البرد الإلكترون المجهري عينة التحضير عن طريق المركزة ايون شعاع

Biology
 

Summary

البرد المجاهر الإلكترونية، إما الضوئي (SEM) أو ناقل الحركة (TEM)، وتستخدم على نطاق واسع لتوصيف العينات البيولوجية أو غيرها من المواد ذات المحتوى ارتفاع المياه 1. ويستخدم SEM / المركزة ايون الشعاع (فيبوناتشي) لتحديد ملامح الاهتمام العينات واستخراج، الإلكترون شفافة رقيقة لنقل الصفيحة إلى البرد TEM.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Rubino, S., Melin, P., Spellward, P., Leifer, K. Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam. J. Vis. Exp. (89), e51463, doi:10.3791/51463 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

هنا نقدم بروتوكول يستخدم لتحضير عينات البرد تيم الجراثيم الرشاشيات النيجر، ولكن التي يمكن بسهولة أن تتكيف لأي عدد من الكائنات الدقيقة أو الحلول. نحن الاستفادة من محطة البرد نقل مخصصة بنيت وتعديل البرد SEM إعداد غرفة 2. تؤخذ الجراثيم من ثقافة، يغرق مجمدة في النيتروجين السائل وطين لوحظ في البرد ووزارة شؤون المرأة لتحديد المنطقة ذات الاهتمام. ثم يتم استخراج الصفيحة رقيقة باستخدام الاكذوبه، تعلق على الشبكة TEM وبالتالي ضعفت إلى الإلكترون الشفافية. يتم نقل الشبكة لحامل البرد تيم والى تيم لدراسات عالية الدقة. بفضل إدخال تلميح nanomanipulator تبريد ومحطة نقل البرد، وهذا البروتوكول هو التكيف واضحة لدرجة الحرارة المبردة من إعداد الاكذوبه تستخدم بشكل روتيني لعينات TEM. على هذا النحو لديها مزايا التي تتطلب كمية صغيرة من التعديلات على الصكوك، والاجهزة والإجراءات القائمة؛ طمن السهل لتنفيذ؛ انها لديها مجموعة واسعة من التطبيقات، من حيث المبدأ نفس لإعداد عينة البرد TEM. القيد واحد هو أنه يتطلب معالجة ماهرا من العينات في الخطوات الحاسمة لتجنب أو تقليل التلوث.

Introduction

في هذا البروتوكول يستخدم cryo-FIB/SEM لإنتاج عينات TEM من منطقة محددة من العينة، التي سبق تحديدها بدقة عالية من خلال تحليل ووزارة شؤون المرأة. الإلكترون المجهري (مسح أو نقل) تحليل العينات البيولوجية هي تقنية روتينية تستخدم لأغراض البحث والتشخيص. SEM سريع نوعا ما، وسهلة لاستخدام وتفسير، ولكن يتم الحصول على المعلومات فقط من سطح العينة ومع قرار في نطاق 1.5 نانومتر. تيم لديه دقة أعلى ولكن هو أكثر صعوبة لتنفيذ وتحليل الصور هو أقل وضوحا وحين يتم الحصول على المعلومات بكميات كبيرة، والعينات يجب أن تكون ضعيفة إلى الإلكترون الشفافية (أقل من 500 نانومتر حوالي سميكة). مشكلة إضافية هي أن متطلبات الفراغ من تلك الصكوك نادرا ما يتم التغاضي عن طريق العينات التي تحتوي على الماء. في معظم الحالات، والعينات البيولوجية يجب أن تكون إما ثابتة كيميائيا (استبدال المياه، على سبيل المثال، والبوليمرات) أو المجففة. في كلتا الحالتين، تغييرات كبيرة فيمورفولوجيا وهيكل العينة من المحتمل أن تحدث. إعداد البرد تيم العينات المائية يؤدي الى تغييرات كيميائية الحد الأدنى، وأنها تنتج عينات أقرب وقت ممكن إلى حالتها الأصلية، وخاصة إذا تم الحصول التزجيج من الجليد 1-6.

ويستخدم على نطاق واسع الاكذوبه لإعداد عينات تيم للمزايا العديدة 7. على سبيل المثال لا الحصر: استخدام الأيونات ذات الطاقة العالية في حدوث شبه طبيعية يقلل من تأثير أسعار الطحن التفاضلية المتعلقة المادية؛ المنطقة المستخرجة من العينة الأكبر يمكن اختيار بدقة ميكرون الفرعية؛ يتم استخراج كمية صغيرة جدا من المواد. جعلت بعض التطورات التقنية الأخيرة الممكن استخدام الاكذوبه أيضا لإعداد عينة تيم في درجات الحرارة المبردة 2،8-10. وهناك العديد من المزايا على طريقة إعداد التقليدية من البرد استشراح 11،12 تستخدم أساسا لعينات المسألة لينة، مثل عدم وجود تشوه الميكانيكية من الصفيحة شرائح،غياب علامات سكين وإمكانية إعداد عينات مركب مع واجهات الثابت / لينة أو المكونات.

Protocol

ملاحظة: جميع المعلمات الواردة في هذا البروتوكول صالحة للصكوك ونماذج وأشار هنا. بعض تلك المعلمات (تميزت * في النص) قد تختلف إذا تم استخدام منتج أو نموذج آخر.

1. البدء من الاكذوبه / SEM

  1. تحميل مبنية خصيصا nanomanipulator الباردة (نيو مكسيكو) طرف دون ربط الضفائر النحاس إلى anticontaminator (AC). بدلا من ذلك تأكد من توصيل الضفائر لبقية NM فوق نقطة العزل لمنع تهمة تصل خلال الخطوة شحذ (1.2).
    1. إغلاق الغرفة ووزارة شؤون المرأة، إلى ضخ فراغ عالية وصورة غيض NM.
    2. إذا غيض هو حادة، عازمة أو ملوثة عن طريق استخدام السابقة، شحذ من قبل وسائل شعاع ايون: تحديد أنماط متعددة الأضلاع طحن على طول جانبي الحافة، وذلك بعد الطحن، وسوف غيض تفتق وصولا الى 1 ميكرون أو أقل.
    3. مرة واحدة تم المضروب على جانبي طرف بعيدا، وتناوب يدويا بنسبة 90 درجة قضيب NM كاملمن خارج الغرفة ووزارة شؤون المرأة.
    4. ضبط أنماط الطحن المضلعة على التكيف مع الطرف استدارة وتكرار طحن من زاوية مختلفة.
  2. مرة واحدة وقد تم شحذ طرف لتكون أقل من 1 ميكرون، التراجع عن NM وادخال الإبرة من نظام حقن الغاز (GIS)؛ إعادة الإبرة ليكون في حوالي 1 مم فوق مسافة العمل (بدلا من المعتاد 175 ميكرون).
  3. في حالة استخدام السلائف حزب العمال، وتغيير درجة حرارة التشغيل إلى 24-26 درجة مئوية (بدلا من المعتاد 40 درجة مئوية). وهناك حاجة إلى هذه الخطوات البرد ترسب 13 من حزب العمال.
  4. فتح الغرفة ووزارة شؤون المرأة وإعداد الاكذوبه / SEM لالبرد الوضع عن طريق تركيب المرحلة عينة البرد وAC.
  5. تبديل NM إلى موقف إدراج وربط الضفائر النحاس تجاه AC. تأكد من عدم لمس بطريق الخطأ غيض NM. يتم تبريد النظام مع NM إدراج للتأكد من أن فقدان مرونة جديلة النحاس في درجات الحرارة المبردة لن تعوق التحرك NMمنة.
  6. تطهير أنابيب للتبريد مع غاز النيتروجين الجاف لبضع دقائق.
  7. ضخ إعداد غرفة البرد والعينة الغرفة الرئيسية لارتفاع فراغ.
  8. إضافة النيتروجين السائل إلى دوار لتبريد كلا المجلسين. الانتظار حتى يتم الوصول إلى درجة الحرارة المطلوبة.

2. تجميد عينة

    1. جبل اثنين من شبكات تيم للعينات الاكذوبه على حامل نقل SEM. تأمينها من خلال تشديد الخناق المقابلة مع مفك البراغي.
    2. جبل كعب المناسبة لعينة العينة وإضافة جزء من العينة. اعتمادا على نوع العينة، والعينة يمكن ان تكون ثابتة مع الغراء المبردة أو مع المشبك. استخدام كميات صغيرة قدر الإمكان لضمان تجميد الأمثل.
    3. جبل حامل نقل SEM على الجهاز نقل فراغ (VTD).
    1. إضافة النيتروجين السائل في محطة ضخ slushing وصولا الى الحصول على طين النيتروجين.
    2. فتح SLمحطة ushing ويغرق-تجميد حامل نقل SEM. ضخ أسفل مرة أخرى حتى يتم الانتهاء من الغليان ويتم الحصول على طين مرة أخرى. تجدر الإشارة إلى أن الإيثان أو البروبان طين أو ارتفاع ضغط تجميد تقنيات أكثر ملاءمة للحصول على التزجيج من العينة.
    1. التراجع عن نقل حامل SEM في فراغ الغرفة من VTD وختم عليها.
    2. تنفيس محطة slushing والبرد إعداد غرفة غرفة معادلة الضغط.
    3. تطابق ختم VTD مع غرفة معادلة الضغط من إعداد غرفة البرد والمضخة.
    4. عندما وصلت إلى مستوى الفراغ جيدة، والانخراط دبوس القفل لفتح ختم VTD وغرفة معادلة الضغط الخارجي؛ إدراج حامل نقل SEM. هناك علامات على الاتصالات انزلاق في غرف إعداد يدل على موقف عينة عن طريق الرش والتكسير.
  1. إذا لزم الأمر، يمكن العينة: بكسر بالسكين الباردة؛ المتسامي عن طريق تحديد درجة حرارة أعلى (عادة -1006؛ C)؛ المغلفة مع الاتحاد الافريقي / المشتريات أو حزب العمال عن طريق الباصق الباردة (300 V، 10 أمبير، 60 ثانية ل2-3 نانومتر الاتحاد الافريقي / المشتريات الحد الأقصى) *. لا ينبغي أن تستخدم التسامي لعينات المزجج لتجنب التبلور بهم.
    1. استخدام سكين الباردة لفتح الأغطية الواقية من تيم فتحات الشبكة.
    2. جلب المرحلة الباردة في حجرة العينة إلى ارتفاع الاستقبال (16 ملم *).
    3. إيقاف تشغيل HT على الاكذوبه / SEM وفتح كوة الداخلية.
    4. استخدام VTD لنقل حامل SEM في حجرة العينة. يعتم الإضاءة في الغرفة يمكن أن تساعد في هذه الخطوة.
    5. مرة واحدة حامل ووزارة شؤون المرأة في المرحلة الباردة، فك الارتباط بين تلك VTD عن طريق دفع والدورية.
    6. سحب قضيب VTD كل وسيلة في فراغ الغرفة VTD وإغلاق غرفة معادلة الضغط الداخلي، وغرفة معادلة الضغط الخارجي وختم VTD. ويمكن الآن تنفيس غرفة معادلة الضغط الخارجي لإزالة الختم VTD. ليس مطلوبا هذه الخطوة الأخيرة، ولكن من المستحسن كما قضيب VTD يمكن فكها بسهولة عن طريق الصدفة، والتي قد تسبب الضررإلى VTD أو غرفة معادلة الضغط.

3. ايون طحن

  1. بدوره على التوتر الشديد على كل من أعمدة وتعيين المعلمات التصوير المناسبة (تسريع الجهد: 10 كيلو فولت للشعاع الالكترون، 30 كيلو فولت للشعاع الأيوني، وحجم البقعة: 3؛ العمل عن بعد: 5 مم، شعاع ايون الحالية: 10-100 السلطة الفلسطينية للتصوير، 1-3 غ لطحن) *.
  2. استخدام شعاع الالكترون لإيجاد سمة من سمات الفائدة والحصول على صور لتوثيق حالة العينة قبل استخراج الصفيحة.
  3. مرة واحدة وقد تم تحديد المنطقة ذات الاهتمام (ROI) لاستخراج ووضع علامة عليه بواسطة شعاع ايون الزخرفة، ما لم تضاريس العينة نفسها يسمح لسهولة تحديد العائد على الاستثمار حتى بعد ترسب حزب العمال. لزيادة الدقة، واستخدام طريقة وصفها بيترسون وآخرون 14 وينبغي أن تكون علامات عميقة، واسعة وبعيدة بما يكفي لتكون تزال واضحة بعد أن تغطيها ترسب البرد حزب العمال (والذي هو غير SEL-ective وسوف تغطي عدة ملم 2 من سطح العينة).
  4. تسخين الغاز تمهيدا ل24-26 درجة مئوية، وادخال الإبرة نظم المعلومات الجغرافية لارتفاع حوالي 1 مم فوق سطح العينة (انظر أيضا الخطوة 1.3).
  5. في حين التصوير مع شعاع الالكترون، افتح صمام الغاز لبضع ثوان. معدل ترسب حزب العمال البرد هو 100-500 نانومتر / ثانية أو أكثر، اعتمادا على المسافة من الإبرة نظم المعلومات الجغرافية، وعينة خشونة ونظام المستخدم. فإنه من المستحسن لتشغيل عدد قليل من ترسبات اختبار لتحديد المعلمات الأمثل.
  6. والبرد حزب العمال الخام ترسب صعبة للغاية وغير متجانسة. علاج إيداع أكثر من العائد على الاستثمار باستخدام شعاع ايون 1،000 السلطة الفلسطينية في التكبير المنخفض (على سبيل المثال 2،000 X). خلافا لترسب البرد، وهذا هو علاج موقع انتقائية ويجب أن يتم تنفيذ على العائد على الاستثمار فقط. الغرض من هذا أولا البرد ترسب هو حماية سطح العينة من التلف وشعاع ايون للحد بالستائر خلال أيون ترقق 13.
  7. إمالة العينة إلى52 ° بحيث سطح عمودي على شعاع أيون. مطحنة بعيدا اثنين الخنادق المدرجات على جانبي العائد على الاستثمار. أبعاد نموذجية لالخنادق هي 20-30 ميكرومتر في الاتجاه (X) موازية لاميلا ليكون استخراجه، 10-15 ميكرومتر في اتجاه عمودي (Y) مع وجود متغير، المنحدرة العمق (Z)، مع أعمق نقطة إغلاق إلى العائد على الاستثمار. وينبغي أن يكون المنحدر 45-55 درجة. في بعض الصكوك والخنادق المدرجات لا يمكن إلا أن المضروب مع أعمق نقطة على القمة. في مثل هذه الحالة، مطحنة واحدة تحت العائد على الاستثمار، ثم تدوير الصورة 180 درجة ومطحنة ثانية واحدة على الجانب الآخر. يمكن تحديد عمق الطحن إذا كان معدل تفل من المواد هو معروف. بالنسبة لمعظم العينة المجمدة رطب، فإن معدل تفل من الثلج ويمكن استخدام 7.
  8. إمالة العينة إلى 0 درجة و استخدام شعاع أيون لخفض بعيدا الجانبين والسفلي من الصفيحة، والتأكد من علامات قطع تذهب من خلال الصفيحة بأكمله (عليهم ترك علامات على طحن مطحنة منحدرات المدرجاتإد في الخطوة السابقة). ترك اثنين فقط من الجسور الصغيرة التي تربط الصفيحة إلى بقية العينة.
  9. ادخال الإبرة نظم المعلومات الجغرافية (هذا قد تحول قليلا العينة). المناورة NM حتى طرفها في اتصال جسدي مع لاميلا، ويفضل على الجانب. تأكد من NM لا حجبت الرؤية أيون شعاع من اثنين من الجسور التي تربط الصغيرة.
    1. فتح صمام نظم المعلومات الجغرافية لبضع ثوان ورصد ترسب بالتبريد عن طريق التصوير المستمر مع شعاع الالكترون.
    2. عندما كانت طبقة إضافية 1-2 ميكرون من حزب العمال البرد المودعة، وإغلاق صمام.
    3. علاج حزب العمال (انظر الخطوة 2.6) فقط في عدد قليل من ميكرون حول نقطة حيث NM على اتصال مع الصفيحة.
    4. استخدام عالية شعاع ايون الحالية لخفض الصفيحة الحرة. وينبغي المضروب على جسرين ربط بعيدا، فضلا عن أي فائض من حزب العمال قد شكلت نقطة اتصال جديدة بين الصفيحة وبقية العينة. لا سحب الإبرة GIS حتى الآن.
    مناورة بعناية NM لاستخراج الصفيحة من الخنادق وتحريكه لا يقل عن 500 ميكرون فوق سطح العينة. فقط بعد هذه الخطوة، سحب الإبرة نظم المعلومات الجغرافية.
  10. خفض مرحلة عينة قليلة مم وتحريكه حتى واحدة من شبكات TEM في طريقة العرض. نقل منطقة المرفق على الشبكة في موقع العمل وادخال الإبرة نظم المعلومات الجغرافية.
    1. مناورة بعناية NM لجعل الصفيحة المرفقة في اتصال جسدي مع منطقة المرفق على الشبكة TEM. ينبغي أن يكون هناك أي ضغط أو توتر بين الصفيحة، الشبكة TEM وNM.
    2. فتح صمام الغاز لبضع ثوان والبرد إيداع طبقة إضافية 1-2 ميكرون من حزب العمال.
    3. علاج حزب العمال (انظر الخطوة 2.6) فقط في عدد قليل من ميكرون حول نقطة الاتصال بين الصفيحة والشبكة TEM.
  11. استخدام عالية شعاع ايون الحالية لخفض الصفيحة خالية من شمال البحر الأبيض المتوسط. وهذا يمكن أن يتحقق عن طريق طحن بعيدا إما غيض NM أو الجانب من العينة. في رانه الحالة الأولى، سوف غيض يجب شحذ مرة أخرى قبل استخدام المقبل، كما هو موضح في الخطوة 1.2.
  12. اختياري: في هذه المرحلة فمن الممكن استخدام VTD لاتخاذ حامل نقل SEM وتخزينه O / N في ديوار مليئة النيتروجين السائل. هذا النقل وO / N التخزين من المرجح أن يسبب تشكيل الجليد على سطح الصفيحة إذا بلورات الثلج موجودة بالفعل و / أو إذا تعرضت النيتروجين السائل إلى الهواء الرطبة؛ ولكن سيتم إزالة هذا التلوث عن طريق الخطوة التالية في فترة زمنية قصيرة نسبيا. كما الخطوات السابقة قد اتخذت عدة ساعات لإكمال، فإنه قد يكون من المناسب للقيام بذلك، لأن الخطوة التالية بعد لا ينصح مثل تخزين O / N، كما لن يكون هناك أي وسيلة لإزالة التلوث الجليد إلا التسامي (التي لا يمكن أن يؤديها إذا التزجيج من العينة أن تستمر).
  13. إمالة العينة إلى 52 درجة و استخدام شعاع أيون رقيقة إلى الإلكترون الشفافية 7. فمن المستحسن أن تبدأ مع أعلى، روجالتيارات شعاع لها لإزالة الجزء الأكبر والمضي قدما إلى غرامة تلميع السطح مع انخفاض التيارات شعاع، في نهاية المطاف أيضا تقليل الجهد المتسارع. يجب أن يكون سمك الصفيحة النهائية لل100-200 نانومتر أو أقل لتحليل التركيب الدقيق في 100-200 كيلو فولت TEM أو ما يصل إلى 500 نانومتر لالمقطعي في 300 كيلو فولت TEM، اعتمادا على تكوين العينة. خلال رقيق، قد يسبب الضغوط الداخلية من العينة الصفيحة لتجعيد أو الانحناء. في مثل هذه الحالة، ينبغي أن يقتصر على المنطقة ضعيفة. حدث هذا على سبيل المثال في أرقام 11 و 12.

4. نقل كرو لTEM

    1. مسح محطة نقل البرد مع غاز النيتروجين الجاف لبضع دقائق.
    2. إضافة إلى النيتروجين السائل ديوار من تيم AC وإلى محطة نقل البرد.
    3. إدراج حامل تيم البرد نقل في الفتحة المناسبة للمحطة البرد نقل وملء ديوار كذلك. الانتظار حتى كل شركاتonent قد وصل إلى درجة الحرارة المطلوبة (حوالي 15 دقيقة). إذا كان ذلك ممكنا، يجب أن تكون متصلا وحدة تحكم لصاحب تيم البرد نقل لمراقبة درجة الحرارة أثناء النقل. من المهم أن ندرك أن غيض من حامل TEM (حيث يقع استشعار درجة الحرارة) سوف تكون على اتصال مع محطة نقل البرد، وبالتالي سوف يبرد أسرع بكثير من بقية حامل TEM. لذا فمن المستحسن أن الوقت اللازم لنقل البرد كله حامل تيم لتهدئة يقاس مسبقا، والتي يسمح النظام لthermalize على الأقل هذا المبلغ من الزمن.
    4. ملء كوب المبردة مع النتروجين السائل وتزج فيه: أداة تيم عينة لقط، مفك وملاقط، من أجل تهدئة نصائح لدرجة الحرارة المطلوبة. جميع الأدوات يجب أن تكون معزولة بشكل صحيح على الطرف الآخر حتى لا يسبب حروقا البارد لجهة المشغل.
  1. تطابق VTD إلى غرفة معادلة الضغط الخارجي. جلب الأيل الباردةه إلى ذروة نقل (16 ملم *). إيقاف التوتر الشديد.
    1. فتح الختم VTD، غرفة معادلة الضغط الخارجي وغرفة معادلة الضغط الداخلي.
    2. استخدام قضيب VTD لقفل إلى حامل نقل SEM عن طريق دفع وتناوب في اتجاه عقارب الساعة.
    3. التراجع عن نقل حامل SEM في غرفة إعداد البرد.
    4. استخدام سكين بارد لإغلاق الأغطية الواقية من شبكات TEM. وهذا أمر ضروري للحد من التلوث الجليد ممكن أثناء نقل.
    5. استخدام قضيب VTD لنقل العينة إلى فراغ الغرفة من VTD.
    6. إغلاق غرف الهواء المضغوط والختم.
  2. تنفيس غرفة معادلة الضغط الخارجي وفصل VTD. تطابق VTD إلى ميناء SEM من محطة نقل البرد. بينما بيغ مع النيتروجين الجاف، استخدم دبوس على محطة لفتح ختم VTD وحرك حامل نقل SEM في ديوار من محطة نقل البرد.
    1. إضافة ما يكفي من النيتروجين السائل لذلك أن مستوى في محطة البرد نقل عالية بما فيه الكفايةلمجرد غمر العينة.
    2. استخدام مفك تبريد سابقا لفتح واحد من الأغطية وتخفيف المسمار المقابلة التي يتم الحفاظ على شبكة TEM في المكان.
    3. استخدام ملاقط تبريد سابقا لاختيار الشبكة TEM ووضعه في حامل TEM.
    4. استخدام hexring تبريد لربط الشبكة TEM على حامل TEM.
    5. إغلاق مصراع من صاحب تيم البرد النقل. الخطوة نقل عينة أمر بالغ الأهمية ويمكن أن يعوقها غاز النيتروجين والحد من الرؤية من العينة TEM الصغيرة.
    6. فصل البرد محطة التحويل من نظام الضخ ونقله بالقرب من TEM، جنبا إلى جنب مع وحدة تحكم سخان صاحب تيم البرد النقل.
    7. بدء ضخ turbomolecular من تيم ضخ خط الدعم لغرفة معادلة الضغط TEM.
    8. تعيين المرحلة العينة TEM إلى الميل * من -70 درجة.
    9. تعيين أقصر وقت الضخ لغرفة معادلة الضغط (30-60 ثانية)، مع دورة واحدة فقط من تطهير بغاز النيتروجين الجاف.
    10. تأكد من أن مصراع واقية على حامل تيم البرد نقل مغلقة. إزالة حامل TEM من محطة نقل البرد وأدخله في مقياس الزوايا يميل (النيتروجين السائل سوف تمتد من صاحب تيم ديوار). ستبدأ دورة الضخ. بمجرد الانتهاء من الدورة، تعيين مقياس الزوايا لإمالة إلى 0 درجة و، في الوقت نفسه، عقد صاحب تيم بحيث لا تدور مع مقياس الزوايا. أدخله بالكامل داخل TEM. خلال هذه الخطوة، يجب أن تكون متصلا صاحب تيم البرد نقل إلى وحدة تحكم سخان لرصد درجة الحرارة. الإجراء لإدراج صاحب العينة في TEM قد تختلف بين إحساس الغانيين مختلفة. لذا فمن المستحسن الاتصال بالشركة المصنعة للحصول على TEM الإجراء المناسب.
    11. إعادة ملء البرد نقل صاحب تيم ديوار. انتظر الفراغ في TEM للوصول إلى مستوى مقبول.

Representative Results

في هذا العمل الذي نقوم استفادت من: شعاع المزدوج الاكذوبه / SEM مجهزة nanomanipulator وغرفة البرد إعداد؛ وTEM مع حامل البرد نقل؛ محطة البرد نقل النموذج. تم تعديل anticontaminator (AC) شفرات للغرفة البرد إعداد وغيض من nanomanipulator (NM) بواسطة قطان. فيما يتعلق غرفة البرد إعداد القياسية، ريش AC أكبر لتوفير أكبر بالوعة الحرارة لأجل الطرف NM. علاوة على ذلك، تم تزويد AC مع المشابك لربط الضفائر النحاس لتبادل الحرارة مع طرف NM. تم تعديل الخصائص الميكانيكية للالاكذوبه / SEM للسماح للNM أن تكون وتبقى حتى عندما تم إدراج تنفيس حجرة العينة. تجدر الإشارة إلى أن المعايير المستخدمة في هذا العمل هي الأنسب للمعدات المذكورة أعلاه؛ قد يحتاج هؤلاء المعلمات إلى تعديلها عند العمل مع أنواع أخرى من المعدات. للعمل مع هذا البروتوكول، والاحتياطات العادية لمعالجة فيزياء درجات الحرارة المتدنية، ينبغي أنظمة النيتروجين السائل والفراغينبغي اتباعها.

وقد تم اختبار هذه الطريقة على أنواع مختلفة من العينات مع نتائج جيدة، بدءا من حلول أو المصفوفات تحتوي على جزيئات البوليمر، لكائن حي وحيد الخلية إلى الديدان الخيطية. ويوضح أمثلة على الخطوات المختلفة للإجراء في أرقام 1-12 على A. جراثيم النيجر ملطخة رباعي أكسيد الأوزميوم وبرمنجنات البوتاسيوم. يتم تصوير الجراثيم أول مرة من قبل وزارة شؤون المرأة (الشكل 1) لتحديد موقع لاستخراج. في هذه الحالة، كان قطاع عريض من أي بوغ كافية، ولكن من الممكن لوضع العائد على الاستثمار لاستخراج بدقة ميكرومتر الفرعية، على سبيل المثال، شريحة خلية معينة على مسافة محددة من غشاء الخلية. مرة واحدة وقد تم التعرف على سمة من الفائدة، يتم تنفيذ الخطوة الأولى من ترسب البرد حزب العمال (الشكل 2)، لحماية عينة من الضرر شعاع من الطحن أيون. إمالة العينة إلى 52 درجة على المضي قدما في الخطوات الأولى سو طحن (الشكل 3): والاخرق من اثنين من الخنادق على جانبي الصفيحة. ثم إمالة العينة ذهابا والمضروب لمغادرة اثنين فقط من الجسور الصغيرة توصيله إلى الجزء الأكبر (الشكل 4) أخرى. يتم جلب nanomanipulator تبريد في اتصال مع الصفيحة (الشكل 5)، وأخرى البرد ترسب حزب العمال الجنود بعضهم البعض (الشكل 6). ثم يتم طحنها الجسور التي تربط صغيرة بعيدا وNM يتحرك الصفيحة بالقرب من منطقة الحجز على الشبكة TEM (الشكل 7)، حيث يتم ملحوم ذلك مع النهائي البرد ترسب حزب العمال (الشكل 8). ثم يتم فصل NM من الصفيحة (الشكل 9)، والتي ضعفت وصولا الى الإلكترون الشفافية مع شعاع ايون (الشكل 10 و 11). يتم نقل الصفيحة في النهاية إلى تيم (الشكل 12) حيث عالية الدقة والتصوير، والتحليل الطيفي، والتصوير المقطعي وغيرها من التقنيات كاليفورنيان استخدامها.

الشكل 1
الشكل 1. البرد SEM صورة أبواغ A. النيجر، قبل أن ترسب حزب العمال.

الرقم 2
الشكل 2. نفس المنطقة في الشكل 1 بعد ترسب حزب العمال ولكن قبل علاج.

الرقم 3
الشكل 3. صورة البرد ووزارة شؤون المرأة من نفس المنطقة في الشكل 2، يميل 52 درجة، وبعد ترسب حزب العمال وعلاج، مع خندق الطحن جارية(انظر الخطوة 3.7).

الرقم 4
الشكل 4. والصفيحة، وعلى استعداد لرفع إجراءات المغادرة.

الرقم 5
الرقم 5. غيض nanomanipulator البارد يجعل الاتصال مع الصفيحة.

الرقم 6
الرقم 6. ويستخدم حزب العمال الثاني البرد ترسب لحام معا nanomanipulator والصفيحة.

بديل ملغ = "الرقم 7" FO: محتوى العرض = "5IN" FO: SRC = "/ files/ftp_upload/51463/51463fig7highres.jpg" سرك = "/ files/ftp_upload/51463/51463fig7.jpg" />
الرقم 7. يستخدم nanomanipulator الباردة لنقل الصفيحة إلى منطقة المرفق من الشبكة TEM.

الرقم 8
يستخدم الرقم 8. البرد ترسب مرة أخرى لإرفاق الصفيحة إلى الشبكة TEM.

الرقم 9
الرقم 9. هو قطع الصفيحة خالية من nanomanipulator وهي الآن جاهزة للتخزين إما أو رقيق لإلكترون الشفافية.

ضمن صفحة = "دائما"> الرقم 10
الرقم 10. خطوة وسيطة للرقيق، مع عدد قليل من الجراثيم واضحة في المقطع العرضي.

الرقم 11
الرقم 11 صورة البرد SEM من العينة بعد ترقق النهائي؛ معظم جراثيم أخرى كان لا بد من المضروب بعيدا لأن الصفيحة قد بدأت لتجعيد.

الرقم 12
الرقم 12 ألف مركب الصورة البرد تيم الصفيحة. وقد أدرج جزء من كعب آلفي الصفيحة (السهم الأسود).

Discussion

هذا البروتوكول هو التكيف واضحة إلى حد ما من درجات الحرارة المبردة معيار إعداد العينات الاكذوبه / تيم المستخدمة في العلوم المادية في RT. تنتج طريقة TEM عينات مجانية من تشوه الميكانيكية وعلامات سكين (العيب الرئيسي من استشراح)، رغم أنه قد تحدث إذا بالستائر سطح العينة غير متجانسة. هذا يمكن الحد من البرد ترسب طبقة السد (في هذا العمل كان يستخدم حزب العمال)، حتى شفي على نحو سلس وملامح 13. العينات مع مكونات صلابة مختلفة جدا يمكن أن تكون على استعداد كذلك دون التعرض لخطر بأنهم كسر تحت الضغط أثناء التحضير. الضغوط الداخلية قد لا تزال تسبب الصفيحة رقيقة لثني أو حليقة، وفي هذه الحالة حجم القسم لابد من تخفيضها. والعيب مقارنة مع الأسلوب الآخر هو إمكانية تغيير هيكل البيولوجية بسبب التعرض لشعاع ايون وزرع ممكن من الأيونات في العينة. تحدث هذه العيوب أيضا على RT لعينة preparأوجه في علوم المواد 15. ويمكن تخفيضها من خلال استكمال رقيق مع خطوة تلميع النهائي بأقل الجهد لتسريع الأيونات (500-1،000 V). وهذه الخطوة تلميع لطيف جدا إزالة الطبقة التالفة من الصفيحة.

ويرجع ذلك إلى طبيعة البرد ترسب (الخطوات 3.5، 3.10 و 3.13)، وسيتم تغطية أجزاء كبيرة من العينة، وبالتالي حجبت الرؤية من السطح الأصلي. هذا قد يجعل من الصعب تعقب عائدات الاستثمار، ما لم تستخدم علامات متعددة كما اقترح في الخطوة 3.3.

خلال الخطوات 4.5 و 4.7 المخاطر الصفيحة رقيقة القادمة في اتصال مع الهواء. هذه لابد من تجنبها لأنها من شأنها أن تسبب الرطوبة في الهواء لتشكيل بلورات الثلج على سطح العينة، وربما إلى حد حجب الميزات الهامة. يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوات في أسرع وقت ممكن، ولكن في نفس الوقت لسوء أثناء نقل من المرجح أن يؤدي إلى فقدان العينة أنهالنفس. فمن المستحسن أن المستخدم يمارس تلك الخطوات باستخدام شبكات تيم فارغة قبل إجراء محاولة على عينة حقيقية.

في العلوم المادية، وأصبحت أداة الاكذوبه الأسلوب رئيس TEM عينة إعداد في غضون عشر سنوات من تسويقها. نظرا لأنه يمكن استخدامها على أي تقريبا العينة، فإنه يزيل الحاجة إلى تكييف هذه التقنية لإعداد نوع العينة. ونحن نعتقد بقوة نفسه يمكن أن يحدث في درجات الحرارة المبردة، وذلك بفضل الإجراءات المفصلة هنا. تطبيقه على عينات أكبر لا تزال خاضعة للالقدرة على البرد الحفاظ عليها في حالة المزجج، ولكن يمكن تقنيات مثل يغرق تجميد أو الضغط العالي تجميد 3،5 يثبت أن الحلول الأمثل لهذه المشكلة.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

تلقى هذا البحث بدعم من مشروع QNano http://www.qnano-ri.eu التي يتم تمويلها من قبل البنية التحتية للبحوث الجماعة الأوروبية في إطار برنامج FP7 القدرات (منحة رقم INFRA-2010-262163).

كما نشكر مجلس البحوث FORMAS للحصول على الدعم المالي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Strata DB 235 FEI FIB/SEM
Omniprobe 100 Oxford Instruments Nanomanipulator
Alto 2500 Gatan Cryo preparation chamber
Cryo-holder model 626 Gatan Cryo transfer TEM holder
Tecnai F30 FEI TEM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Echlin, P. Low Temperature Microscopy and Analysis. Plenum Press. New York. (1992).
  2. Rubino, S., et al. A site-specific focused-ion-beam lift-out method for cryo Transmission Electron Microscopy. J. Struct. Biol. 180, 572 (2012).
  3. Studer, D., et al. A new approach for cryofixation by high-pressure freezing. J. Microsc. 203, 285 (2001).
  4. Umrath, W. Cooling bath for rapid freezing in electron microscopy. J. Microsc. 101, 103 (1974).
  5. Walther, P. Recent progress in freeze-fracturing of high-pressure frozen samples. J. Microsc. 212, 34 (2003).
  6. Elder, H. Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography. Cryo fixation. Techniques in Immunocytochemistry. Academic Press. London. (1989).
  7. Giannuzzi, L. A., Stevie, F. A. Introduction to Focused Ion Beams. Springer. New York. (2005).
  8. Marko, M., et al. Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryoelectron microscopy. Nat. Methods. 4, 215 (2007).
  9. Hayles, M. F., et al. The making of frozen-hydrated, vitreous lamellas from cells for cryo-electron microscopy. J. Struct. Biol. 172, 180 (2010).
  10. Rigort, A. Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography. J. Struct. Biol. 109, 4449-44 (2012).
  11. Hsieh, C., et al. Towards high-resolution three-dimensional imaging of native mammalian tissue: electron tomography of frozen-hydrated rat liver sections. J. Struct. Biol. 153, 1 (2006).
  12. McDowall, A. W., et al. Electron microscopy of frozen hydrated sections of vitreous ice and vitrified biological samples. J. Microsc. 131, 1 (1983).
  13. Hayles, M. F., et al. A technique for improved focused ion beam milling of cryo-prepared life science specimens. J. Microsc. 226, 263 (2007).
  14. Pettersson, H., et al. A method for producing site-specific TEM specimens from low contrast materials with nanometer precision. Microsc. Microanal. 19, (1), 73 (2013).
  15. Wätjen, J. T., et al. Cu out-diffusion in kesterites—A transmission electron microscopy specimen preparation artifact. Appl. Phys. Lett. Appl. Phys. Lett, 051902 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics