एक केंद्रित आयन बीम क्रायो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी नमूना तैयार करना का साधन

Biology
 

Summary

क्रायो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप, स्कैनिंग (SEM) या संचरण (मंदिर), या तो व्यापक रूप से एक उच्च पानी सामग्री 1 के साथ जैविक नमूने या अन्य सामग्री के लक्षण वर्णन के लिए किया जाता है. एक SEM / केंद्रित आयन बीम (FIB) के नमूने में ब्याज की सुविधाओं की पहचान करने और एक क्रायो मंदिर को हस्तांतरण के लिए एक पतली, इलेक्ट्रॉन पारदर्शी लामेल्ला निकालने के लिए प्रयोग किया जाता है.

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Rubino, S., Melin, P., Spellward, P., Leifer, K. Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam. J. Vis. Exp. (89), e51463, doi:10.3791/51463 (2014).

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Abstract

यहाँ हम Aspergillus नाइजर बीजाणुओं की क्रायो मंदिर नमूने तैयार करने के लिए इस्तेमाल एक प्रोटोकॉल मौजूद है, लेकिन आसानी से सूक्ष्मजीवों या समाधान के किसी भी संख्या के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. हम एक कस्टम बनाया क्रायो हस्तांतरण स्टेशन और एक संशोधित क्रायो SEM तैयारी कक्ष 2 का इस्तेमाल करते हैं. बीजाणुओं एक तरल नाइट्रोजन कीचड़ में डुबकी से जमे हुए और ब्याज की एक क्षेत्र का चयन करने के लिए क्रायो SEM में मनाया, एक संस्कृति से ले रहे हैं. एक पतली लामेल्ला तो एक मंदिर ग्रिड से जुड़े और बाद में पारदर्शिता इलेक्ट्रॉन को पतला, मिथ्या का उपयोग कर निकाला जाता है. ग्रिड एक क्रायो मंदिर धारक के लिए और उच्च संकल्प के अध्ययन के लिए एक मंदिर में स्थानांतरित किया है. एक ठंडा nanomanipulator टिप और एक क्रायो हस्तांतरण स्टेशन की शुरुआत करने के लिए धन्यवाद, इस प्रोटोकॉल मंदिर नमूनों की नियमित रूप से इस्तेमाल मिथ्या तैयारी के क्रायोजेनिक तापमान के लिए एक सीधा रूपांतरण है. ऐसे में यह मौजूदा उपकरणों, setups और प्रक्रियाओं के लिए संशोधन की एक छोटी राशि की आवश्यकता के फायदे हैं; यह मैंलागू करने के लिए आसान है; यह सिद्धांत क्रायो मंदिर नमूना तैयार करने के लिए उसी के रूप में, आवेदन की एक व्यापक रेंज है. एक सीमा है कि यह संदूषण से बचने या कम करने के लिए महत्वपूर्ण कदम पर नमूनों के कुशल से निपटने की आवश्यकता है.

Introduction

इस प्रोटोकॉल में एक cryo-FIB/SEM पहले SEM विश्लेषण द्वारा उच्च परिशुद्धता के साथ पहचान के नमूने के एक विशिष्ट क्षेत्र से मंदिर के नमूनों का उत्पादन किया जाता है. जैविक नमूने के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (स्कैनिंग या संचरण) विश्लेषण अनुसंधान और नैदानिक ​​के लिए प्रयोग किया जाता है एक नियमित तकनीक है. SEM बल्कि तेजी से और रोजगार और व्याख्या करने के लिए आसान है, लेकिन जानकारी ही नमूना सतह से और 1.5 एनएम रेंज में एक संकल्प के साथ प्राप्त की है. मंदिर में एक उच्च संकल्प है, लेकिन लागू करने के लिए और अधिक कठिन है, छवि विश्लेषण कम सीधा है और थोक में जानकारी प्राप्त की है, जबकि नमूने (लगभग 500 एनएम मोटी से कम) पारदर्शिता इलेक्ट्रॉन को पतला होना है. एक अतिरिक्त समस्या उन उपकरणों का वैक्यूम आवश्यकताओं को शायद ही कभी पानी युक्त नमूनों से बर्दाश्त कर रहे हैं. ज्यादातर मामलों में, जैविक नमूने रासायनिक (पॉलिमर, उदाहरण के लिए, के साथ पानी प्रतिस्थापन) निर्धारित या सूख जाना या तो है. करने के लिए दोनों ही मामलों में महत्वपूर्ण परिवर्तननमूना की आकृति विज्ञान और संरचना होने की संभावना है. हाइड्रेटेड नमूनों की क्रायो मंदिर तैयारी कम से कम रासायनिक परिवर्तन लाती है और यह बर्फ के कांच में रूपांतर 1-6 प्राप्त किया जाता है, खासकर अगर उनके मूल राज्य के लिए संभव के रूप में नमूने के रूप में करीब पैदा करता है.

मिथ्या व्यापक रूप से इसके कई फायदे 7 के लिए मंदिर के नमूने तैयार करने के लिए प्रयोग किया जाता है. कुछ नाम हैं: लगभग सामान्य घटना पर उच्च ऊर्जा आयनों के उपयोग की सामग्री से संबंधित अंतर मिलिंग दर के प्रभाव को कम करता है; थोक नमूना से निकाले क्षेत्र एक उप माइक्रोन परिशुद्धता के साथ चुना जा सकता है; सामग्री की एक बहुत छोटी राशि निकाली गई है. कुछ हाल ही में तकनीकी विकास क्रायोजेनिक तापमान 2,8-10 पर मंदिर नमूना तैयार करने के लिए भी मिथ्या का उपयोग संभव बना दिया है. इस तरह कटा हुआ लामेल्ला के यांत्रिक विरूपण की कमी के रूप में मुलायम मामले के नमूने, के लिए मुख्य रूप से इस्तेमाल क्रायो microtomy 11,12 की पारंपरिक विधि तैयारी पर कई फायदे हैंकठिन / नरम इंटरफेस या घटकों के साथ मिश्रित नमूने तैयार करने के लिए चाकू के निशान और संभावना का अभाव.

Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल में दिए गए सभी मापदंडों यहाँ संकेत उपकरणों और मॉडलों के लिए मान्य हैं. एक और निर्माता या मॉडल प्रयोग किया जाता है (पाठ में * द्वारा चिह्नित) उन मापदंडों में से कुछ अलग हो सकता है.

मिथ्या / SEM की 1. शुरू हुआ

  1. Anticontaminator (एसी) के लिए घन braids संलग्न बिना कस्टम निर्मित ठंड nanomanipulator (समुद्री मील) टिप माउंट. इसके बजाय braids sharpening कदम (1.2) के दौरान प्रभारी को रोकने के लिए इन्सुलेशन बिंदु से ऊपर समुद्री मील दूर के आराम करने के लिए जुड़े हुए हैं सुनिश्चित करें.
    1. उच्च वैक्यूम और छवि समुद्री मील दूर टिप करने के लिए पंप, SEM चैम्बर बंद.
    2. टिप, कुंद तुला या पिछले उपयोग से दूषित है, तो आयन बीम के माध्यम से यह पैनापन: टिप के पक्ष के साथ polygonal मिलिंग पैटर्न का चयन करें, मिलिंग के बाद, टिप 1 माइक्रोन या कम करने के लिए नीचे दबे होगा.
    3. टिप के पक्षों दूर milled जाने के बाद, हाथ से, पूरे समुद्री मील दूर रॉड ° 90 से बारी बारीSEM कक्ष के बाहर से.
    4. घुमाया टिप के लिए अनुकूल है और एक अलग कोण से मिलिंग दोहराने की polygonal मिलिंग पैटर्न को समायोजित करें.
  2. टिप कम से कम 1 माइक्रोन होना करने के लिए तेज कर दिया गया है एक बार, समुद्री मील दूर वापस लेना और गैस इंजेक्शन प्रणाली (जीआईएस) की सुई डालने; (बजाय सामान्य 175 माइक्रोन का) काम दूरी से ऊपर के बारे में 1 मिमी पर होने की सुई रखते हैं.
  3. एक पंडित अग्रदूत का उपयोग करते हैं, (बजाय सामान्य 40 डिग्री सेल्सियस के) 24-26 डिग्री सेल्सियस के लिए अपने ऑपरेटिंग तापमान परिवर्तन. ये कदम पंडित की क्रायो बयान 13 के लिए आवश्यक हैं.
  4. SEM कक्ष खोलें और क्रायो नमूना मंच और एसी बढ़ते द्वारा क्रायो मोड के लिए मिथ्या / SEM तैयार करते हैं.
  5. डाला स्थिति एनएम स्विच और एसी के लिए अपने घन braids कनेक्ट. गलती से समुद्री मील दूर टिप स्पर्श नहीं करना सुनिश्चित करें. प्रणाली क्रायोजेनिक तापमान पर घन चोटी के लचीलेपन का नुकसान समुद्री मील दूर इस कदम में बाधा नहीं करेंगे सुनिश्चित करने के लिए डाला समुद्री मील के साथ ठंडा हैबयान.
  6. कुछ मिनट के लिए सूखी नाइट्रोजन गैस के साथ ठंडा करने के लिए पाइप पर्ज.
  7. क्रायो तैयारी कक्ष और उच्च वैक्यूम करने के लिए मुख्य नमूना कक्ष पम्प.
  8. दोनों कक्षों शांत करने के लिए Dewars को तरल नाइट्रोजन में जोड़ें. वांछित तापमान तक पहुँच जाता है जब तक प्रतीक्षा करें.

2. नमूना बर्फ़ीली

    1. SEM हस्तांतरण धारक पर मिथ्या नमूने के लिए दो मंदिर ग्रिड माउंट. एक शराबी के साथ इसी शिकंजा कस द्वारा उन्हें सुरक्षित.
    2. नमूना के लिए एक नमूना ठूंठ उपयुक्त पर्वत और नमूना के एक हिस्से को जोड़ने. नमूना के प्रकार पर निर्भर करता है, नमूना क्रायोजेनिक गोंद के साथ या एक क्लैंप के साथ तय किया जा सकता है. इष्टतम ठंड सुनिश्चित करने के लिए संभव के रूप में थोड़ी मात्रा का प्रयोग करें.
    3. निर्वात हस्तांतरण डिवाइस (VTD) पर SEM हस्तांतरण धारक माउंट.
    1. Slushing स्टेशन में तरल नाइट्रोजन जोड़ें और नाइट्रोजन कीचड़ प्राप्त करने के लिए नीचे पंप.
    2. SL खोलेंushing स्टेशन और SEM हस्तांतरण धारक डुबकी फ्रीज. फिर उबलते पूरा हो गया है और कीचड़ प्राप्त किया जाता है जब तक फिर से नीचे पम्प. यह एक एटैन या प्रोपेन कीचड़ या उच्च दबाव ठंड नमूना के कांच में रूपांतर प्राप्त करने के लिए बेहतर अनुकूल तकनीक है कि ध्यान दिया जाना चाहिए.
    1. VTD के निर्वात चैम्बर में SEM हस्तांतरण धारक वापस लेना और इसे सील.
    2. Slushing स्टेशन और क्रायो तैयारी कक्ष airlock वेंट.
    3. क्रायो तैयारी कक्ष और पंप के airlock साथ VTD मुहर मिलान.
    4. एक अच्छा वैक्यूम स्तर पर पहुंच गया है, जब VTD और बाहरी airlock की सील खोलने के लिए airlock पिन संलग्न; SEM हस्तांतरण धारक डालें. Sputtering और fracturing के लिए नमूना स्थिति का संकेत तैयारी कक्षों में रपट संपर्कों पर निशान नहीं हैं.
  1. यदि आवश्यक हो, नमूना जा सकता है: ठंड चाकू के साथ खंडित; एक उच्च तापमान (आमतौर पर -100 सेट करके sublimated6, ग); ठंड कणक्षेपण के माध्यम से Au / पीडी या पंडित के साथ लेपित (300 वी, 10 MA, एक 2-3 एनएम Au / पीडी टोपी के लिए 60 सेकंड) *. उच्च बनाने की क्रिया उनके recrystallization से बचने के लिए vitrified नमूने के लिए नहीं किया जाना चाहिए.
    1. मंदिर ग्रिड स्लॉट्स के सुरक्षात्मक ढक्कन खोलने के लिए ठंड चाकू का प्रयोग करें.
    2. प्राप्त ऊंचाई (16 मिमी *) के लिए नमूना कक्ष में ठंड मंच लाओ.
    3. मिथ्या / SEM पर एचटी बंद कर और आंतरिक airlock खुला.
    4. नमूना कक्ष में SEM धारक स्थानांतरित करने के लिए VTD का प्रयोग करें. कमरे में प्रकाश Dimming इस चरण में मदद मिल सकती है.
    5. SEM धारक ठंड चरण में है एक बार, धक्का और घूर्णन द्वारा VTD छुड़ाना.
    6. VTD निर्वात चैम्बर में VTD रॉड सभी तरह वापस लेना और भीतरी airlock, बाहरी airlock और VTD सील बंद करें. बाहरी airlock अब VTD सील हटाने के लिए दिए जा सकते हैं. यह अंतिम कदम की आवश्यकता नहीं है, लेकिन VTD रॉड आसानी दुर्घटना से उखाड़ फेंकना हो सकता है के रूप में यह नुकसान हो सकता है, जो सिफारिश की हैVTD या airlock के लिए.

3. आयन मिलिंग

  1. दोनों स्तंभों पर उच्च तनाव को चालू करें और उचित इमेजिंग मानकों (त्वरक वोल्टेज सेट: इलेक्ट्रॉन बीम के लिए 10 केवी, आयन बीम के लिए 30 केवी; स्थान आकार: 3; काम कर दूरी: 5 मिमी, आयन बीम वर्तमान: 10-100 इमेजिंग के लिए पीए, मिलिंग के लिए 1-3 एनए) *.
  2. ब्याज की एक विशेषता यह लगता है और लामेल्ला की निकासी से पहले नमूना की स्थिति दस्तावेज़ के लिए छवियों को प्राप्त करने के लिए इलेक्ट्रॉन बीम का उपयोग करें.
  3. निकासी के लिए ब्याज (आरओआई) के एक क्षेत्र की पहचान हो जाने के बाद नमूना खुद की स्थलाकृति भी पं. बयान के बाद रॉय के एक आसान पहचान के लिए अनुमति देता है, जब तक, आयन बीम patterning द्वारा चिह्नित. वृद्धि की परिशुद्धता के लिए, चिह्नों, गहरी चौड़े और गैर एसईएल है जो क्रायो पं. बयान (द्वारा कवर किए जाने के बाद अभी भी दिखाई दे सकता है अभी तक पर्याप्त होना चाहिए Pettersson एट अल. 14 से वर्णित विधि का उपयोग) ective और नमूना की सतह के कई मिमी 2 को कवर किया जाएगा.
  4. 24-26 डिग्री सेल्सियस के अग्रदूत गैस गर्मी और नमूना की सतह से ऊपर के बारे में 1 मिमी की ऊंचाई तक जीआईएस सुई डालने (भी 1.3 कदम देखें).
  5. इलेक्ट्रॉन बीम के साथ इमेजिंग, वहीं कुछ सेकंड के लिए गैस वाल्व खुला. क्रायो पं. बयान की दर जीआईएस सुई, नमूना खुरदरापन और उपयोगकर्ता के सिस्टम की दूरी के आधार पर, 100-500 एनएम / सेकंड या उससे अधिक है. यह इष्टतम मापदंडों का निर्धारण करने के लिए कुछ परीक्षण बयानों को चलाने के लिए उचित है.
  6. कच्चे क्रायो पं. बयान बहुत मोटा और inhomogeneous है. कम बढ़ाई (उदाहरण के लिए 2,000 एक्स) में 1,000 पीए आयन बीम का उपयोग करके आरओआई से अधिक जमा इलाज. क्रायो बयान के विपरीत, इस इलाज के चुनिंदा साइट है और केवल रॉय पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए. यह पहली क्रायो बयान के उद्देश्य आयन बीम क्षति से नमूना की सतह की रक्षा के लिए और आयन thinning 13 के दौरान Curtaining को कम करना है.
  7. नमूना झुकाएँ52 ° सतह आयन बीम को सीधा है कि इतनी. रॉय के दोनों तरफ मिल दूर दो सीढ़ीदार खाइयों. खाइयों के लिए विशिष्ट आयाम निकाला जाना लामेल्ला, सीधा दिशा (वाई) में और एक चर के साथ 10-15 मीटर के लिए दिशा (एक्स) समानांतर में 20-30 माइक्रोन हैं, गहरे बिंदु के साथ, गहराई (जेड) ढालू आरओआई के करीब है. ढलान 45-55 डिग्री होना चाहिए. कुछ उपकरणों में, सीढ़ीदार खाइयों केवल शीर्ष पर गहरे बिंदु के साथ milled जा सकता है. ऐसे मामले में, रॉय के तहत मिल एक है, तो छवि में 180 डिग्री और चक्की दूसरी तरफ एक दूसरे के लिए बारी बारी से. सामग्री की धूम दर में जाना जाता है अगर मिलिंग की गहराई का चयन किया जा सकता है. सबसे जमी हाइड्रेटेड नमूने के लिए, बर्फ की धूम दर 7 इस्तेमाल किया जा सकता है.
  8. वापस 0 डिग्री के लिए नमूना झुकाव और यकीन है कि काटने के निशान (वे सीढ़ीदार ढलानों चक्की पर पिसाई के निशान छोड़ देना चाहिए पूरे लामेल्ला के माध्यम से जाना है, जिससे लामेल्ला के पक्ष और नीचे दूर काटने के लिए आयन बीम का उपयोग) पिछले चरण में एड. नमूना के आराम करने के लामेल्ला जोड़ने केवल दो छोटे पुलों छोड़ दें.
  9. (यह थोड़ा नमूना बदलाव हो सकते हैं) जीआईएस सुई डालें. इसकी टिप अधिमानतः ओर, लामेल्ला के साथ शारीरिक संपर्क में है जब तक समुद्री मील दूर पैंतरेबाजी. समुद्री मील दूर दो छोटे जोड़ने पुलों के आयन बीम देखने में बाधा डालने नहीं है सुनिश्चित करें.
    1. कुछ सेकंड के लिए जीआईएस वाल्व खुला और इलेक्ट्रॉन बीम के साथ निरंतर इमेजिंग द्वारा क्रायो बयान की निगरानी.
    2. पंडित का एक अतिरिक्त 1-2 माइक्रोन परत क्रायो जमा किया गया है, वाल्व बंद करें.
    3. केवल समुद्री मील दूर लामेल्ला के साथ संपर्क में है जहां बिंदु के आसपास कुछ माइक्रोन में पंडित (कदम 2.6 देखें) का इलाज.
    4. मुफ्त लामेल्ला कटौती करने के लिए एक उच्च आयन बीम वर्तमान का उपयोग करें. दो को जोड़ने के पुलों दूर milled, साथ ही लामेल्ला और नमूने के बाकी हिस्सों के बीच नए संपर्क अंक का गठन हो सकता है कि पंडित के किसी भी अधिक किया जाना चाहिए. अभी तक जीआईएस सुई वापस लेना न करें.
    ध्यान खाइयों से लामेल्ला निकालने के लिए और कम से कम 500 माइक्रोन नमूना की सतह से ऊपर ले जाने के लिए समुद्री मील दूर छल. केवल इस कदम के बाद, जीआईएस सुई वापस लेना.
  10. नमूना मंच कुछ मिमी कम है और मंदिर ग्रिड में से एक है जब तक यह कदम दृश्य में है. काम करने की स्थिति में ग्रिड पर कुर्की क्षेत्र में ले जाएँ और जीआईएस सुई डालें.
    1. ध्यान से मंदिर ग्रिड पर कुर्की क्षेत्र के साथ शारीरिक संपर्क में संलग्न लामेल्ला लाने के लिए समुद्री मील दूर छल. लामेल्ला, मंदिर ग्रिड और एनएम के बीच कोई दबाव या तनाव नहीं होना चाहिए.
    2. कुछ सेकंड और क्रायो जमा पंडित की एक अतिरिक्त 1-2 माइक्रोन परत के लिए गैस वाल्व खुला.
    3. केवल लामेल्ला और मंदिर ग्रिड के बीच संपर्क के बिंदु के आसपास कुछ माइक्रोन में पंडित (कदम 2.6 देखें) का इलाज.
  11. समुद्री मील दूर से मुक्त लामेल्ला कटौती करने के लिए एक उच्च आयन बीम वर्तमान का उपयोग करें. इस समुद्री मील दूर टिप या नमूना के दोनों ओर दूर मिलिंग के द्वारा पूरा किया जा सकता है. टी मेंवह पहला मामला टिप 1.2 चरण में वर्णित के रूप में, अगले उपयोग करने से पहले एक बार फिर तेज करना होगा.
  12. वैकल्पिक: इस स्तर पर यह SEM हस्तांतरण धारक लेने और तरल नाइट्रोजन से भरा एक देवर में ओ / एन यह स्टोर करने के लिए VTD उपयोग करने के लिए संभव है. इस हस्तांतरण और ओ / एन भंडारण लामेल्ला की सतह पर बर्फ के गठन की संभावना के कारण तरल नाइट्रोजन आर्द्र हवा के संपर्क में है, तो बर्फ के क्रिस्टल पहले से ही मौजूद हैं और / या अगर; लेकिन इस तरह के प्रदूषण को एक अपेक्षाकृत कम समय में अगले कदम से हटा दिया जाएगा. पिछले चरणों को पूरा करने के लिए कई घंटे ले सकता है के रूप में निम्नलिखित कदम के बाद इस तरह के भंडारण हे / एन की सिफारिश नहीं है के बाद से (उच्च बनाने की क्रिया द्वारा छोड़कर बर्फ संदूषण को दूर करने के लिए कोई रास्ता नहीं होगा, यह ऐसा करने के लिए उपयुक्त हो सकता है नमूना के कांच में रूपांतर बनाए रखा जाना है) नहीं किया जा सकता.
  13. 52 ° करने के लिए नमूना झुकाव और यह पारदर्शिता 7 इलेक्ट्रॉन को पतला करने के लिए आयन बीम का उपयोग करें. यह उच्च, Roug के साथ शुरू करने की सिफारिश की हैउसके बीम धाराओं थोक हटाने और अंत में भी तेज करने वोल्टेज कम करने, कम बीम धाराओं के साथ सतह चमकाने ठीक करने के लिए आगे बढ़ने के लिए. लामेल्ला के अंतिम मोटाई नमूना संरचना पर निर्भर करता है, एक 100-200 केवी मंदिर में फैटी विश्लेषण के लिए 100-200 एनएम या कम या एक 300 केवी मंदिर में टोमोग्राफी के लिए अप करने के लिए 500 एनएम होना चाहिए. Thinning के दौरान, नमूना के आंतरिक तनाव लामेल्ला कर्ल या मोड़ करने के लिए कारण हो सकता है. ऐसे मामले में, पतला क्षेत्र प्रतिबंधित किया जाना चाहिए. यह आंकड़े 11 और 12 में उदाहरण के लिए हुआ.

मंदिर के लिए 4. क्रायो स्थानांतरण

    1. कुछ मिनट के लिए सूखी नाइट्रोजन गैस के साथ क्रायो हस्तांतरण स्टेशन फ्लश.
    2. मंदिर एसी के देवर को और क्रायो हस्तांतरण स्टेशन के लिए तरल नाइट्रोजन में जोड़ें.
    3. क्रायो हस्तांतरण स्टेशन के उपयुक्त स्लॉट में क्रायो स्थानांतरण मंदिर धारक डालें और साथ ही अपने देवर भरें. प्रत्येक कंप्यूटर अनुप्रयोग रुको जब तकonent वांछित तापमान (लगभग 15 मिनट) तक पहुँच गया है. यदि संभव हो तो, क्रायो स्थानांतरण मंदिर धारक के नियंत्रक स्थानांतरण के दौरान तापमान पर नजर रखने को जोड़ा जाना चाहिए. यह (तापमान संवेदक जहां स्थित है) मंदिर धारक की नोक क्रायो हस्तांतरण स्टेशन के साथ संपर्क में हो जाएगा और इसलिए मंदिर धारक के बाकी की तुलना में ज्यादा तेजी से ठंडा हो जाएगा कि एहसास करने के लिए महत्वपूर्ण है. इसलिए यह नीचे शांत करने के लिए पूरे क्रायो स्थानांतरण मंदिर धारक के लिए आवश्यक समय पहले से मापा जाता है, और इस प्रणाली समय की कम से कम उस राशि के लिए thermalize की अनुमति दी है कि है कि सिफारिश की है.
    4. तरल नाइट्रोजन के साथ एक क्रायोजेनिक कप भरें और उस में विसर्जित: वांछित तापमान को उनके सुझावों को ठंडा करने के क्रम में मंदिर नमूना clamping के उपकरण, एक शराबी और चिमटी,. ऑपरेटर के हाथ करने के लिए ठंड के जलने के कारण के रूप में नहीं तो सभी उपकरण ठीक दूसरे छोर पर अछूता होना चाहिए.
  1. बाहरी airlock को VTD मिलान. ठंड हरिण लाओस्थानांतरण ऊंचाई (16 मिमी *) के लिए ई. उच्च तनाव को बंद कर दें.
    1. VTD मुहर, बाहरी airlock और भीतरी airlock खोलें.
    2. दक्षिणावर्त धक्का और घूर्णन द्वारा SEM हस्तांतरण धारक में ताला VTD रॉड का प्रयोग करें.
    3. क्रायो तैयारी चेंबर में SEM हस्तांतरण धारक वापस लेना.
    4. मंदिर ग्रिड की सुरक्षा पलकों को बंद करने की ठंड चाकू का प्रयोग करें. इस हस्तांतरण के दौरान संभव बर्फ प्रदूषण को कम करने के लिए आवश्यक है.
    5. VTD के निर्वात चैम्बर में नमूना ले जाने के लिए VTD रॉड का प्रयोग करें.
    6. Airlocks और सील बंद करें.
  2. बाहरी airlock वेंट और VTD अलग. क्रायो हस्तांतरण स्टेशन के SEM बंदरगाह के लिए VTD मिलान. सूखी नाइट्रोजन के साथ निस्तब्धता, वहीं VTD की सील खोलने और क्रायो हस्तांतरण स्टेशन के देवर में SEM हस्तांतरण धारक स्लाइड करने के लिए स्टेशन पर पिन का उपयोग करें.
    1. क्रायो हस्तांतरण स्टेशन में स्तर काफी अधिक है कि इतना पर्याप्त तरल नाइट्रोजन में जोड़ेंसिर्फ नमूना डूब.
    2. पलकों का एक खुला और जगह में मंदिर ग्रिड रखे हुए है कि इसी पेंच ढीला करने के लिए पहले से ठंडा पेचकश का प्रयोग करें.
    3. मंदिर ग्रिड लेने और मंदिर धारक में यह जगह पहले से ठंडा चिमटी का प्रयोग करें.
    4. मंदिर धारक पर मंदिर ग्रिड दृढ़ करने के लिए ठंडा hexring का प्रयोग करें.
    5. क्रायो स्थानांतरण मंदिर धारक का शटर बंद कर दें. नमूना हस्तांतरण कदम महत्वपूर्ण है और छोटे मंदिर नमूना की दृश्यता कम करने नाइट्रोजन गैस के द्वारा बाधा उत्पन्न किया जा सकता है.
    6. पम्पिंग प्रणाली से क्रायो हस्तांतरण स्टेशन डिस्कनेक्ट और एक साथ क्रायो स्थानांतरण मंदिर धारक के हीटर नियंत्रक के साथ, मंदिर के पास परिवहन.
    7. मंदिर airlock को समर्थन लाइन पंप करने के लिए मंदिर के turbomolecular पंप शुरू.
    8. -70 डिग्री के एक झुकाव * करने के लिए मंदिर नमूना मंच तैयार.
    9. सूखी नाइट्रोजन गैस के साथ मिटाने का केवल एक चक्र के साथ, airlock (30-60 सेकंड) के लिए कम से कम पम्पिंग समय निर्धारित करें.
    10. क्रायो स्थानांतरण मंदिर धारक पर सुरक्षात्मक शटर बंद कर दिया है कि यह सुनिश्चित करें. क्रायो हस्तांतरण स्टेशन से मंदिर धारक को हटाने और (तरल नाइट्रोजन मंदिर धारक देवर से बाहर गिर जाएगा) झुका गोनियोमीटर में डालें. पम्पिंग चक्र शुरू कर देंगे. चक्र पूरा हो गया है एक बार, 0 डिग्री के लिए वापस झुकाव गोनियोमीटर सेट और, यह गोनियोमीटर के साथ बारी बारी से नहीं करता है, ताकि एक ही समय में, मंदिर धारक पकड़. मंदिर के अंदर पूरी तरह से डालें. इस चरण के दौरान, क्रायो स्थानांतरण मंदिर धारक तापमान पर नजर रखने के लिए अपने हीटर नियंत्रक से जुड़ा होना चाहिए. मंदिर में नमूना धारक को सम्मिलित करने की प्रक्रिया अलग TEMs के बीच भिन्न हो सकते हैं. इसलिए यह उचित प्रक्रिया प्राप्त करने के लिए मंदिर के निर्माता से संपर्क करने के लिए सिफारिश की है.
    11. क्रायो स्थानांतरण मंदिर धारक देवर फिर से भरना. एक स्वीकार्य स्तर तक पहुँचने के लिए मंदिर में वैक्यूम के लिए प्रतीक्षा करें.

Representative Results

इस काम में हम का इस्तेमाल किया: एक nanomanipulator और एक क्रायो तैयारी कक्ष से लैस एक दोहरी बीम FIB / SEM; एक क्रायो हस्तांतरण धारक के साथ एक मंदिर; एक प्रोटोटाइप क्रायो हस्तांतरण स्टेशन. anticontaminator (एसी) क्रायो तैयारी चैंबर के ब्लेड और nanomanipulator (समुद्री मील) की नोक Gatan द्वारा संशोधित किया गया है. एक मानक क्रायो तैयारी चैम्बर के लिए सम्मान के साथ, एसी ब्लेड समुद्री मील दूर टिप के लिए अधिक से अधिक गर्मी सिंक प्रदान करने के लिए बड़े होते हैं. इसके अलावा, एसी समुद्री मील दूर टिप के साथ गर्मी विनिमय के लिए घन braids जोड़ने के लिए clamps के साथ लगाया जाता है. मिथ्या / SEM की Pneumatics समुद्री मील दूर होने की अनुमति संशोधित किया गया है और नमूना कक्ष निकाल रहा था, तब भी जब डाला रहते हैं. यह इस काम में इस्तेमाल मापदंडों सबसे अच्छा ऊपर सूचीबद्ध उपकरणों के लिए अनुकूल हैं कि ध्यान दिया जाना चाहिए; उन मानकों उपकरणों के अन्य प्रकार के साथ कार्य करते समय समायोजित करने की जरूरत हो सकती है. इस प्रोटोकॉल के साथ काम करने के लिए, cryogenics से निपटने के लिए सामान्य सावधानियों, तरल नाइट्रोजन और वैक्यूम सिस्टम होना चाहिएपीछा किया.

विधि समाधान या नैनोकणों युक्त बहुलक matrices से, नेमाटोड के लिए एक कोशिकीय जीव से लेकर, अच्छे परिणामों के साथ नमूने के विभिन्न प्रकारों पर परीक्षण किया गया है. प्रक्रिया के विभिन्न चरणों के उदाहरण पर आंकड़े 1-12 में सचित्र हैं नाइजर बीजाणुओं आज़मियम tetroxide और पोटेशियम परमैंगनेट के साथ दाग. बीजाणुओं पहले निकासी के लिए साइट की पहचान करने के लिए (चित्रा 1) SEM ने उतारी जाती है. इस मामले में, किसी भी बीजाणु के एक क्रॉस सेक्शन पर्याप्त था, लेकिन यह करने के लिए उप सुक्ष्ममापी परिशुद्धता के साथ निकासी के लिए लागत पर लाभ की स्थिति उदाहरण के लिए, कोशिका झिल्ली से एक विशिष्ट दूरी पर एक विशेष सेल टुकड़ा करने के लिए संभव है. ब्याज की सुविधा पहचान हो जाने के बाद, क्रायो पं. बयान की दिशा में पहला कदम आयन मिलिंग से किरण नुकसान से नमूना की रक्षा के लिए, चित्रा (2) लागू किया गया है. नमूना पहला कदम ओ के साथ आगे बढ़ने के लिए 52 डिग्री तक झुका हुआ हैच मिलिंग (चित्रा 3): लामेल्ला के दोनों किनारों पर दो खाइयों के sputtering. नमूना फिर वापस झुका हुआ है और आगे थोक को जोड़ने केवल दो छोटे पुलों (चित्रा 4) छोड़ने के लिए milled है. ठंडा nanomanipulator लामेल्ला के साथ संपर्क (चित्रा 5) और पीटी के एक और क्रायो बयान उन्हें एक साथ solders (चित्रा 6) में लाया जाता है. छोटे जोड़ने पुलों तो दूर milled और समुद्री मील दूर मंदिर ग्रिड की कुर्की क्षेत्र यह पंडित के अंतिम क्रायो बयान चित्रा (8) के साथ soldered है जहां चित्रा (7), निकट लामेल्ला कदम हैं. समुद्री मील दूर तो आयन बीम के साथ पारदर्शिता (चित्रा 10 और 11) इलेक्ट्रॉन के लिए नीचे पतला है जो लामेल्ला (9 चित्रा) से अलग है. लामेल्ला अंत में मंदिर (12 चित्रा) को सौंप दिया है, जहां उच्च संकल्प इमेजिंग, स्पेक्ट्रोस्कोपी, टोमोग्राफी और अन्य तकनीकों can नियोजित किया.

चित्रा 1
चित्रा 1. के बीजाणुओं की क्रायो SEM छवि पं. बयान से पहले नाइजर,.

चित्रा 2
चित्रा 2. पं. बयान के बाद चित्रा 1 में, लेकिन इलाज से पहले ही क्षेत्र.

चित्रा 3
चित्रा 2 में एक ही क्षेत्र के चित्रा 3. क्रायो SEM छवि, खाई मिलिंग के साथ, पं. बयान और इलाज के बाद, 52 डिग्री झुका चल(3.7 कदम देखें).

चित्रा 4
लिफ्ट से बाहर के लिए तैयार चित्रा 4. लामेल्ला,.

चित्रा 5
चित्रा 5. ठंड nanomanipulator टिप लामेल्ला के साथ संपर्क में आता है.

चित्रा 6
चित्रा 6. एक दूसरे पं. क्रायो बयान nanomanipulator और लामेल्ला एक साथ मिलाप के लिए प्रयोग किया जाता है.

चित्रा 7. ठंड nanomanipulator मंदिर ग्रिड की कुर्की क्षेत्र को लामेल्ला स्थानांतरित करने के लिए प्रयोग किया जाता है.

8 चित्रा
चित्रा 8. क्रायो बयान मंदिर ग्रिड को लामेल्ला संलग्न करने के लिए एक बार और अधिक प्रयोग किया जाता है.

9 चित्रा
चित्रा 9. लामेल्ला nanomanipulator से मुक्त कटौती और यह अब भंडारण या पारदर्शिता इलेक्ट्रॉन को thinning या तो के लिए तैयार है.


10 चित्रा. Thinning के एक मध्यवर्ती कदम, क्रॉस सेक्शन में दिखाई कुछ बीजाणुओं के साथ.

11 चित्रा
. अंतिम thinning के बाद नमूना के 11 क्रायो SEM छवि आंकड़ा; अन्य बीजाणुओं की सबसे लामेल्ला कर्ल करना शुरू कर दिया था क्योंकि दूर milled किया जा सकता था.

चित्रा 12
12 चित्रा. लामेल्ला का एक समग्र क्रायो मंदिर तस्वीर. अल ठूंठ का हिस्सा शामिल किया गया हैलामेल्ला (काला तीर) में.

Discussion

इस प्रोटोकॉल आरटी पर भौतिक विज्ञान में प्रयोग किया जाता मानक मिथ्या / मंदिर नमूना तैयार करने के क्रायोजेनिक तापमान के एक नहीं बल्कि सीधा रूपांतरण है. नमूना सतह inhomogeneous है अगर Curtaining को हो सकती है, हालांकि विधि, यांत्रिक विरूपण और चाकू के निशान (microtomy के प्रमुख दोष) से ​​मुक्त मंदिर नमूने पैदा करता है. यह चिकनी और 13 कुरूप है जब तक यह ठीक एक कैपिंग परत (इस काम में पं. इस्तेमाल किया गया था), के क्रायो बयान के द्वारा कम किया जा सकता है. बहुत अलग कठोरता के घटकों के साथ नमूने वे तैयारी के दौरान तनाव में तोड़ना होगा कि जोखिम के बिना के रूप में अच्छी तरह से तैयार किया जा सकता है. आंतरिक तनाव अभी भी पतली लामेल्ला खंड का आकार कम किया जा सकता है, जो मामले में मोड़ या कर्ल कारण हो सकता है. अन्य विधि की तुलना में एक खामी की वजह से आयन बीम और नमूना में आयनों के संभावित आरोपण के लिए जोखिम के लिए जैविक संरचना को बदलने की संभावना है. ये कमियां भी नमूना prepar के लिए आरटी पर घटितविज्ञान सामग्री 15 में समझना. वे आयनों (500-1,000 वी) के लिए सबसे कम त्वरक वोल्टेज में एक अंतिम चमकाने कदम के साथ thinning पूरा करके कम किया जा सकता है. यह बहुत ही सौम्य चमकाने कदम लामेल्ला से क्षतिग्रस्त परत को हटा देगा.

कारण क्रायो बयान (3.5, 3.10 और 3.13 कदम) की प्रकृति के कारण, नमूना के बड़े हिस्से जिससे मूल सतह से देखने में बाधा डालने, शामिल किया जाएगा. यह कदम 3.3 में सुझाव के रूप में कई चिह्नों उपयोग किया जाता है जब तक कि यह मुश्किल है, आरओआई का ट्रैक रखने के लिए कर सकते हैं.

कदम हवा के संपर्क में आने 4.5 और 4.7 पतली लामेल्ला जोखिम के दौरान. यह यह संभवतः महत्वपूर्ण सुविधाओं obscuring के मुद्दे पर, नमूना की सतह पर बर्फ क्रिस्टल फार्म हवा में नमी के कारण होता है के रूप में बचा जाना पड़ता है. उन कदमों के रूप में जल्दी संभव के रूप में किया जाना चाहिए, लेकिन एक ही समय में स्थानांतरण के दौरान एक mishandling नमूना के नुकसान में परिणाम की संभावना है यहस्व. यह उपयोगकर्ता एक असली नमूना पर एक प्रयास किया है पहले खाली मंदिर ग्रिड का उपयोग करके उन कदमों प्रथाओं की सिफारिश की है.

सामग्री विज्ञान में, मिथ्या साधन इसके व्यावसायीकरण की एक दशक के भीतर मंदिर नमूना तैयार की प्रमुख तरीका बन गया है. यह लगभग किसी भी नमूना पर इस्तेमाल किया जा सकता है, यह नमूना के प्रकार के लिए तैयारी तकनीक से तैयार करने की जरूरत को हटाता है. हम दृढ़ता से एक ही है, क्रायोजेनिक तापमान पर यहाँ विस्तृत प्रक्रिया को धन्यवाद भी हो सकता है. बड़े नमूनों के लिए अपने आवेदन अभी भी क्रायो बनाए रखने के एक vitrified राज्य में उन्हें करने की क्षमता के अधीन है, लेकिन 3,5 ठंड ऐसे डुबकी ठंड या उच्च दबाव के रूप में तकनीक इस समस्या के लिए इष्टतम समाधान साबित हो सकता है.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस शोध FP7 क्षमताओं कार्यक्रम (अनुदान सं इंफ्रा-2010-262163) के तहत यूरोपीय समुदाय रिसर्च इंफ्रास्ट्रक्चर्स द्वारा वित्त पोषण किया है जो QNano परियोजना http://www.qnano-ri.eu से समर्थन प्राप्त है.

हम भी वित्तीय सहायता के लिए अनुसंधान परिषद Formas धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Strata DB 235 FEI FIB/SEM
Omniprobe 100 Oxford Instruments Nanomanipulator
Alto 2500 Gatan Cryo preparation chamber
Cryo-holder model 626 Gatan Cryo transfer TEM holder
Tecnai F30 FEI TEM

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References

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