גרימת Myointimal היפרפלזיה נגד טרשת עורקים בעכברים: מבוא של שני מודלים חוקיים

* These authors contributed equally
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

וידאו זה מראה שני מודלים של פיתוח פלאק בעורקי intimal עכבריים ומדגיש את ההבדלים בהיפרפלזיה myointimal וטרשת עורקת.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Stubbendorff, M., Hua, X., Deuse, T., Ali, Z., Reichenspurner, H., Maegdefessel, L., Robbins, R. C., Schrepfer, S. Inducing Myointimal Hyperplasia Versus Atherosclerosis in Mice: An Introduction of Two Valid Models. J. Vis. Exp. (87), e51459, doi:10.3791/51459 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

במודלים של מכרסמים מעבדה שונים vivo לאינדוקציה של היצרות של עורק הוקמו כדי לחקות מחלות הכוללות היווצרות הפלאק בעורקים והיצרות, כפי שנצפה לדוגמא במחלת לב איסכמית. שני דגמים מאוד לשחזור עכבר - שניהם וכתוצאה מכך היצרות של עורק אבל בכל בסיס מסלול של פיתוח שונה - הם הציגו כאן. המודלים מייצגים את שתי סיבות השכיחות ביותר של היצרות של עורק; כלומר מודל אחד עכבר עבור כל היפרפלזיה myointimal, טרשת עורקים מוצגים. כדי לגרום להיפרפלזיה myointimal, פגיעת קטטר בלון של אב העורקים בבטן מבוצעת. להתפתחות של רובד טרשתי, ApoE - משמש מודל העכבר בשילוב עם דיאטת שומן מערבית - /. אפשרויות מותאמות מודל אחרים למדידה וההערכה של התוצאות בשם ותיארו בכתב היד הזה. ההקדמה והשוואה בין שני מודלים אלה מספק informatיון למדענים לבחור את מודל היצרות של עורק המתאים בהתאם לשאלה המדעית שאלה.

Introduction

במדינות מתועשות מחלת לב איסכמית נשארה גורם מוביל לתמותת 1. הגורמים להיצרות של עורקים הכליליים הם מגוונים וכוללים היפרפלזיה myointimal כמו גם טרשת עורקים, עם revascularization נותר אסטרטגית הטיפול הנפוצה ביותר 2. מודלים מחקר שלהבחין בין המסלולים מכניסטית של היפרפלזיה intimal וטרשת עורקת באופן ברור הם חיוניים כדי לחקור את pathobiological ותהליכי pathophysiological בפיתוח פלאק בעורקים. בסרטון הזה שני דגמי עכבר שונים המשמשים ללימודים או ההתפתחות של היפרפלזיה myointimal או טרשת עורקים הם הציגו.

היפרפלזיה Myointimal הוא הניח ליצירת באמצעות פרדיגמה "תגובה לפציעה" שתוארה במקור לטרשת עורקת 3. ההפרעה מכאנית של שכבת האנדותל מובילה לשיפוץ אינטנסיבי משופר על ידי אפקטים אוטוקריני. ישנם כמה diמודלים של בעלי החיים fferent הנפוצים ללמוד היפרפלזיה myointimal. חלק מהקבוצות משתמשות בהתקני מתכת באב העורקים העולה של חולדות 4. מודל denudation אב העורקים בוצע עם צנתר בלון הוא גם בשימוש נפוץ בחולדות מעבדה 5,6. מודל היפרפלזיה intimal שבוצע בעכברי מעבדה 7 מיישם קשירה של עורק הצוואר וגורם לנגעי myointimal 8. במעבדה שלנו, מודל denudation אב העורקים בבטן - כדי ללמוד את ההתפתחות של היפרפלזיה myointimal - כמו גם דגם restenosis סטנט האנושי 9 משמשים בדרך כלל. וידאו זה מדגיש כי בחירת מודל החיה הניסיונית הנכון היא קריטית עבור מחקרים מכניסטית או pathophysiologic של היצרות העורק.

מודלים היפרפלזיה Myointimal יש להבחין בין מודלים טרשת עורקים. באפשרות השנייה, (ApoE - / -) E-חסר אפוליפופרוטאין עכברים בשילוב עם תזונה מערבית משמשים בדרך כלל כדי לגרום atherosclנגעים ארוטיים 10,11,12,13. דוגמאות לאינדוקציה של שני סוגים אלה של מחלה בעכברי myointimal מוצגות כאן, יחד עם אפשרויות מותאמות מודל שונים לנתח היצרות כלי 14.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל העבודה של בעלי החיים צריכה להתבצע על פי הנחיות טיפול בבעלי החיים רלוונטיות. לקבל את אישור מוסדי לעבודה של בעלי חיים לפני פרוטוקול התחלה.

