Cryo-Electron Microscopy Prøvepræparation ved hjælp af en målrettet Ion Beam

Biology
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Rubino, S., Melin, P., Spellward, P., Leifer, K. Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam. J. Vis. Exp. (89), e51463, doi:10.3791/51463 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Her præsenterer vi en protokol, der bruges til at forberede cryo-TEM prøver af Aspergillus niger sporer, men som let kan tilpasses til ethvert antal af mikroorganismer eller løsninger. Vi gør brug af en specialbygget cryo-transfer station og en modificeret cryo-SEM forberedelse kammeret 2. Sporerne er taget fra en kultur, springet-frosset i flydende nitrogen sjap og observeret i cryo-SEM til at vælge et område af interesse. En tynd lamel derefter ekstraheret ved hjælp af FIB, fastgjort til en TEM gitter og efterfølgende tyndet til elektron gennemsigtighed. Gitteret overføres til en cryo-TEM holder og ind i en TEM til undersøgelser høj opløsning. Takket være indførelsen af ​​en afkølet nanomanipulator spids og en cryo-transfer station, denne protokol er en enkel tilpasning til kryogen temperatur rutinemæssigt anvendte forberedelsen af ​​TEM prøver FIB. Som sådan har fordelene ved at kræve en lille mængde af ændringer af eksisterende instrumenter, opsætninger og procedurer; det jegs let at gennemføre; Det har en bred vifte af applikationer, i princippet de samme som for cryo-TEM prøveforberedelse. En begrænsning er, at det kræver dygtige håndtering af prøver på kritiske skridt til at undgå eller minimere forureninger.

Introduction

I denne protokol en cryo-FIB/SEM bruges til at producere TEM prøver fra en bestemt region af prøven, der tidligere er identificeret med høj præcision ved SEM-analyse. Elektronmikroskopi (scanning eller transmission) analyse af biologiske prøver, er en rutinemæssig teknik, der anvendes til forskning og diagnostik. SEM er temmelig hurtig og nem at anvende og fortolke, men fås kun oplysninger fra prøven overflade og med en opløsning på 1,5 nm. TEM har en højere opløsning, men er vanskeligere at gennemføre, er billedet analysen er mindre ligetil, og at der opnås hovedparten information, prøverne skal fortyndes til elektron gennemsigtighed (mindre end omkring 500 nm tyk). Et yderligere problem er, at vakuum krav i disse instrumenter sjældent tolereres af prøverne vandholdige. I de fleste tilfælde biologiske prøver skal enten kemisk fast (erstatte vand med for eksempel polymerer) eller tørret. I begge tilfælde, væsentlige ændringer imorfologi og struktur af prøven forventes at forekomme. Cryo TEM udarbejdelse af hydreret prøver inducerer minimale kemiske ændringer og det producerer prøver så tæt som muligt på deres oprindelige tilstand, især hvis forglasse is opnås 1-6.

Den FIB er almindeligt anvendt til at forberede TEM prøver for sine talrige fordele 7. For at nævne et par stykker: brugen af ​​højenergi-ioner på næsten normal forekomst minimerer effekten af ​​materiale-relaterede differential fræsning satser; ekstraheret fra bulkprøven regionen kan vælges med en sub-micron præcision; en meget lille mængde materiale udvundet. Nogle seneste tekniske udvikling har gjort det muligt at bruge FIB også for TEM prøveforberedelse ved kryogene temperaturer 2,8-10. Der er flere fordele frem for den traditionelle fremstillingsmetode af cryo-microtomy 11,12 bruges primært til blød stof prøver, såsom mangel på mekanisk deformation af skiveskåret lamel,fravær af kniv mærker og muligheden for at fremstille sammensatte prøver med hårde / bløde grænseflader eller komponenter.

Protocol

BEMÆRK: alle parametre i denne protokol gælder for de instrumenter og modeller, der er angivet her. Nogle af disse parametre (markeret med * i teksten), kan variere, hvis en anden producent eller model anvendes.

1.. Opstart af FIB / SEM

  1. Monter specialbyggede kold nanomanipulator (NM) tip uden at knytte Cu fletninger til anticontaminator (AC). I stedet skal du sørge for fletninger er forbundet til resten af ​​NM over isoleringen punkt at forhindre opladning op under slibning trin (1.2).
    1. Luk SEM kammer, pumpe til højt vakuum og billede NM spids.
    2. Hvis spidsen er stump, bøjet eller er forurenet med tidligere brug, skærpe den ved hjælp af ionstrålen: vælg polygonale fræse mønstre langs siderne af spidsen, så efter fræsning, vil spidsen taper ned til 1 m eller mindre.
    3. Når siderne af spidsen er blevet fræset bort, manuelt at dreje 90 ° hele NM stangfra lande uden for SEM-kammeret.
    4. Juster polygonale fræse mønstre til at tilpasse sig det roterede spids og gentag fræsning fra en anden vinkel.
  2. Når spidsen er blevet skærpet til at være mindre end 1 um, trække NM og indfør nålen i Gas Injection System (GIS); flytte nålen til at være på omkring 1 mm over arbejdsdækket afstand (i stedet for de sædvanlige 175 um).
  3. Hvis du bruger en Pt forløber, ændre dens driftstemperatur til 24-26 ° C (i stedet for de sædvanlige 40 ° C). Der er behov for disse trin for cryo-deposition 13 Pt.
  4. Åbn SEM kammer og forberede FIB / SEM for cryo-mode ved at montere cryo prøve scenen og AC.
  5. Skift NM til den indsatte position og forbinde sine Cu fletninger til AC. Sørg for ikke at komme til at røre NM spids. Systemet afkøles med NM indsat for at sørge for, at tabet af fleksibilitet Kobber flettet ved kryogene temperaturer ikke vil hæmme NM flytteling.
  6. Udrense rør til afkøling med tør nitrogengas i et par minutter.
  7. Pump kryo tilberedningskammeret og den vigtigste prøvekammeret for højvakuum.
  8. Læg flydende kvælstof til Dewars at afkøle begge kamre. Vent indtil den ønskede temperatur er nået.

2.. Sample Indefrysning

    1. Monter to TEM gitre til FIB prøver på SEM transfer indehaveren. Sikre dem ved at stramme de tilsvarende skruer med en skruetrækker.
    2. Monter en prøve stub passende for prøven og tilføje en del af prøven. Afhængigt af typen af ​​prøve, kan prøven fastgøres med kryogen lim eller med en klemme. Anvende beløb så små som muligt for at sikre en optimal frysning.
    3. Monter SEM transfer holderen på vakuum transfer enhed (VTD).
    1. Tilføj flydende nitrogen i ælte station og pumpe ned for at opnå nitrogen sjap.
    2. Åbn slushing station og dyk-fryse SEM transfer indehaveren. Pump ned igen til kogning er afsluttet og sjap opnås igen. Det skal bemærkes, at en ethan eller propan sjap eller højt tryk frysning er bedre egnede teknikker til at opnå forglasningen af ​​prøven.
    1. Træk SEM transfer holderen ind i vakuum kammer VTD og forsegle den.
    2. Udluft skvulper station og kryo forberedelse kammer luftsluse.
    3. Match VTD tætning med luftslusen af ​​kryo forberedelse kammer og pumpe.
    4. Når en god vakuum er nået, engagere luftslusen pin til at åbne segl VTD og den ydre luftsluse; Indsæt SEM transfer indehaveren. Der er markeringer på glidekontakterne i forberedelsen kamre med angivelse af placering prøven til sputtering og frakturering.
  1. Hvis det er nødvendigt, kan prøven: afrevet med den kolde kniv; sublimeret ved at sætte en højere temperatur (normalt -1006, C); belagt med Au / Pd eller Pt ved hjælp af den kolde sputterer (300 V, 10 mA, 60 sek til en 2-3 nm Au / Pd cap) *. Sublimation bør ikke anvendes til forglasset prøver for at undgå deres omkrystallisation.
    1. Brug den kolde kniv til at åbne den beskyttende låg af TEM gitter slots.
    2. Bring kolde fase i prøven kammer til den modtagende højde (16 mm *).
    3. Sluk for HT på FIB / SEM og åbne den inderste luftsluse.
    4. Brug VTD at overføre SEM holderen i prøvekammeret. Dæmpning af belysningen i rummet kan hjælpe med dette trin.
    5. Når SEM indehaveren er i den kolde fase, frigøre VTD ved at skubbe og dreje.
    6. Træk VTD stangen hele vejen ind i VTD vakuumkammer og lukke den indre luftsluse den ydre luftsluse og VTD tætning. Den ydre luftsluse kan nu udluftes for at fjerne VTD tætning. Det sidste trin er ikke påkrævet, men det anbefales som VTD stang kan nemt forrykke sig ved et uheld, som kan forårsage skadetil VTD eller luftslusen.

