쥐에서 동맥 경화 수스 Myointimal 증식을 유도 : 두 개의 유효한 모델의 소개

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Medicine

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Summary

이 동영상은 쥐의 동맥 내막 플라크 개발의 두 가지 모델을 보여주고 myointimal 증식과 죽상 경화증의 차이를 강조한다.

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Stubbendorff, M., Hua, X., Deuse, T., Ali, Z., Reichenspurner, H., Maegdefessel, L., Robbins, R. C., Schrepfer, S. Inducing Myointimal Hyperplasia Versus Atherosclerosis in Mice: An Introduction of Two Valid Models. J. Vis. Exp. (87), e51459, doi:10.3791/51459 (2014).

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Abstract

동맥 협착의 유도에 대한 다양한 생체 실험 쥐 모델은 허혈성 심장 질환, 예를 들어 관찰, 동맥 플라크 형성 및 협착 등의 질병을 모방하기 위해 설립되었다. 두 재현성 마우스 모델 - 두 동맥 협착의 결과로하지만, 각 개발의 다른 경로를 기본는 - 여기에 소개합니다. 모델은 동맥 협착의 가장 일반적인 두 가지 원인을 나타냅니다; 즉 하나의 마우스의 각 myointimal 증식을위한 모델 및 죽상 동맥 경화증이 표시됩니다. myointimal 증식을 유도하기 위해, 복부 대동맥의 풍선 카테터의 부상이 수행된다. 죽상 경화성 플라크의 발달을 위해, 아포 - / - 서부 지방 다이어트와 함께 마우스 모델이 사용된다. 결과의 측정 및 평가를위한 다른 모델 적용 옵션이 원고에 이름과 설명되어 있습니다. 이 두 모델의 도입과 비교 INFORMAT를 제공합니다과학자가 물었다 과학적 질문에 따라 적절한 동맥 협착 모델을 선택하는 이온.

Introduction

산업화 된 국가에서 허혈성 심장 질환 사망률 1의 주요 원인이 남아있다. 관상 동맥 협착에 대한 원인은 매니 폴드이며 가장 일반적인 치료 전략이 잔존 재관류와 myointimal 증식뿐만 아니라 아테롬성 동맥 경화증을 포함한다. 분명히 내막 증식증과 죽상 경화증의 기계적인 경로를 구분 연구 모델은 동맥 플라크 개발 병인 학적 및 병태 생리 학적 과정을 조사하는 것이 필수적이다. 이 비디오에서는 myointimal 증식 또는 죽상 경화증의 개발 중 하나를 연구하는 데 두 개의 서로 다른 마우스 모델을 소개합니다.

Myointimal 증식증 원래 죽상 3에 대해 기재된 "응답 투 부상"패러다임을 통해 형성하는 것이 가정된다. 내피 층의 기계적 중단 주변 분비 효과에 의해 강화 강렬한 리모델링에 이르게한다. 여러 디가 있습니다fferent 동물 모델은 일반적으로 myointimal 증식을 연구하는 데 사용됩니다. 일부 그룹은 쥐 4의 대동맥에서 금속 장치를 사용한다. 풍선 카테터 수행 대동맥 삭박 모델은 또한 일반적으로 실험실 쥐 5,6에서 사용된다. 실험용 쥐 (7)에서 수행 내막 증식증 모델 경동맥의 결찰을 구현하고 myointimal 8 병변을 유도한다. 우리 실험실에서, 복부 대동맥 삭박 모델 -뿐만 아니라 인간 답게 스텐트 재 협착 모델 (9) 일반적으로 사용되는 - myointimal 증식의 개발을 연구한다. 이 비디오는 적절한 실험 동물 모델을 선택하는 것이 동맥 협착의 기계적 또는 병태 생리 학적 연구에 중요한 것을 강조한다.

Myointimal 증식 모델은 동맥 경화 모델을 구별해야합니다. 후자의 경우, 아포 리포 단백질 E가 결핍 (아포 - / -) 서부 다이어트와 함께 마우스는 일반적으로 atheroscl을 유도하는 데 사용됩니다에로틱 병변 10,11,12,13. 생쥐 myointimal 질병의 이러한 유형의 모두의 유도에 대한 예는 혈관 협착 (14)를 분석하기 위해 다른 모델 적응 옵션과 함께 표시되어 있습니다.

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Protocol

모든 동물 연구는 중요한 동물 관리 지침에 따라 수행되어야한다. 이전에 시작 프로토콜 동물 작업 기관의 승인을 얻습니다.

1. Myointimal 증식 모델 (A)

내막 증식증 모델의 경우, C57BL/6J (주문 번호 000664, C57BL/6J) 약 25 g의 무게 팔주 세의 나이에 마우스를 구입할 수 있습니다. 기존의 조건에서 이러한 실험을위한 주택의 마우스; 마우스 표준 마우스 우를 공급하고 임의 량의 물을 제공합니다.

  1. 마우스 준비 : 유도 챔버를 이용한 이소 플루 란 (2 %)와 마취 상태로 마우스를 소개합니다.
    1. 그 뒷면에 마우스를 놓고 마취를 보장하기 위해 안면 마스크로 코와 입을 커버, 머리 트리머를 사용하여 복부의 머리를 제거합니다.
    2. 프로보 - 요오드, 2 사이클에서는 80 % 에탄올이어서 보편적 복부 영역을 소독.
    3. 이 없음을 보증마취의 충분한 깊이를 모니터하기 위해 뒷다리를 곤란에 의한 반사의.
    4. 복부 장기를 노출하는 두 단계로 리네아 알바을 따라 피부와 근육을 분리합니다.
    5. 식염수 보습 장갑에 내장을 놓습니다. 습기를 유지하기 위해 내장 주변의 장갑을 감싸십시오.
    6. 주의 깊게 복부 대동맥 천축 지방 조직을 제거하다. 어떤 지점의 혈관을 손상하지 않도록주의하면서 아래의 분기점에 신동맥 대동맥을 노출합니다.
    7. 첫째, 혈액의 흐름을 차단하기 위해, 근위에 신동맥 대동맥을 미세 수술 클램프를 놓습니다. 이제, 대동맥 분기 옆에 두 번째 원심 클램프를 적용합니다.
    8. 혈액의 흐름이 중단되면, 근위 클램프 부근 대동맥에 작은 절개 부위를 만든다.
    9. 0.9 %의 식염수에 수분 된 풍선 팁 카테터를 삽입하고 대동맥의 말초 클램프를 향해 전진.
    10. 내피 손상의 경우, balloo 팽창하여 대동맥을 발가 벗기다N 신중하고 천천히 근위 클램프의 방향으로 카테터를 당겨.
    11. 두 번 삭박 기동을 반복합니다.
    12. 카테터를 제거하고 10-0 prolene의 실행 봉합사를 이용하여 대동맥 절개를 닫습니다.
    13. 조심스럽게 말초 클램프를 엽니 다. aortotomy 사이트에서 출혈의 경우에는, 필요에 따라, 다시 클램프를 닫 출혈을 찾아 추가 중단 바늘을 배치.
    14. 제공된 출혈이 관찰 될 수있는 경우, 천천히 근위 클램프를 연다.
    15. 대동맥 펄스는 절개에서 원심 볼 수 있어야합니다. 이제 내장은 현장에 다시 배치 될 수있다.
    16. 예열 멸균 식염수를 이용하여 복강을 씻어.
    17. 복부 벽 6-0 prolene의 실행 봉합사를 이용하여 근육 층으로 시작 닫습니다.
    18. 다음 5-0 prolene을 수행하는 실행 봉합사의 사용에 따라 피부를 적응.
    19. 시간 동안 마우스가 여전히 마취, 피하 인제을 통해 4 ~ 5 ㎎ / ㎏ Carprofen을 적용의 ction.
    20. 통증 조절을 위해 마시는 물 (100 ㎖ 당 50 밀리그램의 Metamizol)에 Metamizol를 첨가하고 3 일 수술 후 계속. 복구를 통해 동물을 모니터링합니다.
      참고 :이 모델의 관찰 기간은 28 일입니다.

이. 죽상 경화증 모델 (B)

사주의 나이에 마우스 (주문 번호 002052, B6.129P2-Apoetm1Unc / J), 다음 4-6개월에 공급되는 동맥 경화 모델의 경우, 아포 지단백 E 결핍을 (- - / 아포)를 구입. 기존의 조건에서 이러한 실험을위한 주택의 마우스; 쥐에게 도착시 높은 지질 서부 다이어트 (할렌 연구소 TD.88137)를 공급하고 4~6개월의 기간 동안 임의 량의 물을 제공합니다.

  1. 마우스 준비 :
    1. 아포 피드 - / - 서부 다이어트와 마우스 시대 4 주에서 시작. 식이 조작 도착시 직접 시작해야합니다.
    2. 실험 기간에 걸쳐 서양 식단을 유지한다. </ 리>

3. 분석

  1. Myointimal 증식증 모델 (A)
    이 모델에 대한 관심의 영역은 "병변의 영역"이다. 분석을위한 옵션 내강 말살을 포함, I / M 비율 (내막 / 미디어 비율), 최대 myointima 두께, myointimal 지역, 섬유증에 대한 트리 크롬 염색, 및 단핵 세포에 대한 H & E 염색 (그림 1A-1C에 도시 된 바와 같이). 과학적인 문제에 따라 Picrosirius 콜라겐 빨간색, 면역 조직 화학 염색 및 공 초점 방법 등 많은 다른 염색에 적용 할 수있다.
  2. 죽상 경화증 모델 (B)
    이 모델에 대한 관심의 영역은 대동맥 판막, 대동맥 궁뿐만 아니라 하행 대동맥이다. 분석을위한 옵션 : 수단 빨간 지질에 대한 염색 및 대동맥 판막, 대동맥 궁과 하행 대동맥 (그림 1D에 도시 된 바와 같이)의 트리 크롬 염색.
    이 모델은 또한 같은 다른 염색의 다양한 옵션을 산출중성 지질, Picrosirius 레드, 면역 조직 화학 염색 및 공 초점 방법 예를 들어 오일 레드 O하십시오.
    1. 수단 레드 염색 : 갓 수확 대동맥 조직의 수단 레드 염색을 수행합니다.
      1. 수확하기 전에 다이어트 6H를 제거합니다.
      2. 유도 챔버를 이용한 이소 플루 란 (2 %)와 마취 상태로 마우스를 소개합니다. 마취의 충분한 깊이를 모니터링하는 뒷다리 곤란하여 반사의 부재를 확신한다.
      3. 가슴을 열고; 마음의 정점을 차단하고 대동맥을 해결하기 위해 대동맥 루트를 통해 4 % PFA (3 ㎖) 다음에, 첫 생리 식염수 (3 ㎖), 좌심실을 통해 perfuse.
      4. 그 분기점에 루트에서 대동맥을 확보. 지방 조직에게 가능한 한 많이 제거하려고합니다.
      5. 심장과 대동맥 루트를 차단하고, 조직 검사를위한 4 % PFA에 저장합니다.
      6. 조직학의 경우 대동맥 루트는 신중하게 AOR의 절단을 허용하는 수직으로 파라핀 블록에 배치 할 수있다3 밸브 모양의 전단지를 표시 TIC 루트 생성 슬라이드.
      7. 대동맥 나무의 한쪽 끝을 잘라 미세 핀에 실리콘 층에 고정합니다. 길이 방향으로 대동맥을 열고 대동맥 조직을 고정합니다.
      8. 50 % 에탄올로 조직을 씻어. 약 15 분 동안 수단 III 염색 용액으로 조직을 담가.
      9. 초과 수단 III를 제거하기 위해 50 %의 에탄올로 가볍게 씻어. dH보다 2 O 씻어하고, 추가 분석을 위해 사진을 찍어 ​​(50 % 에탄올이 떨어져 염료를 세척 할 수 있습니다. 참고).

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Representative Results

그림 1은 서로 다른 분석 옵션과 두 모델의 유도 된 질병 상태를 보여줍니다. 내막 증식증 모델의 경우, 트리 크롬 염색 대표적인 단면의 분석이 표시됩니다. 이러한 단면에서, I / M 비율, 최대 플라크 두께, 루멘에서 최대의 내막 두께, 퍼센트 내강 폐색뿐만 아니라 플라크 지역과 같은 결과를 측정하여 계산 될 수있다.

죽상 동맥 경화증 모델의 결과를 평가하기 위해, 위에 언급 된 모든 방법을 사용할 수 있습니다. 또, 복부 대동맥에서 정량적 플라크 영역, 대동맥판, 대동맥 궁과 하행 대동맥에서 플라크 형성의 정도는 트리 크롬 염색을 통해 측정 할 수있다.

그림 1
그림 1. 무 결함 쥐 대동맥 파라핀 임베디드, 수확하고, 대표적인 단면은 트리 크롬 염색 (A)에 도시되어있다. I / M 비는 비율 (B)을 계산 한 다음 컴퓨터 분석을 사용 내막 및 매체의 두께를 측정함으로써 트리 크롬 염색 섹션에서 계산된다. 최대 플라크 두께는 컴퓨터의 형태 학적 (B)에 의해 루멘의 최대 내막 두께로 측정된다. (백분율) 내강의 폐색은 100 %를 곱한 갑 루멘 (C)로 나누어 구 루멘에서 새로운 내부 루멘을 감산함으로써 결정된다. 플라크 영역은 이전 루멘 (C)에서 새 내부 루멘을 차감하여 평가한다. 하행 대동맥은 친 유성 구조를 길이 방향으로 열어 수단 레드는 (D)를 보여 염색. 정량적 플라크 영역을 결정하기 위하여, 수단 레드 염색 병변뿐만 아니라 전체 대동맥 영역은 측정 analy 아르이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 Zed. 파라핀 대동맥 밸브의 내장 샘플, 대동맥 궁, 및 트리 크롬의 하행 대동맥의 크로스 섹션 (E) 그려져있다. 상술 한 바와 같이 내강 말살, 플라크 영역 및 최대 플라크 두께를 계산합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

두 질환은 환자와 유사한 증상을 초래할 있지만, 플라크 개발의 기본 메커니즘에 따라서 치료 방법은 2 매우 다릅니다. 동맥 협착의 다른 형태의 환자에서 임상 연구 결과뿐만 아니라 플라크 개발의 기간은 기본 메커니즘에 따라 달라집니다.

환자의 임상 연구 결과에 따라, 시료 분석의 다른 방법은 5,15를 수행해야합니다. 그것은 선택된 모델 (14)에 의해 모방 될 질병 특성 분석 결과에 적응할 필요가있다. 그 반대의 경우도 마찬가지, 연구되고 질병에 따라, 가장 실현 가능한 적절한 동물 모델을 선택해야합니다. 또한, 신약 기작 모델과 일치해야하는 것이 중요하다.

이 책에 소개 된 두 모델은 빠르게 수행하기 쉽고 재현성이 있습니다. 어떤 엄마가있다모델 사이 조 차이. 죽상 경화성 플라크의 발달이 4-6개월 17 필요한 예를 들어, myointimal 증식 모델에서 관측 시간 이상, 28 일 (16)이다.

또 다른 주요 차이점은 다른 마우스 종자에 적용됩니다. 죽상 동맥 경화증 모델 아포에 의존 - / - 또는 LDL - / - 마우스에서 때문에 이러한 특정 녹아웃 마우스에서 운반을 행할 수있다. / - - 아포 모두 들고 마우스 만들려면 다른 원하는 녹아웃하는 것은 매우 시간이 소요됩니다. 벌룬 손상 수술을 유도 myointimal 증식은 마우스에 수행 될 수있다. / - - 동맥 경화 모델은 아포를 들고 마우스에 엄격한 제한에 직면하면서, 관심 마우스 변형을 수정하는 것이 더 가능성 myointimal 증식 모델 생성합니다.

풍선 발가 벗김의 강도는 myointimal 증식 병변의 결과를 위해 매우 중요합니다. 카테터 손상도 AGG 행하면ressively, 동맥류 형성이 발생할 수 있습니다; 발가 벗김을 너무 부드럽게 수행되는 경우, 플라크 개발 그룹 사이의 차이를 확인하기에 너무 약한 수 있습니다. 한 연구 내의 모든 수술이 같은 사람에 의해 수행하는 경우이 절차에서 도움이됩니다. 와이어와 같은 강성이나 날카로운 장애물의 도입을 필요로하는 다른 기법 향해 벌룬 손상의 이점은 유연성뿐만 아니라 풍선 팁 카테터의 팽창을 통해 풍선의 크기와 압력을 조절하는 옵션이다. 또한 불지 않은 풍선 팁 카테터 얇고 두꺼운, 더 엄격한 삭박 도구에 비해 상대적으로 작은 절개를 통해 대동맥에 삽입 할 수 있습니다. 즉, 병변의 정도에 큰 영향을 미칠 수 있기 때문에 동맥 경화 플라크의 형성 모델의 경우는 마우스의 젊은 나이에 서양 음식을 먹이 시작하는 것이 중요 할 수있다. 모두 도입 모델에 병변이 모두 여성과 남성 생쥐에서 개발 이후, 성별 ADAPTE이 될 수 있습니다실험의 요구 사항을 개발.

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Disclosures

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgments

저자는 기술 지원을 크리스티안 Pahrmann 감사합니다. SS는 독일 Forschungsgemeinschaft (DFG) (SCHR992/3-2 및 SCHR992/4-2)로부터 자금을 받았다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Thyoglycollate Broth 3% Fluka 70157 powder
PFA 4% Electron Microscopy Sciences #157135S 20%
Sudan III staining solution Sigma Aldrich S4131 powder
mouse C57BL/6J Jackson Laboratories Stock # 0006664
mouse ApoE -/- Jackson Laboratories Stock #002052
Western Diet Harlan Laboratories TD.88137
hair clipper WAHL 8786-451A ARCO SE
Forene Abbott Isoflurane
microsurgical clamp Fine Science Tools 18055-04 Micro-Serrefine - 4 mm
clamp applicator Fine Science Tools 18056-14
catheter
10-0 prolene suture Ethicon 788G
6-0 prolene suture Ethicon 8709H
5-0 prolene suture Ethicon EH7229H
Rimadyl Pfizer Carprofen
Metacam 1.5 mg/ml Boehringer Ingelheim Metamizol

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References

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