1. Myointimal היפרפלזיה דגם ()

עבור דגם היפרפלזיה intimal, לרכוש C57BL/6J (מספר מניות 000,664, C57BL/6J) עכברים בגיל 8 שבועות במשקל של כ 25 גרם. עכברי בית לניסויים האלה בתנאים קונבנציונליים; להאכיל את האוכל בעכבר סטנדרטי עכברים ולספק כרצונך מים.

  1. הכנת עכבר: להכניס את העכבר למצב הרדמה עם isoflurane (2%), תוך ניצול תא אינדוקציה.
    1. להסיר את השיער בבטן באמצעות גוזם שיער, להניח את העכבר על גבה ולכסות את האף והפה שלה עם facemask כדי להבטיח את ההרדמה.
    2. עם Provo-יוד, לחטא את אזור הבטן באופן אוניברסלי, ואחריו 80% אתנול, בשני מחזורים.
    3. מבטיח היעדרשל רפלקסים על ידי צובט את הגפיים האחורי כדי לפקח על העומק מספק של הרדמה.
    4. הפרד את העור ושרירים לאורך alba Linea בשני שלבים כדי לחשוף את איברי הבטן.
    5. הנח את המעיים בכפפה מלוחה לחות. עטוף את הכפפה סביב המעיים כדי לשמור אותם לחים.
    6. בקשב רב לסלק את רקמת שומן ציפוי מקצועית אב העורקים בבטן. לחשוף את אב העורקים infrarenal עד להסתעפות שלה, נזהר שלא לפגוע בכל כלי שיט של הסניף.
    7. ראשית, מקום מהדק microsurgical על הפרוקסימלי, אב העורקים infrarenal לסגור את זרימת הדם. עכשיו, להחיל מהדק דיסטלי שני ליד הסתעפות של אב העורקים.
    8. כאשר זרימת הדם נקטעה, לעשות חתך קטן לתוך אב העורקים קרובים למהדק הפרוקסימלי.
    9. הכנס את הצנתר שקצהו הבלון, אשר כבר לחות עם מי מלח 0.9%, ולהתקדם לעבר המהדק הדיסטלי של אב העורקים.
    10. לפציעה אנדותל, לחשוף את אב העורקים באמצעות ניפוח balloon מושך בזהירות ובאיטיות את הקטטר לכיוון של המהדק הפרוקסימלי.
    11. חזור על תרגיל denudation פעמיים.
    12. הסר את הקטטר ולסגור את חתך אב העורקים באמצעות 10-0 תפרי ריצה prolene.
    13. פותח בזהירות את מהדק דיסטלי. במקרה של דימום באתר aortotomy, סגור את המהדק שוב, לאתר את הדימום ולמקם את התפרים קטע נוספים, במידת צורך.
    14. אם ניתן להבחין אין דימום, פתח לאט את המהדק הפרוקסימלי.
    15. דופק של אב העורקים צריך להיות גלוי distally מהחתך. כעת ניתן לארגן בחזרה את המעיים באתרם.
    16. יש לשטוף את חלל בטן ניצול תמיסת מלח סטרילית מחוממת מראש.
    17. סגור את דופן הבטן מתחילה עם שכבת השרירים באמצעות תפרי 6-0 ריצה prolene.
    18. הבא להתאים את העור מתחת לשימוש ב5-0 תפרי ריצה prolene ביצוע.
    19. במהלך הזמן את העכבר הוא עדיין מורדם, להחיל 4-5 מ"ג / קילוגרם Carprofen באמצעות inje תת עוריתction.
    20. הוספת Metamizol למי השתייה (50 Metamizol מ"ג ל100 מיליליטר) לשליטה בכאב ולהמשיך לפוסט 3 ימי ניתוח. לפקח על בעלי חיים בכל התאוששות.
      הערה: תקופת התצפית עבור דגם זה היא 28 ימים.

2. טרשת עורקים דגם (B)

למודל טרשת עורקים, לרכוש אפוליפופרוטאין E-לקויה (ApoE - / -) עכברים (מספר מניות 002,052, B6.129P2-Apoetm1Unc / J) בגיל 4 שבועות, ולאחר מכן האכיל ל4-6 חודשים. עכברי בית לניסויים האלה בתנאים קונבנציונליים; להאכיל את עכברי התזונה עתירה שומנים מערביות עם הגעה (הרלן מעבדות TD.88137) ולספק כרצונך מים למשך תקופה של 4 עד 6 חודשים.

  1. הכנת עכבר:
    1. להאכיל את ApoE - / - עכברים עם תזונה מערבית מתחילים ב 4 שבועות של גיל. מניפולציה תזונתית צריכה להתחיל ישירות בעת הגעה.
    2. לשמור על דיאטה מערבית לאורך תקופת הניסוי. </ Li>

3. ניתוח

  1. מודל היפרפלזיה Myointimal ()
    האזור של עניין במודל זה הוא "אזור הנגע". אפשרויות לניתוח כוללות מחיקת luminal, יחס I / M (יחס אינטימה / מדיה), עובי myointima מקסימאלי, אזור myointimal, מכתים Trichrome לסיסטיק, וצביעת H & E לתאים חד גרעיניים (כפי שמודגם באיורים 1A-1C). על פי השאלה המדעית ניתן ליישם stainings רב אחר כמו אדום Picrosirius לקולגן, אימונוהיסטוכימיה, ושיטות confocal.
  2. מודל טרשת עורקים (ב ')
    האזורים של עניין במודל זה הם שסתום אב העורקים, קשת אב העורקים, כמו גם את אב העורקים היורדים. אפשרויות לניתוח: מכתים סודן אדום לשומנים וTrichrome הכתמה של שסתום אב העורקים, קשת אב העורקים ואב העורקים יורדים (כפי שמודגם באיור 1D).
    מודל זה גם תשואות מגוון רחב של אפשרויות צביעה אחרות כמולמשל שמן האדום O לשומנים ניטראליים, אדום Picrosirius, אימונוהיסטוכימיה, ושיטות confocal.
    1. צביעה אדומה סודן: בצע הצביעה האדומה סודאן על רקמת אב העורקים טריים שנקטפו.
      1. הסר את 6 שעות הדיאטה לפני הקציר.
      2. להציג את העכבר למצב הרדמה עם isoflurane (2%), תוך ניצול תא אינדוקציה. מבטיח היעדר רפלקסים על ידי צובט את הגפיים האחורי כדי לפקח על העומק מספק של הרדמה.
      3. פתח את החזה; לנתק את השיא של הלב וינקב דרך החדר השמאלי, ראשון עם מי מלח (3 מיליליטר), ואחריו PFA 4% (3 מיליליטר) דרך שורש אב העורקים לתקן את אב העורקים.
      4. לשחרר את אב העורקים מהשורש ועד להסתעפות שלה. נסה להסיר את רקמת שומן ככל האפשר.
      5. חותכים את הלב ואת שורש אב העורקים, ולאחסן אותם בPFA 4% להיסטולוגיה.
      6. להיסטולוגיה שורש אב העורקים יש לזהירות יוצב בבלוק פרפין בתנוחה זקופה כדי לאפשר החיתוך של AORשקופיות מניבת שורש טיק המציגות את כל 3 עלונים מסתמית.
      7. לחתוך קצה אחד של עץ אב העורקים ולתקן אותה על שכבת סיליקון עם סיכות בסדר. לפתוח את אב העורקים אורכים ולתקן את הרקמות של אב העורקים.
      8. יש לשטוף את הרקמה עם 50% אתנול. לטבול את הרקמה עם פתרון מכתים סודן III עבור -15 דקות.
      9. יש לשטוף בעדינות עם 50% אתנול להסיר את סודאן III העודף. (הערה: 50% אתנול עשוי לשטוף את הצבע משם.) לשטוף עם DH 2 O, ולצלם לניתוח נוסף.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 1 מציג אפשרויות ניתוח שונות ומצב מחלה הנגרם לשני הדגמים. עבור דגם היפרפלזיה intimal, הניתוח של חתכי נציג בTrichrome מכתים מוצג. מחתכים אלה, תוצאות כמו יחסיי / מ ', עובי שלט מרבי, עובי intimal מרבי בלומן, מחיקת luminal באחוזים, כמו גם שטח שלט ניתן למדוד ומחושבות.

כדי להעריך את התוצאה של מודל טרשת עורקים, ניתן להשתמש בכל השיטות בשם הנ"ל. בנוסף, באזור הלוחית כמוני באב העורקים בבטן, בהיקף של היווצרות הפלאק בשסתום אב העורקים, קשת אב העורקים, ואב העורקים יורד ניתן למדוד באמצעות Trichrome מכתים.