3.. Ionfræsning

  1. Tænd den høje spænding på begge kolonner og angive de relevante billeddiagnostiske parametre (accelererende spænding: 10 kV for elektronstrålen, 30 kV for ionstrålen, spot størrelse 3, arbejde distance: 5 mm, ionstrålestrøm: 10-100 pa for billedbehandling, 1-3 nA for fræsning) *.
  2. Brug elektronstråle til at finde en funktion af interesse og til at erhverve billeder for at dokumentere status prøven før udvinding af lamellen.
  3. Når et område af interesse (ROI) for udvinding er identificeret, markere det ved ion stråle mønster, medmindre topografi selve prøven giver mulighed for en nem identifikation af ROI, selv efter Pt deposition. For øget præcision, bruge den metode, der er beskrevet af Pettersson et al. 14. Markeringerne skal være dyb, bred og langt nok til at være stadig synlige efter at være blevet omfattet af cryo-Pt deposition (som er ikke-selective og vil omfatte flere mm 2 af prøven overflade).
  4. Varm precursorgas til 24-26 ° C, og indsætte GIS nål til en højde på omkring 1 mm over prøvens overflade (se også trin 1.3).
  5. Mens billeddannelse med elektronstråle åbne gashanen i et par sekunder. Satsen for cryo-Pt deposition er 100-500 nm / sekund eller mere, afhængig af afstanden af ​​GIS nål, prøve ruhed og brugerens system. Det er tilrådeligt at køre et par test depositioner at bestemme de optimale parametre.
  6. Den rå cryo-Pt deposition er meget ujævn og inhomogen. Cure depositum over ROI ved hjælp af en 1.000 pA ion stråle ved lav forstørrelse (for eksempel 2.000 X). I modsætning til den kryo deposition denne hærdning er site selektiv og bør udføres kun på ROI. Formålet med denne første cryo-deponering er at beskytte overfladen af prøven fra ionstråle skade og reducere curtaining under ion udtynding 13.
  7. Vip prøven til52 °, således at overfladen er vinkelret på ionstråle. Mill væk to rækkehuse skyttegrave på begge sider af ROI. Typiske dimensioner for de render 20-30 um i den retning (X) parallel med lameller, der skal ekstraheres, 10-15 um i lodret retning (Y) og en variabel skrånende dybde (Z), med det dybeste punkt tæt på ROI. Hældningen skal være 45-55 °. I nogle instrumenter kan rækkehuse skyttegrave kun fræses med det dybeste punkt på toppen. I sådanne tilfælde mølle en under ROI, så rotere billedet 180 ° og mølle den anden på den anden side. Dybden af ​​formaling kan vælges, hvis sputter rate af materialet er kendt. For de fleste frosne hydrerede prøve, kan sputter rate af is der anvendes 7.
  8. Vip prøven tilbage til 0 ° og bruge ionstrålen at skære væk siderne og undersiden af ​​lamel, og sørg for skæremærker gå gennem hele lamel (De bør skrive fræsning mærker på rækkehuse skråninger mølleed i det foregående trin). Efterlad kun to små broer, der forbinder lamellen til resten af ​​prøven.
  9. Sæt GIS nål (kan let flytte prøven). Manøvre NM indtil spidsen er i fysisk kontakt med lamel, helst på siden. Sørg for, at NM er ikke obstruerer ionstrålen visning af to små forbinder broer.
    1. Åbn GIS ventil i et par sekunder og overvåge cryo aflejring ved kontinuerlig billeddannelse med elektronstråle.
    2. Når en yderligere 1-2 um lag af Pt har været cryo-deponeret, lukke ventilen.
    3. Cure Pt (se trin 2.6) kun i få um omkring det punkt, hvor NM er i kontakt med lamellerne.
    4. Brug en høj ionstrålestrøm at skære lamellen gratis. De to forbindelsesbroer skal fræses væk, såvel som ethvert overskud af Pt, der kan have dannet nye kontaktpunkter mellem lamellen og resten af ​​prøven. Må ikke trække GIS nål endnu.
    Manøvrere forsigtigt NM at udtrække lamel fra skyttegravene og flytte det mindst 500 um over prøvens overflade. Først efter dette trin, trække GIS nål.
  10. Sænk prøve scenen et par mm og flytte det, indtil en af ​​TEM net er i betragtning. Flyt vedhæftede område på gitteret ind i arbejdsposition og indsætte GIS nål.
    1. Manøvrere forsigtigt NM at bringe vedlagte lamel i fysisk kontakt med den vedhæftede område på TEM-gitter. Der bør ikke være tryk eller spændinger mellem lamellerne, TEM gitter og NM.
    2. Åbn gashanen i et par sekunder, og cryo-deposit en ekstra 1-2 um lag af Pt.
    3. Cure Pt (se trin 2.6) kun i de få mM omkring kontaktpunkt mellem lamellerne og TEM nettet.
  11. Brug en høj ionstrålestrøm at skære lamellen fri af NM. Dette kan opnås ved formaling væk enten NM spids eller den side af prøven. I than første tilfælde vil spidsen skal slibes igen før næste brug, som beskrevet i trin 1.2.
  12. EKSTRA: på dette tidspunkt er det muligt at bruge VTD at tage SEM transfer holderen og gemme det O / N i en Dewar fyldt med flydende nitrogen. Denne overførsel og O / N opbevaring kan forårsage isdannelse på overfladen af ​​lamel hvis iskrystaller allerede er til stede og / eller hvis den flydende nitrogen udsættes for fugtig luft; men en sådan forurening vil blive fjernet af det næste trin i en relativt kort tid. Som de foregående trin kan have taget flere timer at gennemføre, kan det være hensigtsmæssigt at gøre det, da det efter følgende trin sådan opbevaring O / N anbefales ikke, da der ikke ville være nogen måde at fjerne forureningen isen undtagen ved sublimering (som kan ikke udføres, hvis forglasning af prøven skal opretholdes).
  13. Vip prøven til 52 ° og bruge ionstrålen at tynde det til elektron gennemsigtighed 7. Det anbefales at starte med højere, Roughendes strålestrømme at fjerne bulk og fortsæt til fine polering overfladen med lavere stråle strømme, til sidst også at reducere den accelererende spænding. Den endelige tykkelse af lameller skal være 100-200 nm eller mindre for ultrastruktur analyse i et 100-200 kV TEM eller op til 500 nm for tomografi i en 300 kV TEM, afhængigt af prøvens sammensætning. Under udtynding, kan de interne spændinger af prøven forårsage lamel til at krølle eller bøje. I sådanne tilfælde bør region tyndet begrænses. Dette skete for eksempel i figurerne 11 og 12.

4.. Cryo Overførsel til TEM

    1. Skyl cryo-transfer station med tør nitrogengas i et par minutter.
    2. Læg flydende nitrogen til Dewar af TEM AC og kryo-transfer station.
    3. Indsæt cryo-transfer TEM holderen i den relevante holder af cryo-transfer station og fylde sin Dewar så godt. Vent hver component har nået den ønskede temperatur (ca. 15 min.) Hvis det er muligt, bør styringen af ​​cryo-transfer TEM indehaveren af ​​forbindes for at overvåge temperaturen under overførslen. Det er vigtigt at indse, at spidsen af ​​TEM-holderen (hvor temperatursensoren er placeret) vil være i kontakt med cryo-overførselsstation og vil derfor afkøle meget hurtigere end resten af ​​TEM-holderen. Det anbefales derfor, at den nødvendige tid til det hele cryo-transfer TEM indehaveren til at køle ned måles på forhånd, og at systemet får lov til at thermalize mindst at mængden af ​​tid.
    4. Fyld en kryogen kop med flydende nitrogen og nedsænkes i den: TEM prøve fastspændingsværktøjet en skruetrækker og pincetter med henblik på at køle deres tip til den ønskede temperatur. Alt værktøj skal være ordentligt isoleret på den anden ende, så for ikke at forårsage kolde forbrændinger på operatørens hånd.
  1. Match VTD til den ydre luftsluse. Bring kolde hjorte til højde overførsel (16 mm *). Sluk for høj spænding.
    1. Åbn VTD segl, den ydre luftsluse og den indre luftsluse.
    2. Brug VTD stangen for at låse ind i SEM transfer holderen ved at skubbe og dreje med uret.
    3. Træk SEM transfer holderen ind i kryo forberedelse kammer.
    4. Brug kold kniv til at lukke de beskyttende låg af TEM net. Dette er nødvendigt for at reducere eventuel forurening is under overførslen.
    5. Brug VTD stangen til at flytte prøven i vakuum kammer VTD.
    6. Luk luftsluser og segl.
  2. Udluft ydre luftsluse og tag VTD. Match VTD til SEM-porten på cryo-transfer station. Mens skylning med tør nitrogen, skal du bruge pin på stationen for at åbne segl VTD og skub SEM transfer holderen ind i Dewar af cryo-transfer station.
    1. Tilføj nok flydende nitrogen, således at niveauet i cryo-transfer station er høj nokbare at oversvømme prøven.
    2. Brug tidligere afkølede skruetrækker til at åbne en af ​​lågene og løsne den tilsvarende skrue, der holder TEM gitter på plads.
    3. Brug de tidligere afkølede pincet til at plukke TEM nettet og læg det i TEM holderen.
    4. Brug den afkølede hexring at fastgøre TEM gitter på TEM holderen.
    5. Luk lukker af cryo-transfer TEM indehaveren. Skridt Prøven overførsel er afgørende og måske blive hæmmet af kvælstof gas reducere synligheden af ​​de små TEM prøve.
    6. Afbryd cryo-transfer station fra pumpesystemet og transportere det i nærheden af ​​TEM sammen med varmelegeme controller cryo-transfer TEM indehaveren.
    7. Start turbomolekylarpumpe af TEM at pumpe opbakning linje til TEM luftslusen.
    8. Indstil TEM prøve scenen til en vippe * på -70 °.
    9. Sæt den korteste pumpetid til luftslusen (30-60 sek), med kun én cyklus af skylning med tør nitrogengas.
    10. Sørg for, at den beskyttende lukker om cryo-transfer TEM holderen er lukket. Fjern TEM indehaveren fra den cryo-transfer station og indsætte det i vippet goniometer (flydende kvælstof vil smitte ud af TEM holder Dewar). Den pumpecyklus starter. Når cyklussen er afsluttet, indstilles goniometer at vippe tilbage til 0 °, og på samme tid holde TEM holderen, så at den ikke roterer med goniometer. Sæt det helt i TEM. Under dette trin bør cryo-overførsel TEM indehaveren være forbundet til sin varmelegeme controller til at overvåge temperaturen. Proceduren for at indsætte prøve holderen ind i TEM kan variere mellem forskellige systemer. Det anbefales derfor at kontakte TEM producenten for at opnå den korrekte procedure.
    11. Fyld cryo-transfer TEM holder Dewar. Vent til vakuum i TEM at nå et acceptabelt niveau.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Strata DB 235 FEI FIB/SEM
Omniprobe 100 Oxford Instruments Nanomanipulator
Alto 2500 Gatan Cryo preparation chamber
Cryo-holder model 626 Gatan Cryo transfer TEM holder
Tecnai F30 FEI TEM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Echlin, P. Low Temperature Microscopy and Analysis. Plenum Press. New York. (1992).
  2. Rubino, S., et al. A site-specific focused-ion-beam lift-out method for cryo Transmission Electron Microscopy. J. Struct. Biol. 180, 572 (2012).
  3. Studer, D., et al. A new approach for cryofixation by high-pressure freezing. J. Microsc. 203, 285 (2001).
  4. Umrath, W. Cooling bath for rapid freezing in electron microscopy. J. Microsc. 101, 103 (1974).
  5. Walther, P. Recent progress in freeze-fracturing of high-pressure frozen samples. J. Microsc. 212, 34 (2003).
  6. Elder, H. Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography. Cryo fixation. Techniques in Immunocytochemistry. Academic Press. London. (1989).
  7. Giannuzzi, L. A., Stevie, F. A. Introduction to Focused Ion Beams. Springer. New York. (2005).
  8. Marko, M., et al. Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryoelectron microscopy. Nat. Methods. 4, 215 (2007).
  9. Hayles, M. F., et al. The making of frozen-hydrated, vitreous lamellas from cells for cryo-electron microscopy. J. Struct. Biol. 172, 180 (2010).
  10. Rigort, A. Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography. J. Struct. Biol. 109, 4449-44 (2012).
  11. Hsieh, C., et al. Towards high-resolution three-dimensional imaging of native mammalian tissue: electron tomography of frozen-hydrated rat liver sections. J. Struct. Biol. 153, 1 (2006).
  12. McDowall, A. W., et al. Electron microscopy of frozen hydrated sections of vitreous ice and vitrified biological samples. J. Microsc. 131, 1 (1983).
  13. Hayles, M. F., et al. A technique for improved focused ion beam milling of cryo-prepared life science specimens. J. Microsc. 226, 263 (2007).
  14. Pettersson, H., et al. A method for producing site-specific TEM specimens from low contrast materials with nanometer precision. Microsc. Microanal. 19, (1), 73 (2013).
  15. Wätjen, J. T., et al. Cu out-diffusion in kesterites—A transmission electron microscopy specimen preparation artifact. Appl. Phys. Lett. Appl. Phys. Lett, 051902 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics