ScanLag: उच्च throughput कालोनी विकास की मात्रा और समय अंतराल

Immunology and Infection
 

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Levin-Reisman, I., Fridman, O., Balaban, N. Q. ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time. J. Vis. Exp. (89), e51456, doi:10.3791/51456 (2014).

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Abstract

Introduction

बैक्टीरिया कई तनावपूर्ण स्थितियों पर प्रतिक्रिया के लिए विकसित किया है. तनाव के लिए अनुकूलन का एक सामान्य सुविधा विकास की गतिशीलता 1,2 में एक परिवर्तन है. घातीय वृद्धि दर और समय अंतराल, नई परिस्थितियों के अनुकूल करने के लिए आवश्यक अर्थात् समय: विकास की गतिशीलता दो मापदंडों से ज्यादातर की विशेषता है. उच्च तरीकों की एक बड़ी संख्या वृद्धि दर की माप पर ध्यान केंद्रित है, जबकि यह नई शर्तों के अनुकूलन के लक्षण वर्णन के लिए महत्वपूर्ण पैरामीटर है, हालांकि समय अंतराल, अक्सर एक अनदेखी पैरामीटर है. बदलती परिस्थितियों के लिए अनुकूलन की मात्रा पारंपरिक रूप श्रमसाध्य मैन्युअल तरीके 3,4 का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया है. अभी हाल ही में उन्नत तकनीक एकल कक्षों 5,6 के विश्लेषण के लिए विकसित किया गया है. हालांकि, यह विकास में देरी धीमी वृद्धि से (अर्थात् एक समय अंतराल) 2,3 निम्नलिखित सामान्य वृद्धि भेद करने के लिए अभी भी मुश्किल है. एक स्वचालित विधि से, ScanLag 7, निर्माण किया गया थाइन दो समान phenotypes के बीच भेदभाव.

समय अंतराल वितरण के अध्ययन के महत्व का अद्भुत उदाहरण एंटीबायोटिक उपचार के तहत पता चला है. एंटीबायोटिक दवाओं और अन्य तनाव बहुत से ही सक्रिय रूप से बढ़ कोशिकाओं को मारने, और, इसलिए, "ठंड" कर रहे हैं कि कोशिकाओं 8 संरक्षित कर रहे हैं. समय अंतराल पर नजर रखने के लिए, एक एक खुर्दबीन के नीचे एकल कक्षों का निरीक्षण और प्रथम श्रेणी के लिए समय की निगरानी कर सकते हैं. इस पद्धति का एक प्रमुख दोष गतिशील समय सीमा सीमित है; जल्दी से बढ़ रहे हैं कि उन कोशिकाओं को प्रभावी ढंग से लंबे समय तक समय अंतराल के साथ कोशिकाओं के विकास को कम करने, एक घातीय दर से सतह को कवर किया. प्रवाह कक्षों का प्रयोग कुछ हद तक इस 5 गतिरोध उत्पन्न, लेकिन कोशिकाओं की एक सीमित संख्या में लगाया जा सकता है और आबादी का बहुमत बढ़ शुरू कर दिया गया है के बाद अंतराल चरण से बाहर निकलें कि बैक्टीरिया के अंश नहीं देखा जा सकता है. इन सीमाओं के बावजूद, कई अध्ययनों डी के स्तर के प्रभाव का मूल्यांकन किया हैfferent एकल कक्ष माइक्रोस्कोपी 9-12 उपयोग कर समय अंतराल वितरण पर जोर दिया है. अंतराल समय वितरण पर नजर रखने के लिए एक और रास्ता मैलापन माप 13,14 के माध्यम से है. प्रत्येक एक एकल कोशिका से शुरू कर दिया कई समानांतर संस्कृतियों, समय के साथ संस्कृति में जीवाणुओं की संख्या उपाय है कि एक ऑप्टिकल घनत्व पाठक में बड़े हो रहे हैं. इस विधि एक्सट्रपलेशन की शुद्धता से और एक थाली में कुओं की संख्या तक सीमित है.

एक स्वचालित पद्धति भी बहुत लंबे अंतराल समय है कि एक आबादी में बैक्टीरिया के छोटे प्रतिशत के लिए, मूल्यांकन किया जाना अंतराल टाइम्स और विकास समय वितरण सक्षम बनाता है, ScanLag कहा जाता है, विकसित किया गया था. विधि पारंपरिक पोषक अगर प्लेट 15 (चित्रा 1) पर कालोनियों का पता लगाने पर आधारित है. पता लगाने 16,17 समय - समय प्लेटों की छवियों को प्राप्त करने के लिए घर सॉफ्टवेयर में से निर्देशित कर रहे हैं कि वाणिज्यिक स्कैनर 18 की एक सरणी को स्वचालित करने के लिए, इंजीनियर था. सॉफ्टवेयर थास्वतः छवियों का विश्लेषण और ऐसे समय 80 पिक्सल के लिए 20 पिक्सल से विकसित करने के लिए यहाँ के रूप में परिभाषित किया गया है जो प्रत्येक कॉलोनी के प्रत्येक कॉलोनी और विकास समय की उपस्थिति के समय के रूप में मात्रात्मक मापदंडों 19,20, निकालने के लिए डिज़ाइन किया गया. यहाँ हम प्रणाली की स्थापना और एक बेहतर यूजर इंटरफेस के साथ सुधार किया गया है जो स्वचालित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के उपयोग सहित, विस्तार में विधि प्रस्तुत करते हैं.

इस विधि ऐसी आकृति विज्ञान और रंग के रूप में कालोनियों की अन्य विशेषताओं को मापने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. मापदंडों के इन प्रकार के मापन बहुआयामी phenomics में इस प्रणाली के उपयोग की अनुमति देगा. विधि एकल कक्षों से कालोनियों का पता लगाता है, सिस्टम जनसंख्या स्तर माप से नहीं मापा जा सकता है कि नई phenotypes प्रकट कर सकते हैं. तकनीक दुर्लभ वेरिएंट का पता लगाने और पुनर्प्राप्ति सक्षम बनाता है, और वांछित लक्षण के लिए स्क्रीनिंग की सुविधा.

Protocol

1. सेटअप बनाएँ

  1. ऑप्टिकल संकल्प के साथ एक flatbed स्कैनर चुनें: 4,800 डीपीआई; हार्डवेयर संकल्प: 4800 x 9600 डीपीआई; रंग बिट गहराई: 48 बिट, प्रासंगिक तापमान और आर्द्रता के स्तर पर काम कर सकते हैं.
  2. पेट्री डिश आमतौर पर वाणिज्यिक स्कैनर पर प्रयुक्त कागज के विपरीत, महत्वपूर्ण मात्रा है. कालोनियों के बारे में 5 मिमी स्कैनर सतह से ऊपर, अगर परत के शीर्ष पर झूठ बोलते हैं. नोट: अधिकांश स्कैनर के लिए कालोनियों ध्यान में होगा.
  3. कुछ स्कैनर कंपनियों को एक ही कंप्यूटर के लिए एक ही प्रकार के स्कैनर के एक से अधिक उदाहरण के कनेक्शन की अनुमति नहीं है. एक से अधिक स्कैनर जुड़ी और विशिष्ट रूप से पहचाना जा सकता है कि सुनिश्चित करें.
  4. नीचे दिए गए विवरण के अनुसार सामान तैयार:
    1. बाँझ ब्लैक की तैयारी करें टुकड़े प्लेटों को कवर करने के लिए कपड़े (चित्रा 1 चरण 2) महसूस किया.
    2. जगह में पेट्री डिश पकड़ करने के लिए, स्कैनर फिट कि सफेद प्लेट धारकों (सामग्री और तरीके) तैयार करने और 6 hol है कितों बर्तन के आकार (चित्रा 1 कदम 3).
  5. सूक्ष्मजीव के विकास के लिए आवश्यक हैं, एक तापमान नियंत्रित वातावरण में स्कैनर डाल दिया. कंप्यूटर को स्कैनर से कनेक्ट करें.
  6. वैकल्पिक: कंप्यूटर के लिए रिले कनेक्ट और तापमान ढाल पर काबू पाने के लिए स्कैनर के पर / स्विच बंद बाईपास.
    नोट: रिले इकाई अत्यंत तापमान संवेदनशील सूक्ष्मजीवों के लिए है. इलेक्ट्रॉनिक्स असमान सतह गर्मी नहीं है कि तो यह स्कैनर बंद स्विच. स्कैनर सतह का ही हिस्सा का प्रयोग इसी तरह के परिणाम प्राप्त हो सकते हैं.

2. स्कैन प्रबंधक स्थापित करें

  1. Http://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications.html से एक नामित निर्देशिका में सभी 'स्कैनिंग प्रबंधक' आवेदन फाइल कॉपी करें.
  2. वे कंप्यूटर प्रबंधन> डिवाइस प्रबंधक> इमेजिंग उपकरण (में प्रकट रूप में स्कैनर के नाम के अनुसार ScanningManager.exe.config फ़ाइल को कॉन्फ़िगर
  3. 'स्कैनिंग प्रबंधक' आवेदन के निवारण के लिए, मुझे फाइल पढ़ने देखें.
  4. 'स्कैनिंग प्रबंधक' आवेदन पर आगे प्रलेखन के लिए, Documentation.html देखें.

3. एक प्रयोग करें

  1. पेट्री डिश (चित्रा 1) तैयार करें:
    1. लगभग 2,000 CFU / एमएल संस्कृति पतला. समान रूप से थाली सतह पर संस्कृति के 0.1 मिलीलीटर प्लेट.
    2. कालोनियों और पकवान के बीच अच्छा विपरीत हासिल करने के लिए और नमी को अवशोषित करने के लिए, बाँझ काले रंग का एक टुकड़ा के साथ थाली कवर का कपड़ा लगा. थाली पर ढक्कन लगा.
  2. स्कैनर पर धारकों में प्लेटें प्लेस.
  3. संलग्न स्कैनर की सूची से भाग लेने वाले स्कैनर चुनें: स्कैनिंग प्रबंधक (चित्रा 3) को प्रारंभ करें. (Repetitions) उठाए जाने की छवियों की संख्या, बाद में छवियों के बीच समय अंतराल (समय अंतराल), और टी शुरू करने से पहले समय की देरी चुनेंवह (के बाद शुरू) प्रयोग.

छवियाँ 4. विश्लेषण

नोट: कम्प्यूटेशनल विधियों की एक रूपरेखा http://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications पर गैर वाणिज्यिक उपयोग के लिए स्वतंत्र रूप से उपलब्ध है जो "ScanLag", का उपयोग MATLAB में छवियों का विश्लेषण करने के लिए प्रदान की जाती है. HTML. उपलब्ध आगे कार्यों सॉफ्टवेयर पुस्तिका में विस्तृत रहे हैं, और एक उदाहरण के कोड पूरक है.

  1. अलग फ़ोल्डर में प्रत्येक स्कैनर से छवियों तरह.
  2. Matlab के आदेश विंडो का उपयोग करना, निम्नलिखित प्रक्रियाओं चलाते हैं. इन प्रक्रियाओं को चलाने के लिए आवश्यक मापदंडों सॉफ्टवेयर पुस्तिका में परिभाषित कर रहे हैं.
    1. Preprocessing प्रदर्शन करने PreparePictures चलाएँ: preprocessing में, एक स्कैनर से छवियों गठबंधन कर रहे हैं. प्रत्येक पेट्री डिश छवियों के प्रत्येक दृश्य से उत्पन्न होता है. प्रत्येक छवि एकत्र की गई थी, जिस पर समय टाइमस्टैम्प से लिया गया है.
    2. ई में पता लगाने और प्रदर्शन पर नज़र रखने के लिए चलाए TLAllPlatesACH पेट्री डिश अलग कालोनियों पता लगाया है और एक की पहचान संख्या आवंटित कर रहे हैं.
    3. निकाले गए डेटा का विश्लेषण: हर पता चला कॉलोनी के आकार के समय के एक समारोह के रूप में मापा जाता है. कालोनियों की उपस्थिति वितरण निकालने के लिए Matlab के आदेश विंडो में निम्न कार्य (अधिक जानकारी के सॉफ्टवेयर पुस्तिका में उपलब्ध है) का उपयोग करें:
      1. समय (चित्रा 4) बनाम आकार कालोनियों के ग्राफ के साथ साथ एक निश्चित पेट्री डिश का विश्लेषण प्रदर्शित करने के लिए ScanLagApp चलाएँ.
        1. थाली की वर्तमान समय बदलने के लिए स्लाइडर का उपयोग करें. समय भी कालोनियों क्षेत्र ग्राफ पर एक मेल खड़ी रेखा से दर्शाया जाएगा.
        2. इसकी जुड़े वक्र को देखने के लिए एक कॉलोनी पर क्लिक करें, और इसके विपरीत, उसके संबंधित कॉलोनी को खोजने के लिए एक वक्र पर क्लिक करें. कॉलोनी की पहचान करने के बाद, फेनोटाइप पहचान पेट्री डिश से कॉलोनी उठा द्वारा प्राप्त किया जा सकता है.
        3. चू द्वारा स्वचालित विश्लेषण में फ़िल्टर दोषएक कॉलोनी गाते हैं और बाहर निकालने के बटन पर क्लिक करने. कॉलोनी की संख्या को बाहर क्लिक करके जब पीला हो जाएगा.
      2. प्रत्येक थाली के विश्लेषण के परिणामों के माध्यम से जाने के बाद, परिणाम को योग:
        1. उपस्थिति टाइम्स की एक हिस्टोग्राम बनाने के लिए AddHistograms चलाएँ.
        2. वितरण की एक जीवित रहने की अवस्था प्रतिनिधित्व बनाने के लिए plotDeathCurve चलाएँ.
        3. प्रयोग में सभी कालोनियों की उपस्थिति समय पाने के लिए GetAppearanceTimes चलाएँ.

Representative Results

समय अंतराल वितरण निकासी का एक उदाहरण के रूप में, चित्रा 5 एक स्क्रीनिंग परख में किया जाएगा, के रूप में समय के साथ एक थाली पर विशिष्ट विशेषताओं के साथ प्रत्येक कॉलोनी की पहचान करने और ट्रैक करने के लिए ScanLag की क्षमता को दर्शाता है.

सूक्ष्मजीव की संस्कृति विषम है, जब विभिन्न subpopulations परख के दौरान स्वयं प्रकट हो सकता है. उदाहरण के लिए, चित्रा 6 उपस्थिति मात्रा का ठहराव से पता चलता है और इस प्रकार ई. के एक उत्परिवर्ती तनाव में bimodal अंतराल समय वितरण से पता चलता है कोलाई.

कोशिकाओं की वृद्धि दर कॉलोनी की उपस्थिति समय को प्रभावित करती है. कालोनियों में एक ही दर से विकास करते हैं, तो देर से उपस्थिति समय अंतराल (चित्रा 7) के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है.

विधि वास्तव में एकल कक्षों का अंतराल समय है कि उपायों को मान्य करने के लिए, हम एकल कोशिका माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर प्राप्त उन लोगों के साथ ScanLag परिणामों की तुलना में; इस मान्यता को जानकारी हैपिछले एक प्रकाशन 7 में विस्तार से ribed. इस विधि माइक्रोस्कोपी के साथ मूल्यांकन किया जा सकता है की तुलना में कई अधिक कोशिकाओं की निगरानी में सक्षम बनाता है. माइक्रोस्कोपी का उपयोग और ScanLag का उपयोग कर प्राप्त प्राप्त वितरण काफी हद तक ओवरलैप. ScanLag वितरण थोड़ा व्यापक है; सैद्धांतिक विश्लेषण प्रभाग समय का मानक विचलन के आदेश के होने की विस्तृत बनाने की भविष्यवाणी. विकास समय प्रत्येक तनाव के लिए अलग है, दिखने में देरी की उत्पत्ति के आगे अन्य तरीकों का उपयोग कर जांच की जानी चाहिए.

बाद में कालोनियों की उपस्थिति पर जल्दी से दिखने कालोनियों के प्रभाव की जांच की गई थी. नियंत्रण प्रयोगों 7 बाद में उपस्थिति के रूप में लंबे समय के प्रति प्लेट कालोनियों की कुल संख्या (चित्रा 8) 200 से अधिक नहीं था के रूप में प्रभावित नहीं किया गया था कि पुष्टि की. एक और नियंत्रण प्रयोग प्लेट पर कॉलोनी के स्थान अपनी उपस्थिति समय 7 को प्रभावित नहीं किया गया था कि पुष्टि की.

पी का विश्लेषणlates मध्यम विकास या सूक्ष्मजीव के प्रकार में मौजूद पोषक तत्वों के आधार पर संशोधन की आवश्यकता हो सकती है कि विशिष्ट थ्रेसहोल्ड कैलिब्रेटेड है. 9 चित्र में दिखाया गया है फिर भी, विश्लेषण थ्रेसहोल्ड की एक बड़ी रेंज के लिए काफी मजबूत है.

चित्रा 1
चित्रा 1. एक कॉलोनी उपस्थिति वितरण बनाने के लिए आवश्यक कदम का एक योजनाबद्ध आरेख.

चित्रा 2
चित्रा 2. संलग्न स्कैनर, और विन्यास फाइल के के नाम दिखा डिवाइस प्रबंधक का एक स्क्रीन शॉट. एक बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करेंइस आंकड़े के संस्करण.

चित्रा 3
स्कैनिंग प्रबंधक की चित्रा 3. एक स्क्रीन शॉट.

चित्रा 4
चित्रा 4. ScanLagApp की एक स्क्रीन शॉट. प्लेट की एक छवि बाएँ फलक पर है, और मैनुअल में विस्तृत रूप में प्रत्येक कॉलोनी के विकास घटता, सही फलक पर हैं. दो या दो से अधिक कालोनियों मर्ज जब कालोनियों क्षेत्र घटता से कुछ के स्पाइक्स होते हैं. कालोनियों का विलय होता है, इन कालोनियों के क्षेत्र में संयुक्त क्षेत्र के रूप में माना जाता है.

चित्रा 5
चित्रा 5. एक थाली के विश्लेषण का एक प्रतिनिधि परिणाम. (ए) प्रयोग के अंत में पता लगाने के आवेदन के उत्पादन की एक छवि. प्रत्येक कॉलोनी क्षेत्र, पहचान रंग और एक अद्वितीय पहचान संख्या के साथ सौंपा है. तीर कॉलोनी (तीव्रता दहलीज पर आधारित पता चला है बी में मापा प्रतिनिधि कालोनियों को इंगित लेग अगर या M9 अगर पर ई. कोलाई कालोनियों के लिए यह सीमा 0.03 है. अन्य मीडिया या बैक्टीरिया के लिए, इस सीमा समारोह ProcessPictures में समायोजित किया जा सकता है ). 10 पिक्सल से ऊपर केवल वस्तुओं (इस सीमा समारोह MatchColonies में संशोधित किया जा सकता है) में गिने जाते हैं. एक कॉलोनी की जांच लगभग 10 5 बैक्टीरिया में शुरू होता है. इस थाली में चार प्रतिनिधि कालोनियों के समय की तुलना में पिक्सल में क्षेत्र के (बी) के भूखंडों. कॉलोनी का पता चला है जब प्रत्येक कॉलोनी की 'उपस्थिति' का समय है. समय fro विकसित करने के रूप में प्रत्येक कॉलोनी के 'विकास' का समय यहाँ परिभाषित किया गया है80 पिक्सल (उन सीमाओं समारोह getAppearanceGrowthByVec का उपयोग समायोज्य रहे हैं) के लिए एम 20 पिक्सल. सॉफ्टवेयर ऊपरी बाध्य तक पहुँचने से पहले विलय कर दिया है कि कालोनियों शामिल नहीं है. अपनी विशेषताओं के अनुसार एक विशिष्ट कॉलोनी की पहचान पहचान संख्या और हर कॉलोनी को सौंपा रंग करने के लिए आसान धन्यवाद है. उदाहरण के लिए # 1 कालोनियों 56, 77 और 124 दोनों रेखांकन में डाला जाता है.

चित्रा 6
चित्रा 6. उपस्थिति मात्रा का ठहराव bimodal अंतराल समय वितरण प्रकट कर सकते हैं. दो अलग अलग उपभेदों के लिए उपस्थिति समय की ScanLag विश्लेषण हिस्टोग्राम की तुलना करें. ब्लू लाइन: जंगली प्रकार तनाव तेजी से (कुल: 1,320 कालोनियों) बढ़ रही है; ठंड बैक्टीरिया (: 1529 कॉलोनियों कुल) के साथ समृद्ध लाल रेखा से उच्च दृढ़ता उत्परिवर्ती. (ए) सामान्यीकृत उपस्थिति histograms. शिखरतेजी से बढ़ कोशिकाओं की उपस्थिति का पता लगाने योग्य कॉलोनी को विकसित करने के लिए विशिष्ट समय है. इनसेट: bimodal अंतराल समय वितरण दिखा प्रवेश दूरी डिब्बे पर वास्तविक समय अंतराल पाने के लिए घातीय संस्कृति के चरम के समय को घटाने के बाद उत्परिवर्ती तनाव का एक ही हिस्टोग्राम. (बी) एक लघुगणकीय पैमाने पर (ए) के रूप में ही डेटा की जीवन रक्षा समारोह. इस प्रतिनिधित्व उत्परिवर्ती तनाव की देर उपस्थिति पूंछ को बढ़ाता है.

चित्रा 7
चित्रा 7. रूप वितरण और विकास समय वितरण. (ए) और (बी) के दो आयामी उपस्थिति समय के histograms और दो ​​अलग अलग परिस्थितियों (सॉफ्टवेयर ऊपरी बाध्य तक पहुँचने से पहले विलय कर दिया है कि कालोनियों को शामिल नहीं) की वृद्धि के समय दिखा. (सी) हिस्टोग्राम की तुलनाविकास टाइम्स (डी) समान हैं जबकि दो उपभेदों की उपस्थिति समय में अंतर दिखा. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

8 चित्रा
चित्रा 8. जल्दी कालोनियों की उपस्थिति बाद में कालोनियों की उपस्थिति के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है. (ए) अकेले चढ़ाया जंगली प्रकार की कोशिकाओं का समय वितरण अंतराल. (बी) अनुमोदक तापमान को हस्तांतरण के बाद, अकेले एक ठंड संवेदनशील तनाव के समय वितरण अंतराल. (सी) एक ही परिस्थितियों में एक साथ चढ़ाया दोनों उपभेदों के समय वितरण अंतराल. काला लाइन अलग से तनाव को मापने जब प्राप्त आंकड़ों के आधार पर उम्मीद वितरण का प्रतिनिधित्व करता है. एक अच्छा एकउम्मीद और मापा वितरण के बीच greement के रूप में लंबे समय के प्रति प्लेट कालोनियों की कुल संख्या 200 से नीचे है के रूप में प्राप्त की है.

9 चित्रा
.. 9 चित्रा का पता लगाने के दहलीज कॉलोनी उपस्थिति वितरण के आकार को प्रभावित नहीं करता कॉलोनी उपस्थिति वितरण दो अलग दहलीज आकार का उपयोग करते हुए एक ही डेटा सेट के लिए विश्लेषण किया गया था; (ए) सीमा आकार 10 पिक्सल है; (बी) सीमा आकार 50 पिक्सल है. हिस्टोग्राम प्रति कोशिकाओं की संख्या: लगभग. 1,500. अलग पहचान सीमा केवल पता लगाने के लिए समय की एक पारी में यह परिणाम है.

चित्रा 10
10. तापमान स्थिरता माप ACR चित्राविद्युत प्रबंधन के बिना स्कैनर पर हो बेसिलस subtillis की कालोनियों के साथ एक थाली के ओएसएस स्कैनर की सतह. (ए) छवि. सतह तल पर गरम है और इसलिए कालोनियों तेजी से बढ़ता है. प्लेट के बगल में क्रमिक लाइन गर्मी ढाल की एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व है. (बी) के तापमान स्थिरता स्कैनर की सतह भर में रखा दो thermocouples के साथ मापा गया था. स्कैनर प्रत्येक स्कैन के दौरान और समय के साथ गरमा. (सी) विद्युत प्रबंधन के साथ, तापमान एक समान है और कालोनियों समान दर से बढ़ने. (डी) विद्युत प्रबंधन मॉड्यूल के साथ (बी) के रूप में भी. ± 0.2 डिग्री सेल्सियस का तापमान स्थिरता

11 चित्रा
चित्रा 11. उपस्थिति वितरण में अंतर di के कारण हो सकता हैठोस माध्यम के संस्करणों में fferences. वही जीवाणु संस्कृति अगर सतह का एक अलग ऊंचाई में जिसके परिणामस्वरूप, लेग अगर के विभिन्न संस्करणों के साथ प्लेटों पर चढ़ाया गया था. अलग ऊंचाइयों प्लेटों के विभिन्न अस्पष्टता, और इसलिए एक अलग पहचान समय के लिए नेतृत्व किया. इंटर प्लेटें अंतर की जाँच की और अलग ऊंचाई की स्थितियों के बीच का अंतर था. लेग अगर की 30 ± 0.5 मिलीग्राम के बराबर मात्रा की प्लेटों के बीच (ए) विशिष्ट मतभेद. अलग ऊंचाई की स्थितियों के बीच (बी) अंतर: उपस्थिति वितरण 30 ± 0.5 मिलीलीटर (हरा) के और 40 ± 0.5 मिलीलीटर (नीला) के 20 ± 0.5 मिलीलीटर (लाल) की मात्रा के साथ प्लेटों के लिए मापा गया था. प्रत्येक शर्त के 6 अलग प्लेटों का औसत है. जब तक प्लेटों की मात्रा ± 5 एमएल सीमा के भीतर है, के रूप में अस्पष्टता समान है और इसी तरह की उपस्थिति समय वितरण की ओर जाता है.

Discussion

प्रत्यक्ष अवलोकन के आधार पर सूक्ष्म तरीकों अक्सर एकल कक्ष व्यवहार के अध्ययन के लिए "गोल्डन मानक 'के रूप में माना जाता है. बैक्टीरिया की आबादी में अंतराल टाइम्स के वितरण की माप सक्षम बनाता है जो ScanLag,, एकल कोशिका विश्लेषण से प्राप्त वितरण के साथ अच्छे समझौते में डेटा प्रदान करता है और काफी ज्यादा आंकड़े को प्राप्त होता है.

कई महत्वपूर्ण कदम अच्छी तरह से काम करने के लिए इस विधि के लिए प्रदर्शन किया जाना है: पहला, अच्छा चित्र प्राप्त करने के लिए 4800 x 9,600 होना चाहिए जो स्कैनर संकल्प, पर समझौता नहीं करते. दूसरा, ऊर्जा प्रबंधन मॉड्यूल (कदम 1.6) के बिना, तापमान ढाल flatbed सतह पर विकसित करने और विकास को प्रभावित कर सकता है जागरूक होना. एक और महत्वपूर्ण कदम गलती सॉफ्टवेयर द्वारा कालोनियों के रूप में गिना गया हो सकता है कि इस तरह के धूल के रूप में दोष के छानने का काम है. सॉफ्टवेयर में निर्मित पृष्ठभूमि घटाव आमतौर पर इन दोषों पर काबू, लेकिन कभी कभी "झूठे" कालोनियों के लिए हैमैन्युअल रूप से फिल्टर किया.

(एक) सूक्ष्म जीवाणुओं की वृद्धि दर के तापमान से प्रभावित है: मुख्य समस्या निवारण चरणों कई कारणों की वजह, सेटअप में अंतर - प्लेट भिन्नता पता हो सकता है. अलग तापमान और आर्द्रता के कारण स्थिति इनक्यूबेटर में पकवान की असमान वेंटिलेशन या स्थान के लिए हो सकता है. (ख) स्कैनर के इलेक्ट्रॉनिक्स स्कैनर की सतह भर में एक तापमान ढाल गर्मी और कारण हो सकता है. 10 एक साथ पहले स्कैनर सतह पर तापमान की माप के साथ, बेसिलस जीवाणु पर इस तरह के स्थानिक गर्मी ढाल के प्रभाव से पता चलता है और आंकड़ा ऊर्जा प्रबंधन मॉड्यूल को लागू करने के बाद (1.6 कदम). इस मॉड्यूल नए स्कैनर के लिए आवश्यक नहीं किया जा सकता है, और स्कैनर सतह का ही हिस्सा इस्तेमाल किया जाता है, तो बिजली प्रबंधन अनावश्यक हो सकता है ध्यान दें. (ग) अगर पोषक तत्व के विभिन्न अस्पष्टता के साथ प्लेटों का पता लगाने के लिए विभिन्न स्तरों तक ले सकता है. 11 शो वें चित्राविभिन्न अस्पष्टता में परिणाम है कि पोषक तत्व अगर के विभिन्न संस्करणों के लिए ई सहिष्णुता.

प्रयोगात्मक ScanLag तकनीक का प्रदर्शन करने के लिए आसान है और केवल मानक पेट्री डिश पर सूक्ष्मजीवों थाली करने के लिए, और स्कैनर की सतह पर उन्हें जगह की आवश्यकता है. विकसित किया गया था कि सॉफ्टवेयर पूरी प्रक्रिया को नियंत्रित करता है. छवि अधिग्रहण स्वचालित रूप से किया है, और कॉलोनी ट्रैकिंग के लिए छवि विश्लेषण भी स्वचालित है. इसके अलावा, प्रणाली स्केल अप किया जा सकता है एक ही समय में कई अलग अलग स्थितियों को मापने के लिए. अंत में, विधि वाणिज्यिक कार्यालय स्कैनर पर निर्भर करता है और, इसलिए, कम लागत है.

इस तकनीक ई. से अलग जो सूक्ष्मजीवों का अध्ययन करने के लिए बढ़ाया जा सकता है कोलाई कश्मीर 12, हालांकि कई विचार किया जाना है. सबसे पहले, बाद में लोगों पर जल्दी दिखने कालोनियों का प्रभाव पिछले एक प्रकाशन 7 में विस्तार से वर्णित है, का मूल्यांकन किया जाना है. ई. के लिए कोलाई कश्मीर 12,प्लेट प्रति CFU की अधिकतम घनत्व. कालोनियों के विभिन्न आकारों के साथ अन्य उपभेदों 200 है, और कालोनियों के बीच अन्य संभावित पार बात, एक अलग घनत्व की आवश्यकता हो सकती है. दूसरा, प्लेटों के विश्लेषण ठोस मध्यम और कालोनियों के बीच इसके विपरीत पर निर्भर करता है, संशोधित करने की आवश्यकता हो सकती है कि विशेष सॉफ्टवेयर आधारित थ्रेसहोल्ड कैलिब्रेटेड है. सॉफ्टवेयर अंतराल और विकास दर के अलावा, अन्य कॉलोनी विशेषताओं निकालने के लिए भी बढ़ाया जा सकता है. सॉफ्टवेयर कोड खुला है और कॉलोनी आकार, चमक, चिकनाई और रंग निकालने के लिए संशोधित किया जा सकता है.

माप एकल कक्षों से उत्पन्न होने वाली कालोनियों पर बना रहे हैं, डेटा जनसंख्या स्तर माप से नहीं मापा जा सकता है कि नई phenotypes प्रकट करते हैं. समय अंतराल वितरण के महत्व को एंटीबायोटिक दवाओं की उपस्थिति में पता चला है. कई एंटीबायोटिक दवाओं केवल बढ़ कोशिकाओं के खिलाफ प्रभावी माने जाते हैं; इसलिए, जब तक कि कोशिकाओं अंतराल चरण में रहते हैं और हो जाना नहीं है, जैसा कि वे समर्थक रहे हैंउन एंटीबायोटिक दवाओं के 21 के प्रभाव से tected. उत्तरजीवी जीवाणुओं की संख्या एंटीबायोटिक उपचार 15,22,23 के दौरान समय के अंतराल पर मूल्यांकन कर रहे हैं, persisters नामक जीवाणु के एक subpopulation,, अक्सर पता चला है. कुछ मामलों में, एंटीबायोटिक उपचार के लिए प्रतिरक्षा लंबे समय तक अंतराल से निकलती है. इस स्थापना का उपयोग, इस अंतराल से पता चला है और अक्सर एक गैर तुच्छ वितरण 24 (चित्रा 6) है. यह विधि भी दुर्लभ म्यूटेंट की बहाली के लिए सक्षम बनाता है. उदाहरण के लिए, एक mutagenized आबादी चढ़ाना के बाद, म्यूटेंट फेनोटाइप के आधार पर पहचाना जा सकता है और चयन के बिना सीधे पृथक. सेटअप इसके अलावा आसपास के कालोनियों के घनत्व के एक समारोह के रूप में कालोनियों के विकास को मापने के द्वारा सेल सेल बातचीत की निगरानी कर सकता है और इस तरह कोरम संवेदन या रेंगनेवाले बैक्टीरिया के प्रसार के रूप में घटना यों की. इस पद्धति का उपयोग भविष्य प्रयोगों द्वारा खुला बहुआयामी जानकारी माइक्रोबियल आबादी के बेहतर लक्षण वर्णन करने के लिए नेतृत्व करेंगेएस और चिकित्सा और पर्यावरण अनुसंधान के क्षेत्र में प्रगति करने के लिए.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacto agar BD 214010
Difco LB broth BD 240230
Petri dish 90 mm Miniplast 20090-01
Epson Perfection v37 Epson B11B207201 Flatbed Scanner with Optical resolution: 4,800 dpi, Hardware Resolution: 4,800 x 9,600 dpi, color bit depth 48-bit.
Epson Perfection v200 Epson B11B188011
Epson Perfection 3490 Epson B11B177011
ADU200 USB Relay ONTRAK
Pieces of sterile black felt cloth Custom made Approximatly 100 x 100 mm
White plate holders Custom made Surface size, with 6 x 99 mm diameter hole
Delerin rings the size of the Petri dish Custom made Inner diameter: 72 mm
Outer diameter: 86 mm
Top outer diameter: 90 mm

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References

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