איור 1
איור 1. Aortas עכבר ערום נקצרים, פרפין מוטבע, וחתך נציג מוצג בTrichrome הכתמה (). יחסים אני / M מחושבים על חלקים מוכתמים Trichrome ידי מדידת אינטימה ועובי תקשורת באמצעות ניתוח מחשב ואחרי חישוב היחס (ב '). עובי לוחית מקסימאלי נמדד כעובי intimal המרבי בלומן על ידי morphometry מחשב (ב '). מחיקת לומינל (באחוזים) נקבעת על ידי הפחתת לומן הפנימי החדש מלומן לשעבר, מחולק בלומן לשעבר, כפול 100% (C). אזור פלאק נבחנים על ידי הפחתת לומן הפנימי החדש מלומן לשעבר (C). אב העורקים יורד, פתחו את אורכים עם מבני lipophilic ומוכתמים באדום סודן מוצג (ד '). כדי לקבוע את אזור פלאק כמותיים, נגעים אדומים מוכתמים סודן, כמו גם את אזור אב העורקים סך הכל, נמדדים וanalyzed באמצעות תוכנת ניתוח תמונה. חתכים של דגימות פרפין מוטבעות של שסתום אב העורקים, קשת אב העורקים, ואב העורקים יורד בTrichrome מתוארים (E). מחיקת לומינל, אזור שלט, ועובי לוחית מרבי מחושבים כפי שתוארו לעיל. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

למרות ששני המחלות גורמות לסימפטומים דומים אצל המטופל, את מנגנוני התפתחות פלאק ולכן הגישות הטיפוליות הם שונים מאוד 2. בצורות שונות של היצרות העורק הממצאים הקליניים בחולים, כמו גם את מסגרת הזמן של התפתחות רובד תלויה במנגנון הבסיסי.

בהתאם לממצאים הקליניים בחולה, שיטות שונות של ניתוח מדגם חייבת להתבצע 5,15. יש צורך להתאים את הניתוח לממצאים האופייניים במחלה כי הוא חיקה על ידי המודל שנבחר 14. להיפך, תלוי במחלה הנחקרת, יש לבחור במודל החיה האפשרי והמתאים ביותר. יתר על כן, חשוב כי תרופות חדשות צריכים מכניסטי להתאים את המודל.

שני הדגמים הוצגו בפרסום זה הם מהירים וקלים לביצוע ומאוד לשחזור. יש כמה maהבדלי יור בין המודלים. לדוגמא, זמן התצפית במודל היפרפלזיה myointimal הוא 28 ימים 16, תוך פיתוח פלאק טרשתי צריך ארבעה עד שישה חודשים 17.

הבדל עיקרי נוסף הוא התחולה לזנים שונים עכבר. מודל טרשת עורקים מסתמך על ApoE - / - או ה-LDL - / - בעכברים ולכן יכול להתבצע רק בעכברים שנשאו בנוקאאוט הספציפי הזה. כדי ליצור עכברים שנשאו שני ApoE - / - ועוד בנוקאאוט הרצוי הוא מאוד זמן רב. היפרפלזיה myointimal גרימת פציעת ניתוח בלון יכולה להתבצע בכל עכבר. תשואות מודל היפרפלזיה myointimal יותר פוטנציאל לשנות את זן העכבר של עניין, ואילו המודל של הטרשת העורק עומד בפני הגבלה קפדנית לעכברים שנשאו ApoE - / -.

עוצמת denudation הבלון היא קריטית לתוצאה של נגעי היפרפלזיה myointimal. אם פגיעת קטטר מבוצעת AGG מדיressively, היווצרות מפרצת עלולה להתרחש; אם denudation מבוצע מדי בעדינות, פיתוח פלאק עלול להיות חלש מדי כדי לראות את ההבדלים בין קבוצות. בהליך זה זה מועיל אם כל הניתוחים במחקר אחד נמצאים שבוצעו על ידי אותו האדם. היתרון של פציעת הבלון כלפי טכניקות אחרות הדורשות את ההקדמה של מכשולים נוקשה או חדים כמו חוטים, הוא הגמישות, כמו גם את האפשרות להתאים את הגודל ולחץ של הבלון באמצעות האינפלציה של קטטר שקצהו הבלון. יתר על כן קטטר שקצהו הבלון תפח הוא דק ויכול להיות מוכנס לתוך אב העורקים דרך חתך קטן יחסית בהשוואה לכלים עבים יותר, קשיחים יותר denudation. למודל היווצרות פלאק טרשת עורקים זה יכול להיות מכריע להתחיל להאכיל את הדיאטה המערבית בגיל צעיר של העכברים משום שיכול להיות בעל השפעה גדולה על החומרה של הנגעים. מאז נגעים בשני המודלים הציגו לפתח בשני עכברי הנשים וגברים, המין יכול להיות adapteד לדרישות של הניסוי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מודים לכריסטיאן Pahrmann לקבלת סיוע טכני. האס זכה למימון (DFG) (SCHR992/3-2 וSCHR992/4-2).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Thyoglycollate Broth 3% Fluka 70157 powder
PFA 4% Electron Microscopy Sciences #157135S 20%
Sudan III staining solution Sigma Aldrich S4131 powder
mouse C57BL/6J Jackson Laboratories Stock # 0006664
mouse ApoE -/- Jackson Laboratories Stock #002052
Western Diet Harlan Laboratories TD.88137
hair clipper WAHL 8786-451A ARCO SE
Forene Abbott Isoflurane
microsurgical clamp Fine Science Tools 18055-04 Micro-Serrefine - 4 mm
clamp applicator Fine Science Tools 18056-14
catheter
10-0 prolene suture Ethicon 788G
6-0 prolene suture Ethicon 8709H
5-0 prolene suture Ethicon EH7229H
Rimadyl Pfizer Carprofen
Metacam 1.5 mg/ml Boehringer Ingelheim Metamizol

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Manuel, D. G., Leung, M., Nguyen, K., Tanuseputro, P., Johansen, H. Burden of cardiovascular disease in Canada. Can J Cardiol. 19, 997-1004 (2003).
  2. ER, O. B., Ma, X., Simard, T., Pourdjabbar, A., Hibbert, B. Pathogenesis of neointima formation following vascular injury. Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets. 11, 30-39 (2011).
  3. Ross, R. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature. 362, 801-809 (1993).
  4. Meng, X., Zhang, F., Valji, K., et al. Ultrasound guidance for the creation of a small animal model of aortic injury. J Vasc Interv Radiol. 22, 1193-1197 (2011).
  5. Deuse, T., Koyanagi, T., Erben, R. G., et al. Sustained inhibition of epsilon protein kinase C inhibits vascular restenosis after balloon injury and stenting. Circulation. 122, 170-178 (2010).
  6. Schrepfer, S., Deuse, T., Sultan, K. R., et al. Inhibition of restenosis development after mechanical injury: a new field of application for malononitrilamides. Cardiology. 108, 128-137 (2007).
  7. Tao, M., Mauro, C. R., Yu, P., et al. A simplified murine intimal hyperplasia model founded on a focal carotid stenosis. Am J Pathol. 182, 277-287 (2013).
  8. Kumar, A., Lindner, V. Remodeling with neointima formation in the mouse carotid artery after cessation of blood flow. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17, 2238-2244 (1997).
  9. Hua, X., Deuse, T., Michelakis, E. D., et al. Human internal mammary artery (IMA) transplantation and stenting: a human model to study the development of in-stent restenosis. J Vis Exp. 3663 (2012).
  10. Daugherty, A., Whitman, S. C. Quantification of atherosclerosis in mice. Methods Mol Biol. (2003).
  11. Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arterioscler Thromb. 14, 133-1340 (1994).
  12. Zhang, Y., Li, L., You, J., Cao, J., Fu, X. Effect of 7-difluoromethyl-5, 4'-dimethoxygenistein on aorta atherosclerosis in hyperlipidemia ApoE(-/-) mice induced by a cholesterol-rich diet. Drug Des Devel Ther. 7, 233-242 (2013).
  13. Rudolph, T. K., Rudolph, V., Edreira, M. M., et al. Nitro-fatty acids reduce atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30, 938-9345 (2010).
  14. Rondelet, B., Kerbaul, F., Motte, S., et al. Bosentan for the prevention of overcirculation-induced experimental pulmonary arterial hypertension. Circulation. 107, 1329-1335 (2003).
  15. Zeibig, S., Li, Z., Wagner, S., et al. Effect of the oxLDL binding protein Fc-CD68 on plaque extension and vulnerability in atherosclerosis. Circ Res. 108, 695-703 (2011).
  16. Painter, T. A. Myointimal hyperplasia: pathogenesis and implications. 2. Animal injury models and mechanical factors. Artificial organs. 15, 103-118 (1991).
  17. Nitschke, Y., Weissen-Plenz, G., Terkeltaub, R., Rutsch, F. Npp1 promotes atherosclerosis in ApoE knockout mice. Journal of cellular and molecular. 15, 2273-2283 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics