può essere fatto se per esempio lo sperimentatore è interessato a studiare l'effetto di inibizione da contatto sulla traduzione. Tuttavia, le cellule non devono essere tenuti sotto sulle condizioni confluenti per troppo tempo, in quanto ciò potrebbe avere effetti involontari sul translatome.
    Se è necessario trasfezione, la maggior parte dei kit disponibili in commercio non influenzano i livelli polisoma. Poiché il giorno della trasfezione le cellule devono essere 80-90% confluenti, si raccomanda di propagare le cellule 24 ore dopo la trasfezione e isolare polisomi 48 ore dopo la trasfezione di cellule ~ 80% confluenti.
  2. Incubare le cellule con cicloesimide ad una concentrazione finale di 100 mg / ml in terreno di crescita per 5 min a 37 ° C e 5% Di CO 2; e lavare le cellule due volte con 10 ml di ghiacciata 1x PBS contenente 100 pg / ml cycloheximide. Cicloeximide è un inibitore traduzione allungamento che "congela" ribosomi sul mRNA, impedendo così eseguito ribosoma off 20.
  3. Raschiare delicatamente le cellule, in 5 ml di ghiacciata 1x PBS contenenti 100 pg / ml cicloeximide e raccoglierli in un tubo da 50 ml. È importante che questo passo è eseguito ragionevolmente velocemente lasciando le cellule in ghiaccio per un periodo prolungato di tempo drasticamente diminuire la qualità della preparazione polisoma.
  4. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 200 xg per 5 minuti a 4 ° C.
  5. Eliminare le cellule surnatante e risospendere in 425 ml di tampone ipotonico [(5 mM Tris-HCl (pH 7.5), 2.5 mM MgCl 2, KCl 1.5 mM e 1x inibitore della proteasi cocktail (gratuito-EDTA)], aggiungere 5 ml di 10 mg / CHX ml, 1 ml di 1 M DTT, 100 unità di inibitore di RNAsi e vortex per 5 sec seguita da aggiunta di 25 ml di 10% Triton X-100 (concentrazione finale 0,5%) e 25 ml di 10% di sodio desossicolato (concentrazione finale 0,5%) e vortex per 5 sec. A causa di rigonfiamento delle cellule, il buffer ipotonico interromperà la membrana plasmatica, considerando che le condizioni detergente delicato vengono utilizzati per solubilizzare citosolica e ribosomi del reticolo endoplasmatico associate senza interrompere la busta nucleare.
  6. Lisati centrifugare a 16.000 xg per 7 minuti a 4 ° C e il trasferimento di surnatante (~ 500 microlitri) per un nuovo tubo pre-raffreddata da 1,5 ml. Misurare OD a 260 nm per ciascun campione utilizzando uno spettrofotometro e mantenere il 10% del lisato come ingresso che verrà utilizzata per determinare citosolici livelli di mRNA di stato stazionario. Diluire l'ingresso a 750 microlitri RNasi libero in H 2 O, aggiungere 750 ml di Trizol e il flash congelare in azoto liquido.
  7. Trasferire i tubi ultracentrifuga contenenti gradienti di saccarosio in secchi rotore pre-refrigerati. Rimuovere 500 microlitri dalla parte superiore della gradienti di saccarosio. Regolare lisati in modo che contengano lo stesso OD (10-20 OD a 260 nm) in 500 ml di tampone di lisi (descritto nel passo 2.5) e caricarli su ogni gradiente di saccarosio.
    Nota: È importante caricare immediatamente lisati sulle pendenze, in modo critico migliorare la qualità delle preparazioni polisoma.
  8. Pesare ed equilibrare ogni sfumatura prima della ultra-centrifugazione.
  9. Centrifugare a 222.228 xg (36.000 rpm), per 2 ore a 4 ° C con rotore SW41Ti.
    Nota: Al fine di non perturbare gradienti di saccarosio, l'opzione freno "basso" dovrebbe essere selezionata.

3. Polisoma frazionamento e RNA Estrazione

  1. Preparare il collettore di frazioni pulendo con acqua priva di RNAsi calda contenente RNase ZAP (un paio di spruzzi). Ripetere questa fase con solo acqua RNAsi calda gratuita. Interruttore lampada UV e attendere la luce verde a comparire.
  2. Rimuovere con attenzione i tubi dal rotore e disporli sul ghiaccio. Accendere il computer pompa, rivelatore UV e raccoglitore di frazioni. Impostare pompa a 3 ml / min e fill il tubo con la soluzione inseguimento [60% (w / v) contenente saccarosio 0,02% (w / v) di blu di bromofenolo] fino a raggiungere l'ago. Assicurarsi vedere almeno una goccia che esce l'ago, e accertare che nessuna bolla sono introdotti nella siringa pompa o tubazione.
  3. Mettere 2 ml provette in un collettore di frazioni. Avviare il programma di analisi e di impostare la sensibilità di + / - 10 MeV. Impostare "base dei tempi" per 100 sec.
  4. Posizionare ciascuna provetta ultracentrifugazione nel rivelatore UV assicurandosi che il tubo sia in posizione ortogonale. Forare il tubo con l'ago ruotando la manopola sotto il supporto del tubo.
  5. Impostare la pompa a 1,5 ml / min e raccogliere le frazioni di impostazione del tempo di 30 sec sul collettore frazione (questo si tradurrà in ~ 750 microlitri di ogni frazione). Mettere la pompa in "posizione remota", avviare la pompa e collettore frazione, e allo stesso tempo avviare la registrazione utilizzando il tracciatore DAQ. Ciò avvierà uno spostamento verso l'alto della gra saccarosiodiente e una rivelazione simultanea di assorbanza UV a 254 nm. Interrompere la raccolta non appena la prima goccia di soluzione di inseguimento cade in un tubo di raccolta da 2 ml.
  6. Salvare il tracciato in formato csv e (una volta che passo 3.7 è completato), in un foglio di calcolo, effettuare le seguenti operazioni per identificare la posizione di ogni frazione nel profilo assorbanza UV.:
    1. Selezionare la colonna contenente i valori corrispondenti a assorbanza a 254 nm (canale 0).
    2. Creare una linea liscia della dispersione delle assorbanze.
    3. Impostare l'unità principale dell'asse X a 300 (valore ottenuto dividendo il volume del 5% -50% gradiente di saccarosio (~ 12 ml) entro la raccolta di ogni frazione (30 sec).
  7. Aggiungere 750 ml di Trizol in ogni frazione e flash congelare le frazioni in azoto liquido.
  8. Isolare polisoma associati e citosolica (da 2,6) RNA utilizzando il protocollo Trizol secondo le istruzioni del produttore. Per aumentare la resa di RNA, procedere con la precisione di RNApitation a -80 ° C per 30 minuti oa -20 ° C per una notte.
    Nota: Poiché la quantità di RNA precipitato dalle frazioni polisomi potrebbe non essere chiaramente visibile si consiglia di aggiungere vettore. Aggiungere 1 ml di vettore al tubo prima della fase di precipitazione RNA durante il protocollo Trizol.
  9. Determinare quali frazioni corrispondono a mRNA associati a> 3 ribosoma (utilizzando l'approccio descritto 3.6) e piscina per queste frazioni. Utilizzare il kit RNA pulizia per eseguire la pulitura del pool di RNA polisoma associata e citosolica (da 2,6). Inviare i campioni ad un impianto per determinare i livelli di mRNA genome-wide utilizzando microarrays o deep-sequencing.
    Se la traduzione di specifici mRNA deve essere monitorata mediante RT-qPCR, si consiglia di utilizzare 500 ng di RNA (da frazioni raccolte contenenti> 3 ribosomi o RNA totale) per sintetizzare cDNA.
    Nota: mRNA associati> 3 ribosomi è impostato arbitrariamente per rappresentare mRNA tradotte in modo efficiente e contenere più del 80% della nuova sintedimensioni polipeptidi 28,29. Compreso frazioni corrispondenti alla luce (1-2), medio (2-3) e polisomi pesanti (> 3) sarebbe vantaggioso, ma questi aumenteranno il numero dei campioni da 2 volte (4 vs 2 per condizioni) e quindi la costo dell'esperimento. Nonostante che si prevede che la diminuzione dei costi di deep-sequenziamento e analisi microarray in futuro, dovrebbe favorire il secondo approccio, è consigliabile che durante la convalida, distribuzione di singoli mRNA è monitorato in ogni frazione.

4. Genoma Analisi di mRNA traduzione

  1. Installare R, Bioconductor e il pacchetto anota:
    1. Installare R (download da r-project.org) e avviare un R-session.
      Nota: R è disponibile per tutti i sistemi operativi e anota verrà eseguito su ognuna di esse.
    2. Installare Bioconductor (bioconductor.org). Codice R è interpretato attraverso il (ad esempio, la console R R-terminal in Windows - che viene lanciato da fareuble clic sul collegamento R). Bioconductor è installato digitando (in R-terminale):

      fonte ("http://bioconductor.org/biocLite.R")

      biocLite ()
    3. Installare il pacchetto Bioconductor anota (e il pacchetto qvalue che anota richiede) digitando (nella R-terminale):

      fonte ("http://bioconductor.org/biocLite.R")

      biocLite (c ("anota", "qvalue"))
    4. Verificare che il pacchetto è stato installato correttamente e aprire il manuale anota digitando (in R-terminale):

      biblioteca ("anota")

      vignette ("anota")
    5. Nota: aiuto supplementare per tutte le funzioni che vengono utilizzate nel pacchetto anota possono essere trovate sia alla pagina web anota (http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/anota.html) oppure utilizzando la funzione di aiuto all'interno di R. Ad esempio, per ottenere aiuto sulla funzione anotaPerformQc andare al R-terminal e il tipo (si noti che questo funziona solo quando il pacchetto anota è stato caricato):

      biblioteca ("anota") # carica il pacchetto anota

      ? AnotaPerformQc # apre aiuto per questa funzione
  2. Importare dati a R:
    1. Preparare dati di espressione per l'analisi. I dati devono essere pre-trattati (cioè normalizzato e controllato) rispetto alla tecnica che è stata utilizzata per misurare i livelli di mRNA. Valori di ingresso devono essere login trasformati, più comune è log2. Compilare una tabella con i dati per tutti i campioni di RNA polisoma associati e una per tutti i campioni di RNA citosolico. La prima colonna deve contenere il gene-identificatori seguite da una colonna di dati per campione; la prima riga dovrebbe includere nomi per i campioni. E 'fondamentale che le tabelle sono identiche ordine del campione e l'ordine gene identico. Salvare i file come file di testo delimitato da tabulazioni chiamato "myPolysomeData.txt" e "myCytosolicData.txt".
    2. In questo esempio due classi di esempio sono utilizzati (controllo o malato) con 3 repliche per classe, generando 6 campioni con questo ordine: C1, C2, C3, D1, D2, D3 in entrambi i file myCytosolicData.txt e myPolysomeData.txt. Anota richiede almeno 3 repliche per condizione quando ci sono due classi di esempio. Questi dovrebbero essere replicati biologici indipendenti.
    3. Creare una directory che contiene i file di input dati (myPolysomeData.txt e myCytosolicData.txt). Apri R da questa directory. In Windows / Mac questo può essere fatto copiando un R-scorciatoia in questa directory e il lancio di R utilizzando questa scorciatoia (il lavoro direttamente può anche essere modificata utilizzando i menu a scorrimento).
    4. Creare un file chiamato myCode.R all'interno della directory appena creata e aprirlo con un programma di editing di testo. Scrivere il codice in questo file.
    5. Per caricare i dati in R scrivere il codice seguente al file myCode.R (ricordatevi di salvare nuovamente il file dopo ogni aggiunta di codice). Sotto è una s passo-tep spiegazione del codice, ma tutto il codice può essere scritta anche inizialmente e la funzione di sorgente (che esegue il codice, vedi sotto) usato una sola volta:

      # # Questa carica la libreria anota

      biblioteca (anota)

      # # Questo carica i dati di input in R

      dataCyto <- as.matrix (read.table ("myCytosolicData.txt", header = TRUE, row.names = 1, settembre = " t"))

      dataPoly <- as.matrix (read.table ("myPolysomeData.txt", header = TRUE, row.names = 1, settembre = " t"))
    6. Eseguire il codice in R digitando direttamente nel terminale R:

      fonte ("myCode.R")
    7. Verificare che i dati sono stati caricati correttamente digitando (in R-terminale):
      testa (dataCyto) # mostrerà superiore della tabella dataCyto
      testa (dataPoly)
  3. Identificazione di geni differenzialmente tradotti:
    1. Generare un vettore che descrivele categorie di esempio (un vettore è un tipo di oggetto in R). Questo vettore dovrebbe riflettere l'ordine del campione in myPolysomeData.txt e myCytosolicData.txt in modo che tutti e tre gli oggetti hanno un ordine identico dei campioni. Il vettore sarà utilizzato durante le spiegazioni anota su quali campioni da confrontare. Aggiungere il seguente al file myCode.R:

      # # Si noti che i campioni replicati hanno una classe campione identico

      # # Descrizioni (es. "C" o "D"), in questo vettore.

      myPhenotypes <- c ("C", "C", "C", "D", "D", "D")
    2. Effettuare il controllo della qualità del set di dati. Ci sono un certo numero di misure di qualità che devono essere valutate prima anota può essere utilizzato per l'analisi. Questi sono discussi in dettaglio nel manuale anota. Aggiungere questo codice myCode.R file e salvarlo:

      anotaQcOut <- anotaPerformQc (datat = dataCyto, dataP = dataPoly,phenoVec = myPhenotypes)

      anotaResidOut <- anotaResidOutlierTest (anotaQcObj = anotaQcOut)
    3. Eseguire il codice digitando in R-terminale:

      fonte ("myCode.R")

      Questo genererà un numero di file di output, che può essere esaminato come indicato nel manuale anota.
    4. Identificare i geni differenzialmente tradotte. I campioni saranno confrontati in base all'ordine alfabetico dei nomi forniti al parametro "phenoVec" (cioè il "myPhenotypes" vettoriale) a meno che non siano specificati dall'utente (tramite il parametro "contrasti"). Aggiungere il seguente codice al myCode.R file e la finitura utilizzando il comando "fonte" all'interno del R-terminale come sopra descritto:

      anotaSigOut <- anotaGetSigGenes (datat = dataCyto, dataP = dataPoly, phenoVec = myPhenotypes, anotaQcObj = anotaQcOut)
    5. Utilizzare la guida per anotaGetSigGenes per capire come l'Oscita è formattato e vedere come scegliere le categorie di esempio per confrontare digitando (in R-terminale):

      ? anotaGetSigGenes
    6. Filtra e trama geni che sono differenzialmente tradotti. Ci sono diverse soglie che possono essere applicati all'interno della funzione anotaPlotSigGenes e con l'aiuto sarà semplificare una combinazione personalizzata di tali soglie. Per selezionare i geni affidabile analizzati applicare il minSlope (-0,5), maxSlope (1.5) e slopeP impostazioni (0.01).
      Nota: Inoltre, le impostazioni applicabili ai RVM 23,26,30 tasso di falsi scoperta (FDR) (0,15) e piega le variazioni (log2 [1.5]), può ad esempio essere utilizzato per identificare geni differenzialmente tradotte. Altri filtri come "selDeltaPT" può essere utile per un filtraggio più rigorosa (ad esempio impostando selDeltaPT a log2 [1.5]). È inoltre necessario specificare che il confronto deve essere filtrata (utilizzando l'argomento selCont). Applicare le impostazioni descritte aggiungendo la seguente riga al myCode.Ril file:

      anotaSigFiltered <- anotaPlotSigGenes (anotaSigObj = anotaSigOut, selContr = 1, minSlope = (-0,5), maxSlope = 1.5, slopeP = 0,01, maxRvmPAdj = 0,15, minEff = log2 (1.5), selDeltaPT = log2 (1.5))
    7. Effettuare l'analisi utilizzando la funzione di sorgente dal R-terminale come descritto sopra. Ciò anche generare un output grafico. Esaminando questa uscita è un buon punto di partenza per valutare le prestazioni di analisi e di individuare le eventuali modifiche necessarie alle impostazioni.
    8. Generare una tabella di output. Aggiungere il seguente codice al file myCode.R:

      write.table (anotaSigFiltered $ selectedRvmData, file = "MySignificantGenes.txt", settembre = " t")
    9. Eseguire il codice utilizzando la funzione di origine nel terminale R. Le colonne della tabella risultante sono spiegate nella Guida per la funzione anotaPlotSigGenes.

Representative Results

mTOR è un importante nodo della rete cellulare che coordina i tassi globali di sintesi della proteina con la disponibilità di nutrienti 19. Traduzione mRNA è regolata principalmente al iniziazione fattore limitante 6. La percentuale di ribosomi impegnati in polisomi correla positivamente con i tassi di inizio della traduzione 28. Un esempio di applicazione del metodo polisoma frazionamento per studiare il ruolo della segnalazione mTOR nella mediazione degli effetti dell'insulina sulla traduzione dell'mRNA è presentato. A questo scopo, cellule di carcinoma mammario MCF7 umane sono state mantenute in basso siero e quindi stimolate con solo o in combinazione con l'inibitore mTOR sito attivo Torin1 insulina. Cellule non stimolate che sono stati tenuti in maniera continua in basso siero, servito come controllo. mRNPs, monosome (80S) e le frazioni polisoma sono stati separati utilizzando il metodo polisoma frazionamento. Rispetto alle cellule di controllo, insulina indotto un aumento di assorbanza in frazioni gradiente corrispondentia polisomi, accompagnata da una concomitante diminuzione di assorbanza nella frazione monosome (Figura 1). Questi risultati indicano che la percentuale di ribosomi impegnati in polisomi è aumentata in insulina trattati rispetto alle cellule di controllo, indicando quindi che, come previsto, l'insulina stimola tempi di inizio della traduzione globali. Torin1 invertito gli effetti dell'insulina sui profili di assorbanza (Figura 1), avvalorando così i risultati che la segnalazione mTOR svolge un ruolo importante nella mediazione degli effetti dell'insulina sulle macchine traduzione 19.

Sulla base di un principio che le incongruenze in preparazione pendenza non può essere evitato, questioni sono state sollevate quanto concerne la riproducibilità dei dati ottenuti con il metodo polisoma frazionamento 22. Per testare empiricamente questo problema potenzialmente deleterio, citosolica e pesante RNA polisoma-associata (mRNA associati con 4 e più ribosomi) sono stati isolati da cellule MCF7 trattati solo con insulina o insulina in combinazione con Torin1 da 4 repliche biologiche indipendenti (Figura 2). Gli effetti di insulina e Torin1 sulla composizione del citosolica e pesante mRNA polisoma associati in ogni replica è stata determinata su scala genoma utilizzando un approccio microarray. Per determinare la riproducibilità del metodo polisoma frazionamento è stato applicato l'analisi delle componenti principali (PCA). Tale analisi ha mostrato che i campioni appartenenti a ciascuna condizione sono stati ben posizionati entro i primi due componenti mentre le diverse condizioni erano ben separati (Figura 2). Questi risultati dimostrano che il metodo polisoma frazionamento come descritto qui è altamente riproducibile e pertanto opportuno studiare i cambiamenti quantitativi e qualitativi in ​​traduzione a livello genoma.

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Figura 1. Profili polisomi che mostrano gli effetti della deprivazione di siero, insulina e mTOR segnalazione sulla traduzione globale MCF7. MCF7 cellule sono state private di nutrienti (mantenuti nello 0,1% FBS) per 16 ore e trattati con insulina 5 nM (Ins) da solo o in combinazione con 250 nM Torin1 (Ins + Torin1) per 4 ore. Cellule non trattate che sono state continuamente privi di nutrienti (0,1% FBS) sono stati usati come controllo. I corrispondenti sono stati estratti citosolici sedimentate mediante centrifugazione su gradiente di saccarosio 5-50%. Sono indicati subunità ribosomiale gratuite (40S e 60S), monosomes (80S) e il numero di ribosomi nelle frazioni polisoma.

Figura 2
Figura 2. Dati genome-wide ottenuti con polysome profiling è altamente riproducibile. MCF7 cellule sono state trattate come in Figura 1. citosolico e polisoma associate RNA (> 3 ribosomi) è stato estratto da 4 repliche biologiche indipendenti e dei loro livelli di mRNA genome-wide sono stati determinati utilizzando matrici GeneTitan (Affymetrix). PCA è stato utilizzato per valutare la riproducibilità dei dati risultanti. Vengono mostrati i primi due componenti PCA per tutti i trattamenti (T1 = Torin 1; ctrl = controllo; Ins = insulina), l'origine di RNA (C = citosolica; P = polisoma associate) e replica. I campioni della stessa condizione e origine RNA sono strettamente posizionati indicando elevata riproducibilità.

Discussion

Questo articolo descrive un protocollo polisoma frazionamento consolidata seguita da un metodo di analisi sviluppato in-house per la cattura delle modifiche qualitative e quantitative dell'attività traslazionale su scala genoma in cellule di mammifero. Per il completamento di questo protocollo particolare attenzione deve essere rivolta a 1) confluenza delle cellule (come i tassi di proliferazione e disponibilità di nutrienti in correlazione con l'attività di traduzione mRNA e possono influenzare la composizione del translatome, confluenza delle cellule dovrebbe essere coerente tutti replicati e le condizioni sperimentali), 2) lisi cellulare rapida (Nonostante la presenza di cicloesimide e inibitori RNasi nei buffer, lisi dovrebbe essere rapido ed estratti cellulari devono essere sovrapposto gradienti di saccarosio subito dopo lisi per prevenire la degradazione dell'RNA e la dissociazione di polisomi), 3) Preparazione Gradiente (per garantire elevata riproducibilità dei dati, gradienti di saccarosio devono essere preparati utilizzando il creatore del gradiente e speassistenza sociale dovrebbe essere presa quando si maneggiano loro).

Oltre a studiare le variazioni dell'attività traduzionale, questo protocollo può essere utilizzata per isolare complessi proteici ribosomi associati e stabilire le loro funzioni fisiologiche. A tal fine, i livelli e stato di fosforilazione di varie proteine ​​ribosoma associate possono essere determinati mediante precipitazione TCA, seguita da Western blotting, mentre complessi proteici ribosoma-associati possono essere immunoprecipitate da frazioni gradiente e analizzati mediante Western blotting o spettrometria di massa. Un inconveniente di questa tecnica è che il metodo frazione curva lenta potrebbe causare dissociazione delle proteine ​​anche strettamente legati cui cinetica di legame sono in rapida associazione / dissociazione. I fattori associati a polipeptidi di nuova sintesi sono esempi tipici. Polipeptidi di nuova sintesi emergenti formano i ribosomi possono essere immobilizzati su complessi proteici associati ribosomi utilizzando chimici reticolanti come 3, 3'-ditiobis [sulfosuccinimidylpropionate] (DTSSP) 31. Questo approccio ha rivelato che il recettore attivato C chinasi 1 (RACK1) / c-Jun chinasi N-terminale (JNK) / eucariotico fattore di traslazione di allungamento 1A2 (eEF1A2) complessa regola la degradazione di polipeptidi di nuova sintesi in risposta allo stress 27. Inoltre, metodologia simile è stato utilizzato in studi che dimostrano che la proteina chinasi C BII (PKCbII) viene reclutato per ribosomi dal RACK1 32 e che l'attivazione del complesso di mTOR 2 (mTORC2) avviene sui ribosomi dove fosforila polipeptidi AKT nuova sintesi e regola il loro stabilità 33,34.

Le principali limitazioni del metodo polisoma frazionamento seguita da analisi anota sono: 1) necessità di un numero relativamente elevato di cellule (~ 15 x 10 6 cellule), 2) mancanza di informazione posizionale relativa localizzazione di ribosoma su una data molecola di mRNA, e 3 ) questioni relative alla etero cellulare e molecolaregeneità di tessuti normali e tumorali. Questioni relative al numero di cellule necessarie possono essere risolti allineando i picchi spettri di assorbanza corrispondenti a monosomes (80S) di celle di cui importi sono limitando con quelli ottenuti da cellule di alta abbondanza (ad esempio cellule HeLa) 35. Ribosoma tecnica profiling (vedi sotto) può essere utilizzato per determinare la posizione esatta del ribosoma su una data molecola di mRNA, mentre problematiche legate a effetti confondenti di eterogeneità tessuto sull'interpretazione di cambiamenti nell'espressione genica ottenuti con sistemi complessi come tessuti umani sono discussi in dettaglio in una pubblicazione di porri e Storey 36.

Recentemente, un romanzo ribosoma tecnica di profilatura è stata sviluppata, in cui ribosoma protetta frammenti (RPF) sono generati dal trattamento RNAsi I e analizzati mediante sequenziamento profondo 22. Questa tecnica permette di determinare la posizione ribosomiale a un singolo nucleotide risoluzione, fornendo così finora UNPRapprofondimenti ecedented in biologia ribosoma. Ad esempio, profilatura ribosoma può essere utilizzato per la determinazione della densità ribosoma su una data molecola di mRNA o l'identificazione degli elementi che influenza i tassi di inizio della traduzione, quali i siti di inizio alternativi, iniziazione codoni non-ago ed elementi regolatori quali uORFs. Tuttavia, vi sono diverse limitazioni metodologiche che limitano la possibilità di definire un profilo ribosoma stimare con precisione l'efficienza della traduzione dell'mRNA. Questi includono pregiudizi indipendenti introdotte dalla frammentazione casuale e I RNasi digestione, distorsioni introdotte dagli inibitori traduttore (es. allungamento inibitori tipo emetine e cicloeximide possono indurre accumulo ribosomiale a siti di inizio di traduzione), un gran numero di risultati falsi positivi e falsi negativi associati con i punteggi TE così come la loro inesattezza nel predire la legge che provengono da proteine ​​mRNA codificanti 37. Forse ancora più importante, considerando cheprofiling ribosoma consente l'identificazione diretta della posizione del ribosoma su una data molecola di mRNA, il numero di ribosomi che è associato con un dato mRNA è indirettamente stimata normalizzando frequenze di legge in RPF (mRNA ribosoma-associato) rispetto a quelli osservati in mRNA casualmente frammentati (totale mRNA). Per esempio, in un ambiente semplice dove quattro molecole di mRNA "B" (Ba, Bb, Bc e BD) sono occupati da quattro ribosomi nelle posizioni 1, 2, 3 e 4, un difetto intrinseco della tecnica profilatura ribosoma non permetterà una distinzione tra uno scenario in cui tutti e 4 i ribosomi associano solo con un Ba mRNA nelle posizioni 1, 2, 3, e 4 e uno scenario in cui Ba, Bb, Bc e Bd mRNA sono ciascuno occupati da un singolo ribosoma nella posizione 1, 2 , 3, e 4, rispettivamente. Al contrario, durante polisoma frazionamento, polisoma integrità è conservato, consentendo in tal modo l'isolamento del pool di mRNA associati a un numero definito di ribosomi (Figura 1). Questo importdistinzione tra formica polisoma frazionamento e profiling ribosoma suggerisce che mentre il primo metodo può essere utilizzato per confrontare direttamente mRNA in mRNP, leggeri e pesanti polisoma frazioni, quest'ultimo metodo probabilmente riuscirà a cogliere i cambiamenti nel translatome che sono causati da mRNA che la transizione da luce di polisomi pesanti, mentre sopravvalutare il contributo di coloro che spostano dalla frazione mRNP di polisomi pesanti. Il significato biologico di queste differenze tra i metodi di cui sopra è sottolineata da una grande quantità di dati che mostrano che l'attivazione traduzionale di un sottoinsieme di mRNA come quelli che sono eIF4E-sensibili, passaggio dalla luce polisomi pesanti, mentre altri, come quelli ospitare elementi 5'TOP, vengono reclutati per polisomi pesanti direttamente dal pool di libero-ribosoma mRNA 6. È interessante notare che il percorso mTOR ha dimostrato di modulare concomitanza definizione di "eIF4E sensibili" e 5'TOP mRNA 11. Pertanto, le differenze metodologiche che vengono discussi sopra possono spiegare l'apparente discordanza della conclusione tra gli studi che utilizzano ribosoma profilazione 38,39 e polisoma frazionamento 24, per valutare gli effetti di inibizione mTOR sulla translatome.

In conclusione, polisoma frazionamento e profilatura ribosoma sono metodi complementari che forniscono principalmente informazioni riguardanti il ​​numero di ribosomi associati mRNA e la posizione del ribosoma su mRNA, rispettivamente. È importante sottolineare che, nonostante le carenze ei vantaggi di questi metodi, rimane essenziale che i dati a livello di genoma ottenuti per entrambe le procedure sono adeguatamente analizzati e funzionalmente e biochimicamente convalidati.

Disclosures

Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgments

Questa ricerca è stata sostenuta dal Canadian Institutes of Health Research (sovvenzione CIHR MOP-115195) e FRQ-S ad esso, che è anche destinatario di CIHR Young Investigator Award; e il Consiglio svedese della ricerca e la svedese Cancer Society di OL

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEPES Biobasic HB0264
MgCl2 Sigma M8266
KCl VWR CABDH4532
Dithiothreitol (DTT) Biobasic DB0058
Tris Biobasic TB0196
Glycoblue Ambion AM9515 RNA precipitation carrier
Sodium Deoxycholate  Sigma D6750
Triton X-100 Sigma X100
Cycloheximide Sigma C1988
Protease inhibitor cocktail  Roche 04693132001 Tablets (EDTA-free)
RNase inhibitor  Promega N2515
0.45 µm Filter System 150 ml Corning 431155
Sucrose Sigma S0389
RNeasy MinElute Cleanup kit  Qiagen 74204 RNA cleanup kit
Thin wall polyallomer ultracentrifuge tubes  Beckman Coulter 331372
SW41Ti Rotor Package with accessories Beckman Coulter 331336
Optima L100 XP ultra centrifuge Beckman Coulter DS-9340A
ISCO fraction collector  Brandel FC-176-R1
Type II Detector with Chart Recorder Brandel UA-6 UV detector
Tube Piercer w/Flow Cell and Syringe Pump Brandel BR-A86-5
UA-6 Detector Cable Brandel 60-1020-211
FC-176 Communication Cable Brandel FCC-176
Gradient Master Base Unit Biocomp 108-1 Gradient Maker
Gradient Forming Attachments Biocomp 105-914A-1R Gradient Maker attachment
Measurement Computing 8-channel 50 kHz Data Acquisition Device MicroDAQ USB-1208FS Analysis software attachment
Measurement Computing Data Acquisition Software MicroDAQ TracerDAQ Pro Analysis software (Download only)
10x buffer for sucrose gradients:
200 mM HEPES (pH7.6)
1 M KCl
50 mM MgCl2
100 µg/ml cycloheximide
1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free)
100 units/ml RNase inhibitor
Lysis buffer
5 mM Tris-HCl (pH7.5)
2.5 mM MgCl2
1.5 mM KCl 
1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free)]
Then add cycloheximide (CHX), DTT, RNAse inhibitor, Triton and Sodium Deoxycholate as indicated in the main text

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