ゲノム規模で哺乳類Translatomesのソーム分画および分析

Biology
 

Summary

リボソームはタンパク質合成の中心的な役割を果たしている。ショ糖密度勾配遠心分離によりポリリボソーム(ポリソーム)分画は、ゲノムワイドな規模での個々のmRNAの翻訳効率の直接測定を可能にする。さらに、この方法は、シャペロンおよびシグナル伝達分子としてのリボソーム及びポリソーム関連因子の生化学的分析のために使用することができる。

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Gandin, V., Sikström, K., Alain, T., Morita, M., McLaughlan, S., Larsson, O., Topisirovic, I. Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale. J. Vis. Exp. (87), e51455, doi:10.3791/51455 (2014).

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Abstract

mRNAの翻訳は、遺伝子発現の調節において中心的な役割を果たし、哺乳動物細胞中で最もエネルギーを消費するプロセスを表す。従って、mRNA翻訳の調節不全は、癌を含む種々の病理学的状態において主要な役割を果たしていると考えられる。リボソームは、それにより新たに合成されたポリペプチドの機能と安定性の調節、発生期のポリペプチドの折り畳みを促進するシャペロンをホストする。また、新興のデータは、リボソームが、彼らは、リボソームから出てくるように新たに合成されたポリペプチドの翻訳後修飾の様々に関与している分子、および/または翻訳機構の成分を信号のレパートリーのためのプラットフォームとして機能することを示している。ここで、ショ糖密度勾配遠心分離を用いてリボソーム分画の十分に確立された方法が記載されている。社内開発した「anota "アルゴリズムと併せて、この方法は、diffeの直接測定を可能にするゲノムワイド規模での個々のmRNAの翻訳rential。また、この多目的なプロトコルは、新たに合成されたポリペプチドのフォールディング及び分解において中心的な役割を果たすものを含むリボソーム関連タンパク質複合体の機能を分析することを目指し種々の生化学的研究のために使用することができる。

Introduction

遺伝子発現を制御する調節ネットワークは、広範囲に、最後の20年間に研究されてきた。ゲノムワイドスケールでの定常状態のmRNAレベルの変化は、いわゆる「遺伝子発現」プロファイルを決定するために使用されたことにより、転写調節に焦点を当て、これらの研究努力の大半。最近の研究では、定常状態のmRNAレベルが緩く、それにより、mRNA翻訳などの転写後メカニズムは、遺伝子発現3,4の調節において主要な役割を果たすことを示す、プロテオーム1,2の組成に相当することを明らかにした。実際に、〜のタンパク質レベルの50%が不死化マウス線維芽細胞5におけるmRNA翻訳のレベルで決定されると推定されている。

mRNAの翻訳は、mRNAがリボソームの編成作用を介してタンパク質に翻訳される間の高度に調節されたプロセスである転移RNA(tRNAは)と付属要因COmmonly翻訳因子(TFS)6と呼ばれる。タンパク質合成は、哺乳動物細胞7で最もエネルギーを消費するプロセスであり、したがって、全体的なmRNAの翻訳速度は、栄養利用および細胞増殖速度8を収容するように調整される。全体的なmRNAの翻訳速度の変化に加えて、種々の細胞外刺激( 例えばホルモン及び成長因子)、細胞内の手がかり( 例えば、アミノ酸レベル)およびストレス( 例えば、ERストレス)の異なるタイプがあるmRNAのプールにおける選択的な変化を誘導(translatome)6を翻訳さ。刺激、いくつかの翻訳活性ではなく、のタイプに応じて、全てのmRNAが劇的に、それによって迅速な細胞応答6を取り付けるために必要とされるプロテオームの変更を伴う、影響を受けます。 translatomeにおけるこれらの定性的および定量的変化は、トランス作用因子間の相互作用( 例えばにより媒介されると考えられている6,9の選択されたサブセットに存在するシスエレメント(RNAエレメントまたは機能)の成分。例えば、レベルおよび/ ​​または律速翻訳開始の活性の変化は、eIF4Eのとは、eIF2が選択特定の5'UTRの特徴6に基づいて転写産物の翻訳を調節要因。のeIF4Eとは、eIF2は、それぞれ6、リボソームへのmRNAおよび開始tRNAの募集のために必要とされる。 eIF4Eの活性の増加は、選択的サイクリンのc-mycおよびBcl-xLの10を含むタンパク質をコードするもの刺激増殖および生存を含む長いと高度に構造の5'UTRを保有するmRNAの翻訳をボルスタ。今度は、eIF2はの不活性化は、選択的にこのようなコードするものマスターTとしてのの5'UTRが短い阻害上流オープンリーディングフレーム(uORFs)を含むmRNAの翻訳を調節しながら、全体的なタンパク質合成のシャットダウンにつながる小胞体ストレス応答( 例えば ATF4)のranscriptionalレギュレータです。 MAPK経路は直接リン酸化し、一方、栄養素、成長因子およびホルモンを含む様々な刺激に応答して、ラパマイシン(mTORの)経路の哺乳類/機構的標的は、翻訳抑制の4E-結合タンパク質(4E-BP)ファミリーを不活性化することによって、eIF4Eの活性を刺激する6,11 EIF4E。今度は、eIF2αリンキナーゼ( すなわち PERK、PKR、HRIとGCN2)は栄養枯渇、ERストレスやウイルス感染6,12に応答して、そのeIF2αリン調節サブユニットをリン酸化することによっては、eIF2を阻害する。 TFの活性および/ ​​または発現の変化は、翻訳機構およびmiRNAを含む調節因子の他の構成要素は、がん、メタボリック症候群、神経学的及び精神障害、腎および心血管疾患13〜19を含む様々な病理学的な状態で観察されている。まとめると、これらのデータは、その並進私を示すchanismsは、細胞の恒常性を維持する上で、それらの抑止は、様々なヒト疾患の病因において中心的な役割を果たしている中心的な役割を果たしている。

ここで、モノソーム、リボソームサブユニットメッセンジャーリボ核タンパク質粒子(mRNPs)からポリソームを分離するために使用される哺乳動物細胞におけるショ糖密度勾配遠心分離によってポリソームの分画のためのプロトコルが記載されている。これが不十分(光ポリソームに関連する)、翻訳mRNAから効率的に翻訳(重いポリソームに関連付けられている)との識別を可能にします。このアッセイでは、リボソームは、シクロヘキシミド20およびサイトゾル抽出物を遠心分離によって5-50%線状スクロース密度勾配上で分離されているような翻訳伸長阻害剤を用いたmRNA上に固定化される。ショ糖勾配のその後の分別は、それらが結合しリボソームの数に応じて、mRNAの単離を可能にする。各画分から抽出されたRNAは、その後決定することができる異なる条件間の勾配を横断するmRNAの分布の変化、それによって勾配の上から下への翻訳効率が向上する。ノーザンブロッティングまたは定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)を、各画分中のmRNAのレベルを決定するために使用される。

代替的に、重いポリソーム(典型的に3つ以上のリボソーム)を含有する画分をプールし、ゲノムワイド関連ポリソームmRNAレベルは、マイクロアレイまたはディープシーケンシングを使用して決定される。これは、ポリソーム関連するmRNAのレベルは、翻訳に加えて、サイトゾルのmRNAレベル影響与える21の転写および転写後メカニズムによって影響されることを強調するために最も重要である。したがって、ポリソーム関連mRNAからゲノムワイドなデータを用いて、翻訳の違いを決定するための換算はその上流にある遺伝子発現経路における工程からの影響を補正する必要があるTiONから21。このような補正を可能にするために、細胞質ゾルRNAは、各試料からのポリソーム関連RNAと並列に調製し、ゲノムワイドな定常状態のmRNAレベルを21に決定される。現在、いわゆる「翻訳効率」(TE)がゴール(ポリソーム関連mRNAのデータおよび細胞質のmRNAデータと、すなわち対数比)は、多くの場合の翻訳効率にサイトゾルmRNAレベルの変化の影響を補正するために使用されるmRNAを22与えられた。しかし、差動変換を識別するために、TEスコアを使用することは一般的に偽の相関27と呼ばれる、TEスコアの数学的な性質に起因する偽陽性や偽陰性所見のかなりの数に関連している。実際、複数のラボからのデータセットの調査は、このようなスプリアス相関がtranslatomes 23の変化を分析するときに避けられないように見えることを示した。これは、差動のtrの「分析の開発を促し前述の欠点23の影響を受けないanslation」(anota)アルゴリズム、。 anota、分析中の回帰モデルは、細胞質ゾルRNAレベルの独立した翻訳活性の測定値を導出するために使用される。このような措置は、その後の条件と統計が計算されている間で比較する。ユーザーは、統計的検出力を向上させ、いくつかの複製24を用いた研究では偽陽性所見の発生を減少させ、分散収縮法を適用するオプションを持っています。重要なことに、最近anotaによって捕捉translatomeにおける摂動はなく、TEスコアは、25プロテオームの変化と相関することが実証された。したがって、それは非常にゲノムワイド規模での翻訳の変化を同定するためのanota分析を適用することを推奨します。 anotaアルゴリズムの理論的基盤が以前21,23,26詳細に議論されたが、ここでの焦点は、実際にそれを適用する方法である。

細胞中のmRNA翻訳活性の変化を研究することに加えてve_content ">、このリボソーム分画プロトコルが分離し、生化学的および機能的リボソーム及びポリソーム結合蛋白質複合体を特徴付けるために使用することができる。このアプローチは、正常に識別するために、過去に展開されている新たに合成されたポリペプチド27および/ ​​または翻訳機構の構成成分のリン酸化に関与しているの安定性を調節複合体は、ポリソーム分画法のこの適用はまた、簡単に説明する。

Protocol

1。ショ糖勾配の準備

  1. 60%を100mlのddH 2 O中(w / v)のスクロース溶液を調製溶液を分画工程(工程3.5)の間にチューブの目詰まりを防止するために、0.22μmのフィルターを通して濾過されるべきである。
  2. 200のHEPES(pH7.6)中、1MのKCl、50のMgCl 2、100μg/ mlのシクロヘキシミド、1Xプロテアーゼ阻害剤カクテル(EDTAフリー)、100単位/ mlのRNase阻害剤:5ミリリットル10倍のショ糖勾配バッファを準備します。
  3. 工程1.1に記載のように調製した60%溶液を用いて、40 mlの5%および1×ショ糖勾配緩衝液中の50%ショ糖溶液を作る。
  4. (計6超遠心管を)重ね着にそれぞれポリアロマー超遠心管の上半分のフルポイントをマークするために、勾配メーカーを備えたマーカーブロックを使用してください。それはハーフフルポイントに到達するまでの勾配メーカーを備えた積層装置を用いて、5%のスクロース溶液を添加する。次いで、INTERFまで底から50%スクロース溶液を添加2解の間のACEはハーフフルポイントに到達した。勾配が可能な限り類似であるように、これは、高い再現性を得るために必須であるような特別な注意が(下記参照)、このステップの間に取られるべきである。
  5. 勾配メーカーが提供率帯状キャップでチューブを密封し、勾配メーカーにチューブホルダーに密封されたチューブを移す。
  6. リニア5%〜50%の勾配を得るために、勾配メーカーを実行します。 6線形勾配は、高傾斜角で回転することにより、数分で形成される。
    注:スクロース勾配は6ヶ月間、直ちに使用するか、または-80℃で保存することができる。

2。単離とポリソームの沈降

  1. 細胞型、種子細胞1-5 15cmのペトリ皿(〜15×10 6細胞)へによっては少なくとも一日前に溶解。実験の日に、細胞は約80%コンフルエントにする必要があります。 注:翻訳と増殖率が直接であるため、最適な細胞集密度は非常に重要です8比例するのでポリソームが活発に増殖している細胞に分析すべきである細胞の低集密度は、さらなる分析のために十分な材料を提供しないかもしれないのに対して、 すなわち換算レートが大幅にコンフルエント細胞の上に減少します)。例えば実験者が翻訳上の接触阻害の効果を研究に興味を持っている場合は、この規則の例外は作ることができる。これはtranslatomeに不注意影響を与えることがあるしかし、細胞は、あまりにも長い間にわたる融合性条件下に維持すべきではありません。
    トランスフェクションが必要な場合は、市販のキットのほとんどはポリソームのレベルに影響を与えない。トランスフェクション細胞の日に80〜90%コンフルエントでなければならないので、それが約80%コンフルエントの細胞を24時間後にトランスフェクションを伝播し、細胞からポリソームの48時間後、トランスフェクションを隔離することをお勧めします。
  2. 37℃および5で5分間、増殖培地中の100μg/ mlの最終濃度でシクロヘキシミドで細胞をインキュベートする%のCO 2;および100μg/ mlのシクロヘキシミドを含む氷冷した1×10mlのPBSで細胞を2回洗浄します。シクロヘキシミド、それによって20をオフに実行リボソームを防ぐ、mRNA上のリボソームを「フリーズ」と翻訳伸長阻害剤である。
  3. 100μg/ mlのシクロヘキシミドを含む氷冷した1×PBS 5mlに、静かに細胞をこすり落とし、50ミリリットルチューブにそれらを収集。なお、この工程は大幅にポリソーム調製物の品質を低下させる長期間氷上で細胞を残すような適度に速く実行されることが重要である。
  4. 4℃で5分間、200×gの遠心分離によって細胞を収集する
  5. / [MM KClおよび1Xプロテアーゼ阻害剤カクテル(EDTAフリー)1.5、(5 mMトリス-塩酸(pH7.5)、2.5のMgCl 2]低張性緩衝液の425μlの上清を再懸濁細胞を廃棄し、10mgを5μlを加えるミリリットルCHX、10パーセントTritoの25μlを加え、続いて5秒間、1 M DTT、RNase阻害剤と渦の100単位の1μLN X-100(最終濃度0.5%)と10%デオキシコール酸ナトリウムを25μl(最終濃度0.5%)と5秒間ボルテックス。中性洗剤条件は核膜を破壊することなく細胞質ゾルおよび小胞体関連リボソームを可溶化するために使用されているのに対し、セルの膨張を、低張緩衝液は、原形質膜を破壊するであろう。
  6. 4℃で7分間の16,000×gで遠心分離溶解物および新しい予備冷却1.5ミリリットルチューブに上清(〜500μl)を移す。分光光度計を用いて、各試料について260nmでのODを測定し、細胞質ゾルの定常状態のmRNAレベルを決定するために使用される入力として、溶解物の10%を維持する。 RNA分解酵素フリーのH 2 O中750μlに入力を希釈、液体窒素中で750のTrizolμLとフラッシュ凍結を追加します。
  7. あらかじめ冷却ローターバケット中のスクロース勾配を含む超遠心管に移します。ショ糖勾配の上から500μLを削除します。彼らは、同じ外径(10月2日を含むよう溶解液を調整溶解バッファー500μlの260 nmで0 OD)(ステップ2.5で説明)、各ショ糖勾配上にロードします。
    注意:これは批判的ソーム製剤の品質を向上させるように、すぐに、勾配に溶解物をロードすることが重要です。
  8. 秤量し、超遠心前に、各勾配のバランスをとる。
  9. SW41Tiローターを使用して、4℃で2時間222228×gで(36,000 rpm)で遠心する。
    注:スクロース勾配を崩壊させないために、「低」、ブレーキオプションが選択されるべきである。

3。ポリソーム分画およびRNA抽出

  1. のRNase ZAP(数スプレー)を含む暖かいアーゼフリーの水で洗浄することにより、フラクションコレクターを準備します。唯一の暖かいRNA分解酵素を含まない水で、この手順を繰り返します。 UVランプを切り替え、緑色のライトが表示されるのを待ちます。
  2. 慎重にローターからチューブを取り外し、氷の上に置きます。コンピュータ、ポンプ、UV検出器、およびフラクションコレクターのスイッチをオンにします。 3ミリリットル/分とFILに設定ポンプlでは、針に達するまで追跡用溶液[60%(w / v)の0.02%を含有するスクロース(w / v)のブロモフェノールブルー]を有するチューブ。針から出てくる少なくとも1滴を見たり、気泡がポンプ、シリンジやチューブ内に導入されないことを確認してください。
  3. フラクションコレクターに2ミリリットルのチューブを配置します。解析プログラムを起動して、+ /に感度を設定 - 10 MEV。 100秒に「タイム」を設定します。
  4. 管が直交位置にあることを確認しながら、UV検出器に各超遠心チューブを置きます。チューブホルダー下のつまみをひねって針でチューブに穴を開け。
  5. 1.5ミリリットル/分でポンプを設定し、(これは各画分〜750μLになります)、フラクションコレクターに30秒までの時間を設定する画分を収集します。 「離れた位置」にポンプを入れ、ポンプおよびフラクションコレクタを起動すると同時にDAQトレーサーを使用して録音を開始する。これは、スクロースGRAの上方への変位を開始しますdientおよび254nmでのUV吸光度を同時に検出する。とすぐに解決策を追いかけての最初のドロップは、捕集管2ミリリットルに落ちるように収集を停止。
  6. 。csv形式でトレースを保存し、(一回3.7が終了した段階)、スプレッドシートアプリケーションでは、UV吸収プロファイルで各分画の位置を識別するために、次の手順を実行します。
    1. 254 nmの吸光度に対応する値を含む列を選択します(チャネル0)。
    2. 吸光度の滑らかなラインの散布図を作成します。
    3. 300 X軸の目盛間隔を設定し(各画分(30秒)の収集時間、5%〜50%スクロース勾配(〜12ml)中の容積で除した値。
  7. 各画分中のTrizol 750μLを加え、フラッシュ液体窒素中での分画を凍結する。
  8. 製造業者の説明書に従ってトリゾールプロトコルを使用してポリソーム関連及び細胞質ゾル(2.6)からRNAを単離する。 RNAの収量を増加させるために、RNA PRECIを続行30分または-20℃で一晩-80℃でpitation。
    注:ポリソーム画分から沈殿したRNAの量がはっきりと表示されない場合がありますので、それがキャリアを追加することをお勧めします。トリゾールプロトコル中のRNA沈殿工程の前にチューブにキャリアの1を添加する。
  9. (アプローチは3.6を用いて説明した)> 3リボソームに関連するmRNAに対応する画分を決定し、これらの画分をプールする。 (2.6から)をプールソーム関連および細胞質RNAのクリーンアップを実行するために、RNAのクリーンアップキットを使用してください。マイクロアレイまたはディープシークエンシングを使用してゲノムワイドなmRNAレベルを決定するために、施設にサンプルを提出する。
    特定のmRNAの翻訳は、RT-qPCRにより監視される必要がある場合には、cDNAを合成し(> 3リボソームまたは全RNAを含むプールされた画分から)RNA 500ngのを使用することをお勧めします。
    注:> 3リボソームに関連するmRNAを効率的に翻訳されたmRNAを表現し、新たにシンセサイザーの80%以上を含むように任意に設定されているサイズのポリペプチド28,29。光(1-2)に対応する画分を含む、媒体(2-3)及び重ポリソーム(> 3)が有利であろうが、これらは2倍のサンプル数を増加させる(条件当たり2対4)、従って実験の費用。それは将来、ディープシーケンシング、マイクロアレイ解析のコストの減少は、後者のアプローチを支持しなければならないことが予想されていることにもかかわらず、それは、検証中に、個々のmRNAの分布は各分画で監視されていることをお勧めします。

mRNAの翻訳4。ゲノムワイド解析

  1. :R、BioConductorのとanotaパッケージをインストール
    1. R(R-project.orgからダウンロード)をインストールして、R-セッションを開始します。
      注:Rは、すべてのオペレーティングシステムで利用可能で、anotaはそれらのすべてで実行されます。
    2. BioConductorの(bioconductor.org)をインストールします。 DOによって起動される- Rコードは、WindowsでのR端子( 例えば 、Rコンソールから解釈されますUBLE)Rのショートカットをクリックする。バイオコンダクターは、(R端子に)入力することでインストールされます。

      ソース(「http://bioconductor.org/biocLite.R」)

      biocLite()
    3. (R端子に)入力してanotaのBioConductorのパッケージ(とanotaが必要とするのqvalueパッケージ)をインストールします。

      ソース(「http://bioconductor.org/biocLite.R」)

      biocLite(C(「anota "、" qvalueを "))
    4. パッケージが正常にインストールされ、(R端子に)入力してanotaマニュアルを開いていたことをテスト:

      ライブラリ(「anota」)

      ビネット(「anota」)
    5. 注意:anotaパッケージで使用されるすべての機能のための追加のヘルプがanotaのWebページ(http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/anota.html)または使用するか見つけることができるたとえばR.内のヘルプ機能は、anotaPerformQc機能に関するヘルプを表示するには、R-TEに行くrminalと種類(anotaパッケージがロードされている場合にのみ動作することに注意してください)​​:

      ライブラリ(「anota ")#はanotaパッケージをロードする

      ?anotaPerformQc#この関数のヘルプを開きます
  2. Rへのデータのインポート:
    1. 分析のための発現データを準備します。データは、mRNAレベルを測定するために使用した手法に対して( 例えば、正規化および品質制御)前処理されるべきである。 LOG2は入力値がログに記録、変換する必要がある最も一般的です。すべてのポリソーム関連RNAサンプルと、すべての細胞質ゾルのRNAサンプルのための1のためのデータで1テーブルをコンパイルします。最初の列は、サンプルあたり1データ列に続く遺伝子の識別子が含まれている必要があり;最初の行はサンプルのための名前が含まれている必要があります。これは、表が同一のサンプル順序と同一の遺伝子順序を持っていることが重要です。 「myPolysom​​eData.txt」と「myCytosolicData.txt」と呼ばれるタブ区切りのテキストフ​​ァイルとしてファイルを保存します。
    2. この例では2つのサンプルクラス(コントロールまたは疾患)に使用される3により、この順に6つのサンプルを生成し、クラスごとに複製:myCytosolicData.txtとmyPolysom​​eData.txtファイルの両方でC1、C2、C3、D1、D2、D3。 2つのサンプルのクラスが存在する場合にAnota条件ごとに少なくとも3回の反復を必要とします。これらは独立した生物学的複製である必要があります。
    3. データ入力ファイル(myPolysom​​eData.txtとmyCytosolicData.txt)を含むディレクトリを作成します。このディレクトリからのオープンR。 Windowsの/ Mac用には、これは(も、ドロップダウンメニューを使って変更することができます直接作業)このディレクトリに、R-ショートカットをコピーし、このショートカットを使用してRを起動して行うことができます。
    4. 新しく作成したディレクトリ内myCode.Rというファイルを作成し、テキスト編集ソフトウェアを使用して開きます。このファイルにコードを記述します。
    5. Rにデータをロードするには(コードの各添加後に再度保存このファイルに覚えている)myCode.Rファイルに次のコードを記述します。以下のステップ·バイ·sであり、TEPコードの説明が、すべてのコードも最初に書くこともできますし、ソース関数(つまり、コードを実行し、以下を参照)、一度だけ使用される。

      ##これはanotaライブラリをロードする

      ライブラリ(anota)

      ##これはRに入力されたデータをロードする

      dataCyto < - as.matrix(read.tableを(「myCytosolicData.txt」、ヘッダ= TRUE、row.names = 1、9月= " tを"))

      dataPoly < - as.matrix(read.tableを(「myPolysom​​eData.txt」、ヘッダ= TRUE、row.names = 1、9月= " tを"))
    6. R端子に直接入力することでRのコードを実行します。

      ソース(「myCode.R」)
    7. データは(R端子に)入力することで正常にロードされたことを確認します。
      ヘッド(dataCyto)第dataCytoテーブルの上に表示されます
      ヘッド(dataPoly)
  3. 差別的翻訳遺伝子の同定:
    1. 説明してベクトルを生成サンプルカテゴリー(ベクトルは、R内のオブジェクトの型である)。すべての3つのオブジェクトは、サンプルの同一の順序を持​​っているように、このベクターはmyPolysom​​eData.txtとmyCytosolicData.txtでのサンプル順序を反映する必要があります。サンプルは比較するかについてanotaを指示する際、ベクターが使用されます。 myCode.Rファイルに以下を追加します。

      ##複製サンプルが同一のサンプルクラスを持っていることに注意してください

      このベクトルの##記述( すなわち、「C」または「D」)。

      myPhenotypes < - てc( "C"、 "C"、 "C"、 "D"、 "D"、 "D")
    2. データセットの品質管理を行う。 anotaが分析に使用する前に評価する必要がある品質測定の数があります。これらは、anotaマニュアルに詳細に議論される。 myCode.Rファイルに次のコードを追加して保存します。

      anotaQcOut < - anotaPerformQc(DATAT = dataCyto、DATAP = dataPoly、phenoVec = myPhenotypes)

      anotaResidOut < - anotaResidOutlierTest(anotaQcObj = anotaQcOut)
    3. R端子に入力することで、コードを実行します。

      ソース(「myCode.R」)

      これはanotaマニュアルの指示通りに調べることができ、出力ファイルの数を生成します。
    4. 差別的翻訳遺伝子を同定。サンプルは、彼らが(「コントラスト」パラメータを使用して)、ユーザが指定されていない限り(「myPhenotypes「ベクターIE)」phenoVec」パラメータに指定する名前のアルファベット順に基づいて比較されます。上記のようにR端子内部の "ソース"コマンドを使用して、ファイルや仕上げをmyCode.Rに次のコードを追加します

      anotaSigOut < - anotaGetSigGenes(DATAT = dataCyto、DATAP = dataPoly、phenoVec = myPhenotypes、anotaQcObj = anotaQcOut)
    5. anotaGetSigGenesを理解するためのヘルプを使用してどのようにOutputなどはフォーマットされ、(R端子に)入力して比較するために、サンプルカテゴリを選択する方法を参照してくださいされています。

      ?anotaGetSigGenes
    6. 差動で換算されているフィルタとプロットの遺伝子。 anotaPlotSigGenes関数内で適用することができ、助けを使用すると、このようなしきい値のカスタムの組み合わせを簡素化する複数のしきい値があります。確実に分析された遺伝子を選択するために、最小傾斜(-0.5)、最大傾斜(1.5)とslopeP(0.01)設定を適用します。
      注:また、RVM 23,26,30偽発見率(FDR)(0.15)に適用設定とは、(LOG2する[1.5])は、例えば示差的翻訳された遺伝子を同定するために使用することができる倍率変化。このような「selDeltaPT」など、他のフィルタは、( 例えば、[1.5]をLOG2するselDeltaPTの設定)より厳格なフィルタリングのために役立ちます。これは、(selCont引数を使用して)、濾過すべき比較を指定することも必要である。 myCode.Rに次の行を追加することで説明する設定を適用しますファイル:

      anotaSigFiltered < - anotaPlotSigGenes(anotaSigObj = anotaSigOut、selContr = 1、最小傾斜=(-0.5)、最大傾斜= 1.5、slopeP = 0.01、maxRvmPAdj = 0.15、minEff = LOG2(1.5)、selDeltaPT = LOG2(1.5))
    7. 上記のようにR-端末からソース関数を用いて解析を行う。これはまた、グラフィカルな出力を生成します。この出力を調べると、分析の性能を評価し、設定に必要な変更を特定するための良い出発点である。
    8. 出力テーブルを生成します。 myCode.Rファイルに次のコードを追加します。

      はwrite.table(anotaSigFiltered $ selectedRvmData、ファイル= "MySignificantGenes.txt"、9月= " tを")
    9. R端子にソース関数を使用してコードを実行します。結果のテーブル内の列がanotaPlotSigGenes機能のヘルプで説明されています。

Representative Results

mTORは、栄養素利用19で全体的なタンパク質合成速度を調整し、セルラーネットワークの主要ノードです。 mRNA翻訳が律速開始段階6で、主に規制されている。ポリソームに従事してリボソームの割合は、積極的に翻訳開始速度28と相関する。 mRNAの翻訳に対するインスリンの効果を仲介するmTORシグナル伝達の役割を調査するためにポリソーム画法を適用した例が提示される。この目的のために、MCF7ヒト乳癌細胞は、低血清中で維持し、次いでインスリン単独で、または活性部位mTOR阻害Torin1との組み合わせで刺激した。連続的に低い血清中で維持した非刺激細胞は、対照とした。 mRNPs、モノソーム(80S)およびポリソーム画分をポリソーム分画法を用いて分離した。対照細胞と比較して、インスリンは、対応する勾配画分における吸光度の増加を誘導しポリソームに、一染色体分中の吸光度の減少が同時に起こる( 図1)を伴う。これらの知見は、ポリソームに従事リボソームの割合は、したがって予想通り、インスリンは、グローバル翻訳開始速度を刺激する、ことを示す、対照細胞と比較して、処理されたインスリンが増加することを示している。 Torin1ことによりmTORシグナル伝達は、翻訳機構19に対するインスリンの効果を媒介に主要な役割を果たすという知見を裏付け、吸光度プロファイルに対するインスリンの効果( 図1)を逆転させた。

勾配製剤の矛盾を避けることができない教義に基づいて、質問はポリソーム画法22を用いて得られたデータの再現性に関して提起されている。経験的に、この潜在的に有害な問題で、細胞質ゾルと重いポリソーム関連RNA(4以上のリボソームに関連するmRNA)をテストするために単離された 4つの独立した生物学的複製からTorin1( 図2)との組み合わせで、単独でインスリンまたはインスリンで処理したMCF7細胞から。細胞質ゾルおよび各反復における重いポリソーム関連mRNAの組成に、インスリンおよびTorin1の効果は、マイクロアレイ法を用いて、ゲノムワイドなスケールで決定した。主成分分析(PCA)を適用したポリソーム分画法の再現性を決定すること。このような分析は、異なる条件がよく( 図2)を分離しながら、それぞれの条件に属するサンプルが密に二つの第一の構成要素内に配置されたことを示した。これらの知見は、ここで説明したようにポリソーム分画法は、再現性の高いゲノムワイドなレベルでの翻訳の量的および質的な変化を研究することが適切であることを示している。

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図1 MCF7細胞におけるグローバル並進上でシグナリングを血清飢餓、インスリンおよびmTOR阻害の効果を示すポリソームプロファイル。MCF7細胞を、16時間の栄養素(0.1%FBS中で維持)を奪われ5nMのインスリン(INS)で処理し、単独で、または4時間250 nMのTorin1(INS + Torin1)と組み合わせた。連続的に栄養分を奪われた未処理の細胞(0.1%FBS)を対照として使用した。対応する細胞質ゾル抽出物を5〜50%ショ糖勾配上での遠心分離によって沈降させた。無料リボソームサブユニット(40Sおよび60S)、モノソーム(80S)と、ポリソーム画分中のリボソームの数が示されている。

図2
図2。Pを使用して得られたゲノムワイドなデータolysomeプロファイリング高度に再現可能である。MCF7細胞を、 図1のように処理した。細胞質およびポリソーム関連RNA(> 3リボソーム)は4つの独立した生物学的複製から抽出し、それらのゲノムワイドなmRNAレベルはGeneTitanアレイ(Affymetrix)を用いて決定した。 PCAは、得られるデータの再現性を評価した。 、RNAの原点(C =細胞質ゾル、P =ポリソーム関連)すべての処置のための最初の2のPCAコンポーネント(;; CTRL =コントロールイン=インスリンT1 =トリン1)も示されていると複製されます。同じ条件とRNA起源からの試料は、密接に高い再現性を示して配置されている。

Discussion

この記事では、哺乳動物細胞におけるゲノムワイド規模で翻訳活性の質的および量的な変化を捉えるために社内開発の分析方法に続いて十分に確立されたポリソーム分画プロトコルについて説明します。このプロトコルは特別な注意が正常に完了したが、1)細胞集密度に支払われるべきであるため増殖率と栄養利用は、mRNAの翻訳活性と相関し、translatomeの構成に影響を与えることができるように(、細胞集密度)を複製した実験条件間で一貫している必要があり、 2)急速な細胞溶解(シクロヘキシミドおよびバッファ内のRNA分解酵素阻害剤の存在にもかかわらず、溶解が迅速かつ細胞抽出物がすぐにRNA分解やポリソームの解離を防止するための溶解後に、ショ糖勾配上にオーバーレイされるべきであるべきである)、3)グラデーション準備(確保するための高いデータ再現性、スクロース勾配は、勾配メーカー、SPEを用いて調製されるべきである)、それらを処理する際に金融注意が必要です。

翻訳活性の変化を研究することに加えて、このプロトコルは、リボソーム関連タンパク質複合体を単離し、それらの生理学的機能を確立するために使用することができる。リボソーム関連タンパク質複合体は勾配分画から免疫沈降し、ウエスタンブロッティングまたは質量分析法によって分析することができるのに対し、この目的のために、種々のリボソーム関連タンパク質のレベルおよびリン酸化状態は、ウェスタンブロッティング、続いてTCA沈殿により決定することができる。この手法の欠点は、遅い勾配分画法が結合動態の急速な結合/解離にあっても強固に結合したタンパク質の解離を引き起こす可能性があることです。新たに合成されたポリペプチドに関連した要因は、典型的な例である。リボソームを構成する新興新たに合成されたポリペプチドは、3のような化学的架橋剤を使用してリボソームに関連するタンパク質複合体上に固定化することができる、3'-ジチオビス[スルホスクシンイミジル](DTSSP)31。このアプローチは、受容体活性化Cキナーゼ1(RACK1)/ c-Jun N末端 ​​キナーゼ(JNK)/真核生物翻訳伸長因子1A2(EEF1A2)錯体がストレス27に応答して新たに合成されたポリペプチドの分解を調節すること。明らかにまた、同様の方法論は、タンパク質キナーゼC BII(PKCbII)はRACK1 32によりリボソームへ補充されるおよびmTOR複合体2(mTORC2の)の活性化は、それが新たに合成されたAKTポリペプチドをリン酸化し、それらを調節するリボソーム上で起こることを示す研究に使用した安定性33,34。

anota分析を行っソーム分画法の主な制限は以下のとおりです。細胞の比較的多数(〜15×10 6細胞)のための1)の要件、2)指定されたmRNA分子上のリボソームの局在に関する位置情報の欠如、および3細胞および分子ヘテロに関連する)の​​問題正常組織および腫瘍組織のgeneity。必要な細胞数に関連する問題は、量、高存在量の細胞( 例えば HeLa細胞)35から得られたものと限定された細胞のモノソーム(80S)に対応する吸光度スペクトルピークを整列させることによって解決することができる。例えば、ヒト組織のような複雑なシステムから得られた遺伝子発現の変化の解釈上の組織の不均一性の交絡効果に関連する問題が議論されているのに対し、リボソームプロファイリング技術(下記参照)は、所与のmRNA分子上のリボソームの正確な位置を決定するために使用することができるネギやストーリー36による刊行物に詳細が。

最近では、技術をプロファイリング小説リボソームはリボソーム保護された断片(RPFS)はRNA分解酵素I処理によって生成され、ディープシーケンシング22によって解析され、開発されました。この技術は、それによって、これまで提供した一塩基分解能でリボソーム位置の決定を可能にするUNPRリボソーム生物学へのecedented洞察。例えば、リボソームプロファイリングは、指定されたmRNA分子、またはそのような代替開始部位、非8月コドンなどuORFsなどの調節エレメントの開始などの影響翻訳開始率、その要素の識別にリボソーム密度の測定のために使用することができます。しかし、正確にmRNAの翻訳効率を推定するリボソームプロファイリングの能力を制限するいくつかの方法論的な制限があります。これらはランダムな断片化とリボヌクレアーゼI消化により導入された独立したバイアスを含み、翻訳阻害剤(例えば、エメチンやシクロヘキシミドなどなど 、伸び阻害剤は翻訳開始部位でのリボソーム蓄積を誘導する可能性がある)により導入されたバイアスは、偽陽性や偽陰性の結果の多くは、関連するTEスコアだけでなく、予測する上で、その不正確さとそれがタンパク質をコードするmRNA 37から発信読み込みます。おそらく最も重要なのに対し、リボソームプロファイリングが与えられたmRNA分子上のリボソームの位置を直接同定を可能にする、指定されたmRNAと関連しているリボソームの数は、間接的に、合計(ランダムに断片化されたmRNAに観察されたものの上にRPFS(リボソーム関連するmRNA)を読み込みの頻度を正規化することによって推定されているmRNA)の。例えば、4つの「B」mRNA分子(BaとBbは、BCおよびBdの)は、位置1、2、3、4、リボソームプロファイリング技術の固有の欠点で4リボソームによって占有されている単純な設定では許可しないシナリオここで、すべてのリボソーム関連付けるだけBaの位置1におけるmRNA、2、3、4およびBa、Bbは、BCおよびBdのmRNAは、各位置での1つのリボソームによって占有されるシナリオで、2の区別それぞれ図3、図4、。これとは対照的に、ポリソーム分画の間に、ポリソーム完全性は、それによってリボソームの定義された数( 図1)に関連するmRNAのプールの単離を可能に、保持されます。このインポートソーム分画およびリボソームプロファイリング間の蟻の区別は、前者の方法は、直接のmRNPの軽重ポリソーム画分中のmRNAを比較するために使用することができるが、後者の方法は、おそらく移行からのmRNAによって引き起こされるtranslatomeの変更をキャプチャするために失敗することを示唆している重いポリソームへのmRNP分からシフトしているものの寄与を過大評価している間、重いポリソームに点灯します。前述の方法との間に、これらの矛盾の生物学的意義は、保有するものと他のもの、一方で、このようなのeIF4Eと小文字が区別されているようなmRNAのサブセットの翻訳活性化を示すデータの大きな体、光から重いポリソームへの移行によって強調される5'TOP要素は、直接リボソームのないmRNAの6のプールから重いポリソームに補充される。興味深いことに、mTOR経路は、同時に「eIF4Eの敏感な」及び5'TOP mRNAの1の翻訳を調節することが示されている1であるため、上述された方法論の違いはtranslatome上のmTOR阻害の効果を評価するためにプロファイリング38,39リボソーム及びポリソーム分画24を用いた研究の結論の間の見かけの不一致を説明することができる。

結論として、ポリソーム分画およびリボソームプロファイリングは、主にそれぞれのmRNA上のmRNAとリボソームの位置に関連したリボソームの数に関する情報を提供する補完的なメソッドです。重要なことに、これらの方法の欠点と利点にもかかわらず、それは両方の手順によって得られたゲノムワイドなデータを適切に分析し、機能的にも生化学的に検証されることが不可欠で残っている。

Disclosures

著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。

Acknowledgments

この研究はまた、CIHR若手研究者賞を受賞され、それに健康の研究助成金のカナダの協会(CIHRからMOP-115195)とFRQ-Sによってサポートされていました。とスウェーデンの研究評議会とスウェーデンの癌協会はOLする

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEPES Biobasic HB0264
MgCl2 Sigma M8266
KCl VWR CABDH4532
Dithiothreitol (DTT) Biobasic DB0058
Tris Biobasic TB0196
Glycoblue Ambion AM9515 RNA precipitation carrier
Sodium Deoxycholate  Sigma D6750
Triton X-100 Sigma X100
Cycloheximide Sigma C1988
Protease inhibitor cocktail  Roche 04693132001 Tablets (EDTA-free)
RNase inhibitor  Promega N2515
0.45 µm Filter System 150 ml Corning 431155
Sucrose Sigma S0389
RNeasy MinElute Cleanup kit  Qiagen 74204 RNA cleanup kit
Thin wall polyallomer ultracentrifuge tubes  Beckman Coulter 331372
SW41Ti Rotor Package with accessories Beckman Coulter 331336
Optima L100 XP ultra centrifuge Beckman Coulter DS-9340A
ISCO fraction collector  Brandel FC-176-R1
Type II Detector with Chart Recorder Brandel UA-6 UV detector
Tube Piercer w/Flow Cell and Syringe Pump Brandel BR-A86-5
UA-6 Detector Cable Brandel 60-1020-211
FC-176 Communication Cable Brandel FCC-176
Gradient Master Base Unit Biocomp 108-1 Gradient Maker
Gradient Forming Attachments Biocomp 105-914A-1R Gradient Maker attachment
Measurement Computing 8-channel 50 kHz Data Acquisition Device MicroDAQ USB-1208FS Analysis software attachment
Measurement Computing Data Acquisition Software MicroDAQ TracerDAQ Pro Analysis software (Download only)
10x buffer for sucrose gradients:
200 mM HEPES (pH7.6)
1 M KCl
50 mM MgCl2
100 µg/ml cycloheximide
1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free)
100 units/ml RNase inhibitor
Lysis buffer
5 mM Tris-HCl (pH7.5)
2.5 mM MgCl2
1.5 mM KCl 
1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free)]
Then add cycloheximide (CHX), DTT, RNAse inhibitor, Triton and Sodium Deoxycholate as indicated in the main text

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